CN115433181B

CN115433181B - 基于半花菁结构的荧光探针及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115433181B
Application number: CN202211250739.9A
Authority: CN
Inventors: 张迪; 王铁良; 李漫; 刘琳; 郭洁; 魏亮亮; 郭丰启; 魏红; 周晓华; 刘进玺
Original assignee: Institute Of Agricultural Quality Standards And Testing Technology Henan Academy Of Agricultural Sciences; Zhengzhou University
Current assignee: Institute Of Agricultural Quality Standards And Testing Technology Henan Academy Of Agricultural Sciences; Zhengzhou University
Priority date: 2022-10-12
Filing date: 2022-10-12
Publication date: 2024-03-08
Anticipated expiration: 2042-10-12
Also published as: CN115433181A

Abstract

本发明属于分析化学领域，涉及二氧化硫和甲醛的可逆检测，特别是指基于半花菁结构的荧光探针及其制备方法和应用。荧光探针（ZZY）本身在溶液体系中具有较强的荧光，能够与二氧化硫发生特异性的迈克尔加成反应导致荧光淬灭，从而实现对二氧化硫的专一性识别。之后再与甲醛响应后，体系荧光恢复，能够实现两次以上的可逆循环识别，并且能够通过肉眼观测到识别前后荧光的变化。ZZY具有灵敏度高、选择性好、细胞毒性低的优点，对二氧化硫的最低检测限为0.447μM。ZZY含有线粒体定位基团，通过共聚焦显微镜观察到明显的线粒体定位效应，并成功的应用于生物活细胞中二氧化硫和甲醛含量的实时成像研究，具有较好的生物应用价值。

Description

基于半花菁结构的荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于分析化学领域，涉及二氧化硫和甲醛的可逆检测，特别是指基于半花菁结构的荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

二氧化硫(SO₂)是一种危害极大的环境污染物，它以HSO₃ ^-和SO₃ ^2-两种形式存在于水溶液中。流行病学研究表明，过量摄入SO₂可导致呼吸系统、心血管系统和神经系统等方面的严重疾病。此外，SO₂还可以通过代谢含硫氨基酸在线粒体内源性产生。SO₂作为一种气体传输器，参与抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗高血压、调节血液胰岛素和肌肉放松等生理活动。

甲醛(FA)是一种工业毒物，对哺乳动物有致癌作用。然而，人们对生物体内的氨基敏感胺氧化酶(SSAO)或DNA甲基化可产生FA这一事实知之甚少。最近的研究表明，FA与许多严重疾病的发病机制有关，如癌症、阿尔茨海默病、中风、糖尿病。我们还没有明确FA在生命系统中的具体作用。SO₂和FA在空气中会发生反应，产物是二次有机气溶胶的重要组成部分。SO₂的产生和FA的代谢都与生物体内半胱氨酸的浓度密切相关。但是SO₂和FA之间的联系及其在生命系统中的具体作用尚未被深入研究。

SO₂和FA的检测方法已经有很多报道。但大多数检测方法都存在成本高、检测过程复杂、检测结果具有破坏性等缺点。在各种方法中，荧光探针因其方便、灵敏度好、无创、时空分辨率高而成为体内成像的有效工具。截至目前为止，科研人员已经报道了多种用于可逆检测SO₂和FA的荧光探针，常用的荧光染料有香豆素、萘酰亚胺、罗丹明和荧光素等。专利202011263671.9公开了一种可逆检测二氧化硫/甲醛的比率荧光探针、制备方法与应用，该化合物的结构为：，该荧光探针可以分别对二氧化硫或甲醛进行检测；专利201810954170.1公开了一种二氧化硫-甲醛荧光探针及其制备方法和应用，该探针的结构为：/>；该探针可以实现连续检测二氧化硫和甲醛。但是上述两个探针的生物应用较少，未见应用亚细胞器线粒体中可逆识别二氧化硫和甲醛。在生理系统中，如果能够运用荧光探针技术和共聚焦成像技术选择性的研究细胞内二氧化硫和甲醛的相关作用关系，将极大的推动相关疾病的研究与诊疗。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出一种基于半花菁结构的荧光探针及其制备方法和应用，所制备的荧光探针能够灵敏快速的从多种活性小分子中区分出二氧化硫和甲醛，具有选择性专一、抗干扰性强、检出限低等优点。

本发明的技术方案是这样实现的：

基于半花菁结构的荧光探针（ZZY），其结构式如下：

。

上述荧光探针（ZZY）的制备方法，技术路线如下：

其制备步骤为：

（1）将商品化的2-甲基苯并噻唑、碘甲烷和无水乙醇的混合物在回流温度下搅拌15-24h再经冷却后，过滤去除乙醇得到粗产品后用无水氯仿洗涤，沉淀物用氯仿和少量乙醇洗涤，真空干燥得到化合物1；

（2）将3-氨基苯酚、1-溴-3-氯丙烷的混合物在氮气气氛下室温搅拌0.5-1h，混合物在95℃下加热1-3h，然后在140℃下加热20-48h，最后回流20-48h；用薄层色谱(TLC)监测反应的进展；当原料3-氨基苯酚消失时，反应终止。将反应混合物冷却，出现橘红色固体，将碘化氢（HI）缓慢加入到固体中，加热回流一段5-15h。随后，在溶液中加入一定量的水，收集有机相，减压脱除溶剂得到残渣，硅胶柱层析纯化得到白色晶体为化合物2。

（3）将新鲜蒸馏的DMF在N₂气氛下，在室温下滴加到三氯氧化磷（POCl₃）中，搅拌0.5-2h，得到淡黄色溶液，然后将化合物2溶于DMF再加入到黄色溶液中，室温下搅拌0.5-2.5h后，在60℃下再加热0.5-3h，然后将反应混合物缓慢加入冰水中，陈化，所得黄色固体经过滤得到化合物3。

（4）将化合物3与化合物1溶解于乙醇中，滴加一定量哌啶，得混合物；将混合物加热回流4-10h，冷却至室温后，将沉淀物过滤并用乙醇洗涤得到紫色产物即荧光探针（ZZY）。

进一步的，所述步骤（1）中2-甲基苯并噻唑和碘甲烷的摩尔比为1:（6-10）。

进一步的，所述步骤（2）中3-氨基苯酚和1-溴-3-氯丙烷的摩尔比为1:(15-20)，柱层析分离所用洗脱液为石油醚和CH₂Cl₂体积比为(2-6)：1，产率为50%-70%。

进一步的，所述步骤（3）中DMF与POCl₃的体积摩尔比为1mL:1.3mmol；化合物2的DMF溶液的浓度为50mg/mL。

进一步的，所述化合物3、化合物1和哌啶的摩尔比为1:1-5:0.001-0.01。

上述荧光探针，在特异性非疾病诊断为目的的识别二氧化硫和甲醛中的应用。

上述的荧光探针在可逆检测二氧化硫和甲醛中的应用。

上述的荧光探针在可视化检测二氧化硫和甲醛中的应用。

本发明具有以下有益效果：

1、本申请的荧光探针结构新颖，合成方法简单且易分离提纯，能够排除常见活性小分子的干扰，对二氧化硫和甲醛同时具有高度专一的选择性，抗干扰能力强。本发明的探针ZZY对二氧化硫和甲醛的可逆识别可以达到裸眼识别的效果，识别二氧化硫后，探针溶液由原来的紫色变为几乎无色，FA的加入可以使溶液又从无色变为紫色。在365 nm紫外灯下溶液荧光从蓝色变为几乎无色，溶液颜色变化明显，易于分辨，实现了可视化检测（图14）。

2、本申请荧光探针的识别机理（图21）为利用二氧化硫的强亲核性，探针识别二氧化硫后变为结构ZZY-SO₃，荧光强度明显降低，[ZZY-SO₃]^-的理论分子量为443.1105，高分辨测试数据为443.1112（图15）；然后进一步研究了FA对识别产物ZZY-SO₃的荧光恢复机理。加入甲醛后，重新出现了与探针ZZY相关的质子峰（m/z=363.1515）（正离子模式），[ZZY]⁺的理论分子量为363.1526（图16），并且得到一个新的质子峰 (m/z=110.9745)，这与理论计算的[HCHO-HSO₃]^- 的分子量是相符的[M-H]^-=110.9758（图17）。以上数据进一步验证了以下所示的可逆识别机制。

3、本发明的针荧光探针（ZZY）本身在溶液体系中具有较强的荧光，能够与二氧化硫发生特异性的迈克尔加成反应导致荧光淬灭，之后再与甲醛响应后，体系荧光恢复，能够实现两次以上的可逆循环识别，并且能够通过肉眼观测到识别前后荧光的变化。ZZY具有灵敏度高、选择性好、细胞毒性低的优点，对二氧化硫的最低检测限为0.447 μM。ZZY含有线粒体定位基团，通过共聚焦显微镜观察到明显的线粒体定位效应，并成功的应用于生物活细胞中二氧化硫和甲醛含量的实时成像研究，可以应用于生物活细胞中外源性二氧化硫和FA的荧光成像，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些图获得其他的图。

图1为本发明的荧光探针ZZY核磁共振氢谱图（溶剂为DMSO）。

图2为本发明的荧光探针ZZY核磁共振碳谱图（溶剂为DMSO）。

图3为本发明的荧光探针ZZY高分辨质谱图（正离子模式，溶剂为CH₃OH）。

图4为本发明的荧光探针ZZY识别二氧化硫的荧光选择性图，激发波长550 nm，发射波长598 nm。

图5为本发明的荧光探针ZZY识别二氧化硫后的加成产物ZZY-SO₃识别甲醛的荧光选择性图，激发波长550 nm，发射波长598nm。

图6为本发明的荧光探针ZZY识别二氧化硫的荧光抗干扰性图，激发波长550 nm，发射波长598 nm。

图7为本发明的荧光探针ZZY识别二氧化硫后的加成产物ZZY-SO₃识别FA的荧光抗干扰性图，激发波长550nm，发射波长598nm。

图8为本发明的荧光探针ZZY识别二氧化硫的荧光滴定图，激发波长550 nm，发射波长598 nm。

图9为本发明的荧光探针ZZY识别二氧化硫后的加成产物ZZY-SO₃识别FA的荧光滴定图，激发波长550 nm，发射波长598nm。

图10为本发明的荧光探针ZZY识别二氧化硫的最低检出限图，激发波长550 nm，发射波长598 nm。

图11为本发明的荧光探针ZZY识别二氧化硫后的加成产物ZZY-SO₃识别FA的线性相关图，激发波长550 nm，发射波长598nm。

图12为本发明的荧光探针ZZY可逆识别二氧化硫和甲醛的荧光动力学图，激发波长550 nm，发射波长598 nm。

图13为本发明的荧光探针ZZY可逆识别二氧化硫和甲醛的pH适用范围图，激发波长550 nm，发射波长598 nm。

图14为本发明的荧光探针ZZY识别二氧化硫前后的溶液颜色变化图。

图15为本发明的荧光探针ZZY识别二氧化硫后的机理验证高分辨质谱图（正离子模式，溶剂为CH₃OH）。

图16为本发明的荧光探针ZZY识别二氧化硫后又与甲醛反应的机理验证高分辨质谱图。

图17为本发明的荧光探针ZZY识别二氧化硫后又与甲醛反应的机理验证高分辨质谱图。

图18为本发明的荧光探针不同浓度（0 μM, 3 μM, 5 μM, 10 μM, 15 μM, 30 μM）的细胞毒性试验图（CCK-8，12小时）。

图19为本发明的荧光探针ZZY在生物活细胞中对外源性二氧化硫和甲醛进行可逆荧光成像图。

图20为本发明的荧光探针ZZY在生物活细胞中的线粒体定位荧光成像图。

图21为本发明荧光探针ZZY识别二氧化硫和甲醛的机理图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本申请中的原料均为商品级。

实施例1

本实施例的荧光探针的制备方法，步骤如下：

（1）化合物1的制备

将2-甲基苯并噻唑(0.25 g, 1.68 mmol)、碘甲烷(0.63 mL, 10.08 mmol)和无水乙醇(10 mL)的混合物在回流温度下搅拌15 h。冷却后，在无水乙醇和氯仿振荡吸滤上干燥混合物。沉淀物用氯仿和少量乙醇洗涤，真空干燥得到化合物1；

（2）化合物2的制备

将3-氨基苯酚(1.30 g, 10.0 mmol)、1-溴-3-氯丙烷(23.50 g, 150.0 mmol)的混合物在氮气气氛下室温搅拌0.5 h。混合物在95℃下加热1小时，然后在140℃下加热23小时，最后回流21小时。用薄层色谱(TLC)监测反应的进展。当原料3-氨基苯酚消失时，反应终止。将反应混合物冷却到80℃，出现橘红色固体。将7 mL HI缓慢加入到固体中，加热回流6小时。随后，在溶液中加入水(20 mL)，收集有机相。减压脱除溶剂得到残渣，硅胶柱层析纯化(石油醚:CH₂Cl₂ = 2:1)得到化合物2为白色晶体(1.32 g，产率70.1%)。

（3）化合物3的制备

将新鲜蒸馏的DMF (2.0 mL)在N₂气氛下，在室温下滴加到POCl₃ (2.0 mL)中，搅拌30分钟，得到淡黄色溶液。然后将化合物2 (500.0 mg, 2.6 mmol，溶于10 mL DMF)作为一份加入到该溶液中。在室温下搅拌30分钟后，在60℃下再加热30分钟。然后将反应混合物缓慢加入冰水(100 ml)中，陈化2小时。所得黄色固体经过滤得到化合物3。

（4）探针ZZY的制备

将化合物3（434.6mg， 2mmol）与化合物1(582 mg，2 mmol)溶解于30 mL乙醇中，再滴加250μL（0.0025mmol）哌啶。将混合物加热回流4 h。冷却至室温后，将沉淀物过滤并用乙醇洗涤得到紫色产物ZZY (290.0 mg，产率为59.1%)。

核磁共振测定：¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ (ppm): 7.92 (t, J = 12 Hz, 2H), 7.68 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7.53 (t, J = 8 Hz, 1H), 7.38 (t, J = 6 Hz, 1 H),7.26 (s, 1 H), 7.04 (d, J = 12 Hz, 1 H), 3.86 (s, 3 H), 3.45 (q, J = 6.67 Hz,1 H), 3.26 (s, 4 H), 2.59 (s, 2 H), 2.51 (s, 2 H), 1.81 (s, 4 H), 1.06 (t, J= 6 Hz, 1 H); ¹³C NMR (400 Hz, DMSO) δ (ppm): 166.22, 150.05, 143.61, 142.53,128.31, 126.92, 125.49, 123.33, 117.39, 115.53, 113.83, 106.45, 99.98, 98.45,56.48, 50.25, 49.78, 34.20, 27.53, 22.03, 21.15, 20.87, 19.03. 核磁共振氢谱图如图1所示，核磁共振碳谱图如图2所示。

高分辨质谱测定：HR-ESI-MS m/z: calcd for C₂₂H₂₃N₂OS⁺363.1526, found363.1520。高分辨质谱图如图3所示。

实施例2

本实施例的荧光探针的制备方法，步骤如下：

（1）化合物1的制备

将2-甲基苯并噻唑(0.25 g, 1.68 mmol)、碘甲烷(0.84 mL, 13.44 mmol)和无水乙醇(10 mL)的混合物在回流温度下搅拌20 h。冷却后，在无水乙醇和氯仿振荡吸滤上干燥混合物。沉淀物用氯仿和少量乙醇洗涤，真空干燥得到化合物1；

（2）化合物2的制备

将3-氨基苯酚(1.30 g, 10.0 mmol)、1-溴-3-氯丙烷(28.2 g, 180.0 mmol)的混合物在氮气气氛下室温搅拌1 h。混合物在95℃下加热1.5小时，然后在140℃下加热30小时，最后回流25小时。用薄层色谱(TLC)监测反应的进展。当原料3-氨基苯酚消失时，反应终止。将反应混合物冷却到80℃，出现橘红色固体。将7 mL HI缓慢加入到固体中，加热回流8小时。随后，在溶液中加入水(20 mL)，收集有机相。减压脱除溶剂得到残渣，硅胶柱层析纯化(石油醚:CH₂Cl₂ = 3:1)得到化合物2为白色晶体(1.13 g，产率60%)。

（3）化合物3的制备

将新鲜蒸馏的DMF (2.0 mL)在N₂气氛下，在室温下滴加到POCl₃ (2.0 mL)中，搅拌1小时，得到淡黄色溶液。然后将化合物3 (500.0 mg, 2.6 mmol，溶于10 mL DMF)作为一份加入到该溶液中。在室温下搅拌50分钟后，在60℃下再加热40分钟。然后将反应混合物缓慢加入冰水(100 ml)中，陈化3小时。所得黄色固体经过滤得到化合物3。

（4）探针ZZY的制备

将化合物3（434.6mg， 2mmol）与化合物1(1.746g，6mmol)溶解于30 mL乙醇中，滴加0.002mmol哌啶。将混合物加热回流6h。冷却至室温后，将沉淀物过滤并用乙醇洗涤得到紫色产物ZZY (241.7 mg，产率为50%)。

实施例3

本实施例的荧光探针的制备方法，步骤如下：

（1）化合物1的制备

将2-甲基苯并噻唑(0.25 g, 1.68 mmol)、碘甲烷(1.05 mL, 16.8 mmol)和无水乙醇(10 mL)的混合物在回流温度下搅拌18 h。冷却后，在无水乙醇和氯仿振荡吸滤上干燥混合物。沉淀物用氯仿和少量乙醇洗涤，真空干燥得到化合物1；

（2）化合物2的制备

将3-氨基苯酚(1.30 g, 10.0 mmol)、1-溴-3-氯丙烷(26.6 g, 170.0 mmol)的混合物在氮气气氛下室温搅拌1 h。混合物在95℃下加热2小时，然后在140℃下加热26小时，最后回流30小时。用薄层色谱(TLC)监测反应的进展。当原料3-氨基苯酚消失时，反应终止。将反应混合物冷却到80℃，出现橘红色固体。将7 mL HI缓慢加入到固体中，加热回流10小时。随后，在溶液中加入水(20 mL)，收集有机相。减压脱除溶剂得到残渣，硅胶柱层析纯化(石油醚:CH₂Cl₂ = 5:1)得到化合物2为白色晶体(0.943 g，产率50%)。

（3）化合物3的制备

将新鲜蒸馏的DMF (2.0 mL)在N₂气氛下，在室温下滴加到POCl₃ (2.0 mL)中，搅拌1.5小时，得到淡黄色溶液。然后将化合物3 (500.0 mg, 2.6 mmol，溶于10 mL DMF)作为一份加入到该溶液中。在室温下搅拌1.5小时后，在60℃下再加热2.5小时。然后将反应混合物缓慢加入冰水(100 ml)中，陈化3小时。所得黄色固体经过滤得到化合物3。

（4）探针ZZY的制备

探针由化合物2（434.6mg， 2mmol）与化合物1(2.910 g，10 mmol)，溶解于30 mL乙醇中，滴加0.01mmol哌啶。将混合物加热回流8 h。冷却至室温后，将沉淀物过滤并用乙醇洗涤得到紫色产物ZZY (338.3 mg，产率为70%)。

实施效果例

1 mM的探针溶液配制：准确称量实施例1制备的探针(ZZY)，ZZY溶解在二甲基亚砜（DMSO）溶液中配制1 mM的溶液备用。

一、荧光选择性实验：

专一的选择性是衡量荧光探针分子是否高效的重要标准。运用荧光光谱仪考察不同激发条件下，探针ZZY对二氧化硫和甲醛的可逆荧光选择性。如图4所示，在550 nm处激发条件下，单独的探针ZZY(10 μM)在Tris-HCl（10 mM, pH = 7.40）测试溶液中在598 nm处具有较强的荧光发射强度，当加入亚硫酸钠 (10 eq.)后，在598 nm处的荧光发射强度明显降低，但是加入10当量的其它物质（常见小分子：S^2-, HS^-, SO₄ ^2-, S₂O₃ ^2-, AcO^-, HSO₃ ^-,SO₃ ^2-, HCO₃ ^-, CO₃ ^2-, F^-, Cl^-, Br^-, I^-, O₂ ^-, NO, H₂O₂, NO₂ ^-, NO₃ ^-, H₂PO₄ ^-, Hcy, Cys,GSH）后，溶液体系的荧光发射强度（F598）强度与单独探针体系的荧光发射（F598）强度相比没有明显变化。以上实验结果表明，在550 nm激发条件下，该探针对二氧化硫具有较好的荧光专一选择性。

然后考察了探针ZZY识别二氧化硫后生成的产物ZZY-SO3对甲醛的选择性。如图5加入不同的分析物(S^2-, HS^-, SO₄ ^2-, S₂O₃ ^2-, AcO^-, HSO₃ ^-, SO₃ ^2-, HCO₃ ^-, CO₃ ^2-, F^-, Cl^-,Br^-, I^-, O₂ ^-, NO, H₂O₂, NO₂ ^-, NO₃ ^-, H₂PO₄ ^-, Hcy, Cys, GSH, FA)处理ZZY-SO3后，只有FA的存在可以显著提高598 nm处的荧光强度。上述实验表明，ZZY探针可以特异性地检测SO₂，也可以被FA回收。

二、荧光干扰性实验：

为了测试探针ZZY对二氧化硫识别的抗干扰能力，在荧光发射光谱中测试了其抗常见活性小分子干扰性。如图5所示，在550 nm处激发条件下，在单独的探针ZZY(10 μM) 在Tris-HCl（10 mM, pH = 7.40）测试溶液中分别加入测试的10当量的各种常见活性小分子（S^2-, HS^-, SO₄ ^2-, S₂O₃ ^2-, AcO^-, HSO₃ ^-, SO₃ ^2-, HCO₃ ^-, CO₃ ^2-, F^-, Cl^-, Br^-, I^-, O₂ ^-, NO,H₂O₂, NO₂ ^-, NO₃ ^-, H₂PO₄ ^-, Hcy, Cys, GSH），分别测试其荧光发射强度（598 nm），然后再向上述溶液中分别加入10当量的亚硫酸钠溶液，由图6可知，在常见活性小分子存在时加入二氧化硫与单独加入二氧化硫时所得到的荧光强度(598 nm)基本相同，该结果表明探针ZZY对二氧化硫的检测具有较强的抗常见活性小分子干扰性能力。

此外，由图7可知ZZY-SO3还能在其他醛类（对羟基苯甲醛，4-溴苯甲醛，对茴香醛，水杨醛，乙醛，苯甲醛）的存在下检测FA，这说明ZZY-SO3对甲醛的检测具有较强的抗常见活性小分子干扰性能力。

三、最低检出限实验：

良好的检测限是检验一个探针分子是否具有应用价值的标准之一。采用荧光光谱仪来测定探针ZZY对二氧化硫的最低检出限，在Tris-HCl（10 mM, pH = 7.40）测试溶液中，固定探针ZZY浓度为10 µM，在550 nm处激发条件下，测定其对不同浓度的亚硫酸钠的响应强度，随着亚硫酸钠浓度的增加，体系荧光强度不断降低（图8），研究发现溶液荧光强度（598 nm）值在亚硫酸钠浓度为0-75 µM间呈线性（R² = 0.999），根据IUPAC规则，经计算(3σ/k)得出该探针分子对二氧化硫的最低检出限为0.447 μM（图10）。该测试结果表明探针ZZY对二氧化硫的检测具有较高的实用价值。

同时我们也用荧光滴定法研究了探针的可逆识别性能，当在含有ZZY (10 μM)和Na₂SO₃ (100 μM)的溶液中连续添加FA (0 ~ 320 μM)时，598 nm处的发射信号随着FA的增加逐渐增强，当添加320 μM FA时达到饱和，发射信号几乎与单独的探针一样(图9)。FA(140 ~ 220 μM)浓度(R²=0.994)与598 nm处的发射强度呈良好的线性关系(图11)。结果表明，ZZY可实现对二氧化硫和甲醛的可逆、灵敏识别。

四、动力学实验：

良好的识别速度是考察探针的重要指标之一。采用荧光光谱仪考察了探针ZZY对二氧化硫的动力学实验。在Tris-HCl（10 mM, pH = 7.40）测试溶液中，固定探针ZZY浓度为10 µM，在550 nm处激发条件下，测定单独探针和探针加二氧化硫的荧光发射（598 nm）随时间的变化。如图12所示，单独探针随时间的增长荧光强度并未有太大的波动；当加入10当量亚硫酸钠后，溶液体系荧光发射强度瞬间降低，并在40分钟时达到响应平台。此外，在含有Na₂SO₃（100 μM）的探针（10 μM）溶液中加入FA (320 μM)后，598 nm处发射信号随时间增加而增加，并在70 min内稳定。以上结果表明，探针对二氧化硫和甲醛的可逆识别响应快速灵敏，达到了实时检测的效果。

五、酸碱度（pH）对探针识别能力的影响：

为了测试探针可以在不同的酸碱度（pH）条件下识别二氧化硫，考察了其在不同酸碱度（pH）对其识别二氧化硫的影响（图13）。分别配制pH为4.3，5.3，6.3，7.3，8.3，9.3 的Tris-HCl（10 mM）缓冲溶液。在Tris-HCl缓冲溶液体系中，改变缓冲体系的pH值（4.3-9.3），单独探针(10 μM)的荧光发射（598 nm）在4.3-7.3的范围内比较稳定，但是在二氧化硫（浓度为100 μM）存在的条件下，体系荧光发射强度（598 nm）在pH为4.3-7.3间具有较明显的降低。实验还表明，加入FA（320 μM）后，在4.3-7.3的pH范围内，598 nm处的荧光强度明显恢复。该结果表明探针可以应用于生理条件下可逆识别二氧化硫和甲醛。

六、探针ZZY对细胞的毒性测试实验：

为了探索本发明探针的生物应用可行性，采用Cell Counting Kit-8 细胞计数试剂（CCK-8试剂盒）考察了本发明探针对人肾透明细胞癌皮肤转移细胞（Caki-1）的细胞毒性。配置不同浓度（0 μM, 3 μM, 5 μM, 10 μM, 15 μM, 30 μM）的探针ZZY溶液，采用CCK-8试剂盒考察孵育12小时后对细胞的毒性，吸光度结果显示细胞的存活度都在73%以上，表明该探针的细胞毒性较小，具有较好的生物相容性（图18）。

七、探针ZZY对细胞外源性二氧化硫和甲醛的可逆荧光成像应用：

将本发明探针ZZY应用于A498细胞（人肾癌细胞）中，对外源性的二氧化硫和甲醛进行可逆荧光成像（图19），具体步骤如下：

a) 将5 µM探针ZZY溶液加入到育有A498细胞的培养液（1 mL）中，在二氧化碳培养箱中培养30 min，用PBS缓冲溶液洗涤2次，明场成像，如图（A2），可以看到细胞大致的轮廓；

b) 将步骤a)中细胞用红光通道成像，得到具有强烈红色荧光的图（A1）；图A3为图A1和图A2的融合图，可以看出单独探针具有强烈的荧光。

c) 将5 µM探针ZZY溶液加入到育有A498细胞的培养液（1 mL）中，在二氧化碳培养箱中培养30 min，加入50 µM的亚硫酸钠溶液后，在二氧化碳培养箱中培养30 min，用PBS缓冲溶液洗涤2次，明场成像，如图（B2），可以看到细胞大致的轮廓；

d) 将步骤c)中细胞用红光通道成像，得到具有微弱红色荧光的图（B1）；图B3为图B1和图B2的融合图，可以看出探针识别二氧化硫后红色荧光明显衰弱。

e) 将5 µM探针ZZY溶液加入到育有A498细胞的培养液（1 mL）中，在二氧化碳培养箱中培养30 min，加入50 µM的二氧化硫溶液后，在二氧化碳培养箱中培养30 min，再加入160 μM甲醛在二氧化碳培养箱中培养40min，用PBS缓冲溶液洗涤2次，明场成像，如图（C2），可以看到细胞大致的轮廓；

f) 将步骤e)中细胞用红光通道成像，得到具有较强红色荧光的图（C1）；图C3为图C1和图C2的融合图，可以看出加入甲醛后红色荧光明显恢复。细胞实验表明，新探针ZZY能够在活细胞中实现二氧化硫和甲醛的可逆识别。

八、探针ZZY共定位实验：

为了进一步研究本发明探针ZZY是否可以靶向聚集到线粒体中，在A498细胞中进行线粒体共定位实验（图20）。

a) 将5 µM探针ZZY溶液加入到育有A498细胞的培养液（1 mL）中，在二氧化碳培养箱中培养30 min，然后加入5 µM Mito Tracker Green FM继续培养30 min，用PBS缓冲溶液洗涤2次，明场成像，如图（D），可以看到细胞大致的轮廓；

b) 将步骤a)中细胞用绿光通道成像，得到具有强烈绿色荧光的图（A）；

c) 将步骤a)中细胞用红光通道成像，得到具有强烈绿色荧光的图（B）；图C为图A和图B的融合图；图E是本发明探针ZZY与商品化线粒体定位探针的相关剖面图；

根据图19所示，单独探针孵育在细胞中，没有加入外源性亚硫酸钠溶液的细胞在红光通道下有较强荧光发射。同样条件下，另一份在加入亚硫酸钠溶液后，在红色通道可以观察到荧光明显衰弱，加入甲醛后可以观察到红色通道下荧光的恢复。根据图20所示，本发明探针ZZY与MitoTracker Green FM具有良好的重合性，重叠系数为0.9390，皮尔逊系数为0.8060。这说明本发明探针ZZY可以靶向线粒对细胞中外源性的二氧化硫和甲醛进行可逆荧光成像。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.基于半花菁结构的荧光探针在非疾病诊断和治疗为目的的可逆检测二氧化硫和甲醛中的应用，其特征在于：所述荧光探针的结构式如下：

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2.基于半花菁结构的荧光探针在非疾病诊断和治疗为目的的可视化检测二氧化硫和甲醛中的应用，其特征在于：所述荧光探针的结构式如下：

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