CN113121520B - 一种具有aie+esipt+ict机制的荧光染料和荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有AIE+ESIPT+ICT机制的荧光染料和荧光探针及其制备方法与应用，其中荧光染料如式Ⅰ所示，荧光探针如式Ⅲ所示；
Figure DDA0003024224900000011
本发明具有AIE+ESIPT+ICT机制的荧光染料的制备方法简单，原料便宜易得，合成工艺简单，产率高，适合规模化生产以及推广运用。本荧光探针由于具有聚集诱导发光(AIE)效应，可有效避免自吸收与生物背景荧光的干扰，可避免由于探针使用浓度、探针分布不均等导致的误差。本发明由于荧光染料母核激发态分子内质子转移(ESIPT)和分子内电荷转移(ICT)效应的的存在，表现为双发射波长，大的Stokes位移，有效提高荧光分子探针的灵敏度。本荧光染料构建比率比色检测CO的荧光分子探针，在实际检测中，CO荧光分子探针响应快速，检测范围宽，灵敏度高。

Description

一种具有AIE+ESIPT+ICT机制的荧光染料和荧光探针及其制 备方法与应用
技术领域
本发明属于有机合成与分析检测技术领域，具体涉及一种具有 AIE+ESIPT+ICT机制的荧光染料和荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
一氧化碳(CO)是由于煤、石油、汽车尾气等含碳物质不完全燃烧产生的一种无色、无味、无刺激性的有毒气体。在生理学上，CO因为其对血红蛋白有着强烈的亲和力，可以引起急性或慢性的健康危害。一直以来，CO被人们认为是一种有毒气体。然而，研究也表明CO在人的生理病理条件下发挥极其重要的作用，与NO、H2S并称为人体中的三大气体信号分子。并且，研究发现CO在血管舒张、抗凋亡、抗炎、防止癌细胞扩散和神经递质地传递方面都起到重要作用。亚铁血红素氧合酶(HO)在氧化亚铁血红素的过程中会产生CO，这是内源性CO的主要产生途径。此外，CO代谢异常，与多种疾病相关如阿尔茨海默氏病、炎症、高血压、心力衰竭等。在生物系统中CO作为气体信号分子的作用仍然还有很多方面需要探究，在复杂的生物系统中敏感选择性的追踪CO的技术也非常重要。因此，开发高效的新方法检测一氧化碳具有重要的研究价值和应用前景。
有机小分子荧光探针作为一种生物传感技术，具有高灵敏度、低成本、使用方便等优点，还能够实现在生命体中实时可视化的检测。因此，荧光检测技术已发展成为各种检测技术中最为便捷的方法之一。例如申请号 201710831545.0“一种连续识别钯离子、CO的荧光探针及应用”中报道了一种应用AIE机理在水相/有机相中荧光增强的菲并-咪唑类荧光探针实现对钯离子、 CO的连续响应识别。更重要的是，通过与荧光分子探针的共孵育，荧光分子探测技术能够实现对细胞内CO变化的实时原位无损监测。如专利 201610069351.7“一种检测细胞内CO的荧光探针及其制备方法和应用”中报道了提供了一种检测细胞内的BODIPY类荧光探针，该探针具有较高的光化学稳定性，能够实现对活细胞内CO荧光“OFF”到“ON”的检测识别。以上两种探针的荧光响应都是Turn-on型，只具有单一波长信号。而荧光比率法是通过测量两个不同波长处荧光强度的比值测定分析物的一种方法。由于所测得的荧光比值信号能够极大地降低光源强度波动和仪器稳定性变化的影响，且能够很大程度上减少由于试剂使用浓度或分布不匀而引起的误差，从而赋予该方法更高的灵敏度和准确度，因此比率荧光探针的构建引起研究者的广泛关注。具有 AIE+ESIPT+ICT性质的荧光团，且能够实现环境中和活细胞内CO的比率比色响应识别的荧光探针尚未见文献报道。因此，赋予一个荧光染料多机制识别功能，并能实现对分析物多响应识别非常具有重要的科学价值和良好应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供了一种具有AIE+ESIPT+ICT机制的荧光染料和荧光探针及其制备方法与应用，本发明中的合成方法简单、产物提纯分离过程容易，且获得的荧光探针能够实现对环境中和活细胞内CO的比率比色响应，灵敏度好，专一性强。
本发明新型荧光染料，其结构式通式如式Ⅰ所示：
Figure BDA0003024224880000021
其中：R1为氟、氯、溴、碘、烷基、烷氧基、胺基、二甲氨基中的一种； R2为氟、氯、溴、碘、氢中的一种，R3为胺基、羟基或氢。
优选的，所述的具有AIE+ESIPT+ICT机制的荧光染料，其结构式为Ⅱ-A～C 中的一种：
Figure BDA0003024224880000022
本发明这种具有AIE+ESIPT+ICT机制的荧光染料的制备方法，包括以下步骤：
(1)向圆底烧瓶中加入化合物1和溶剂，室温搅拌条件下向反应溶液中依次加入化合物2和化合物3，接着在设定温度和搅拌条件下进行反应，待反应完毕将反应液倾入水中，析出大量黄灰色固体沉淀，调节溶液pH至6～7，溶液进行抽滤，滤渣经洗涤干燥纯化后，得到化合物4，其合成路线如下：
Figure BDA0003024224880000031
(2)向圆底烧瓶中加入步骤(1)制备的化合物4、化合物5(多聚甲醛) 和溶剂，氮气保护、无水条件下移至设定温度下进行反应，回流；待反应完毕后将反应液倾入水中，调节溶液pH至6～7后析出大量黄色固体沉淀，反应液进行抽滤，滤渣经洗涤干燥后，柱层析分离，得到化合物6，其合成路线如下：
Figure BDA0003024224880000032
(3)圆底烧瓶中加入步骤(2)制备的化合物6、化合物7和溶剂，氮气保护，加热回流反应；待反应完毕后将反应液吸出旋干，柱层析分离，得到式I 的所示的新型荧光染料；其合成路线如下：
Figure BDA0003024224880000041
所述步骤(1)中，溶剂为冰醋酸、二氯甲烷、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜中的一种或多种，化合物1与溶剂的摩尔体积比为(1～3):10mmol/mL；化合物1、化合物2和化合物3的投料摩尔比为1:(1～1.5):(1～1.5)；设定温度为 110～120℃，回流反应时间为2～12h；纯化过程为：抽滤，饱和氯化钠水溶液洗涤，环己烷重结晶。
所述步骤(2)中，溶剂为吡啶、哌啶、吗啉、甲醇、二氯甲烷、乙醇、乙腈、四氢呋喃、甲苯中的一种或多种，化合物4与溶剂的摩尔体积比为(1～4):10 mmol/mL；化合物4与化合物5的投料摩尔质量比为5mmol:(0.5～5)g，化合物5 中，n介于10～100之间；反应的设定温度为75～85℃，反应时间为2～24h；纯化过程为：柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝5/1,v/v)。
所述步骤(3)中，溶剂为甲醇，二氯甲烷，乙腈、四氢呋喃、氯仿中的一种或多种；化合物6与溶剂的摩尔体积比为(0.5～1.5):15mmol/mL；化合物6与化合物7的投料摩尔比为(1～1.5):(1.5～2.5)；加热回流反应的温度为25～75℃，反应时间为2～24h；纯化过程为：柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝5/1,v/v)。
一种比率比色型检测CO的荧光分子探针，其结构式如式Ⅲ所示：
Figure BDA0003024224880000042
其中：R4为烯丙基。
一种根据式II-A所示的具有AIE+ESIPT+ICT机制的荧光染料制备比率比色型检测CO的荧光分子探针的方法，包括以下步骤：
向圆底烧瓶中加入式II-A所示的具有AIE+ESIPT+ICT机制的荧光染料与溶剂，氮气保护、冰水浴条件下化合物8(烯丙基溴)，滴加完毕后，在冰水浴下搅拌一段时间，然后再移至设定温度下进行反应，待反应完毕后将反应液倾入水中，调节溶液pH至6～7后析出固体沉淀，反应液进行抽滤，滤渣经洗涤干燥纯化后，柱层析分离，得到式III结构所示的荧光分子探针；
其合成路线如下：
Figure BDA0003024224880000051
所述的溶剂为甲醇，N,N-二甲基甲酰胺，二氯甲烷，乙腈、四氢呋喃、氯仿中的一种或多种；式II-A荧光染料与溶剂的摩尔体积比为(0.5～1.5):10 mmol/mL；式II-A荧光染料与化合物8的投料摩尔比为(1～1.5):(1.5～3.0)；加热回流反应的温度为20～60℃，反应时间为2～24h；纯化过程为：柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝5/1,v/v)。
所述的比率比色型检测CO的荧光分子探针在检测CO中的应用。
一种荧光分子探针试剂盒，其中包括比率比色型检测CO的荧光分子探针。
本发明AIE+ESIPT+ICT荧光染料工作原理如下：
Figure BDA0003024224880000052
本发明的有益效果：本发明提供的具有AIE+ESIPT+ICT三机制的荧光染料的制备方法简单，原料便宜易得，合成工艺简单，产率高，适合规模化生产以及推广运用。本荧光探针由于具有聚集诱导发光(AIE)效应，可有效避免自吸收与生物背景荧光的干扰，也可避免由于探针使用浓度、探针分布不均等导致的误差。而且，又由于荧光染料母核激发态分子内质子转移(ESIPT)和分子内电荷转移(ICT)效应的的存在，表现为双发射波长，大的Stokes位移，可有效提高荧光分子探针的灵敏度。
基于此，由本荧光染料构建比率比色检测CO的荧光分子探针，在实际检测中，CO荧光分子探针响应快速，检测范围宽，灵敏度高，对于样本中常见的共存物质具有高抗干扰性。本发明的探针在环境样本、细胞组织、生物样本等多种场景中的CO检测方面具有广阔的应用前景。
附图说明
图1实施例1中荧光染料II-A的化学合成路线。
图2实施例1中荧光染料II-B的化学合成路线。
图3实施例1中荧光染料II-C的化学合成路线图。
图4实施例2中检测CO的荧光探针III的化学合成路线。
图5实施例3中荧光染料II-A在不同极性溶剂(ICT验证)的光谱图。
图6实施例4中荧光染料II-A在不同极性质子和非质子溶剂(ESIPT验证)的光谱图。
图7实施例5中荧光染料II-A AIE效应光谱图。
图8实施例6中荧光探针III的CO比色和光谱响应图。
图9实施例6中荧光探针III的荧光强度比值-CO浓度变化曲线。
图10实施例6中荧光探针III的选择性和抗干扰性考察结果。
图11实施例6中荧光探针III对空气中CO可视化响应图。
图12实施例6中荧光探针III的细胞活力测试图。
图13实施例6中荧光探针III对细胞外源性CO的成像响应图。
图14实施例6中荧光探针III对细胞内源性CO的成像响应图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
实施例1
荧光染料的合成
本实施例制备的荧光染料结构式中的R1＝OCH3或O(CH2)5CH3，R2＝H，R3＝OH 或H。
II-A合成方法
本实施例的II-A合成技术路线如图1所示，具体包括以下步骤：
1)化合物4的合成
称取化合物1茴香偶酰(2.70g，10mmol)置于250mL圆底烧瓶中，加入 40mL乙酸，溶解后室温搅拌下滴入化合物2对羟基苯甲醛(1.22g，10mmol) 和化合物3苯胺(0.93g，10mmol)，120℃搅拌5h，在反应过程中，反应溶液逐渐由灰色浊液变为淡黄色澄清液体；TLC监测反应进程，原料暗点斑逐渐减少，出现相对极性更小的绿色荧光点。待反应完毕后，将反应液倾入200mL水中，析出黄灰色沉淀，使用浓度为1M氢氧化钠溶液调节体系至中性后，大量淡黄色色固体沉淀析出，减压抽滤得到淡黄色固体，并用饱和氯化钠水溶液洗涤3次，置于45℃烘箱中烘干，复溶于二氯甲烷后使用环己烷重结晶得到4.09 g淡黄色固体粉末化合物4，产率91.5％。
2)化合物5的合成
称取化合物4(4.25g，5mmol)置于250mL双颈圆底烧瓶中，加入无水四氢呋喃(50mL)，将反应体系抽真空并用氮气置换三次，常温下搅拌，直至固体完全溶解。然后在氮气保护下添加无水三乙胺(2.1毫升，15mmol)的溶液在室温下搅拌10分钟。之后，在氮气保护下分别向烧瓶中加入无水氯化镁 (1.45g,15mmol)和多聚甲醛(0.75g)，室温搅拌30分钟后将反应烧瓶放入 69°油浴锅中，反应过夜。在反应过程中可以看到有黄色固体析出。TLC监测反应进程，反应结束后，烧瓶冷却至室温，用1M HCl(3×50mL)和H2O(2×50 mL)分别洗涤，再用乙酸乙酯(3×100mL)提取。收集有机层，使用无水MgSO4干燥，减压过滤浓缩。用乙酸乙酯/石油醚(1:2，v/v)为洗脱剂进行硅胶柱层析纯化，得到化合物5为油性物质(4.19g，产率88.7％)。
3)荧光染料II-A的合成
称取化合物5(4.77，10mmol)和2-氨基苯硫醇(1.09g,10mmol)于250 mL圆底烧瓶中，加入50mL二氯甲烷/甲醇(体积比3:5)的混合溶剂溶解。混合物在室温下搅拌，约10min后逐渐生成黄绿色沉淀。之后，混合物再搅拌2 小时，待反应完毕后将反应液过滤，收集固体，用冷CH3OH洗多次，固体干燥后柱层析分离纯化，得到金黄色固体(4.71g，产率80.5％)，即为该例的荧光染料II。
II-B合成方法
本实施例的II-B合成技术路线如图2所示，具体包括以下步骤：
1)化合物4’的合成
称取化合物1(R1＝OCH3，茴香偶酰，2.70g，10mmol)置于250mL圆底烧瓶中，加入40mL乙酸，溶解后室温搅拌下滴入化合物2’(R3＝H，苯甲醛， 1.06g，10mmol)和化合物3苯胺(0.93g，10mmol)，120℃搅拌5h，在反应过程中，反应溶液逐渐由灰色浊液变为淡黄色澄清液体；TLC监测反应进程，原料暗点斑逐渐减少，出现相对极性更小的绿色荧光点。待反应完毕后，将反应液倾入200mL水中，析出黄灰色沉淀，使用浓度为1M氢氧化钠溶液调节体系至中性后，大量淡黄色色固体沉淀析出，减压抽滤得到淡黄色固体，并用饱和氯化钠水溶液洗涤3次，置于45℃烘箱中烘干，复溶于二氯甲烷后使用环己烷重结晶得到4.09g淡黄色固体粉末化合物4’，产率分别90.7％。
2)化合物5’的合成
称取化合物4’(5mmol)置于250mL双颈圆底烧瓶中，加入无水四氢呋喃 (50mL)，将反应体系抽真空并用氮气置换三次，常温下搅拌，直至固体完全溶解。然后在氮气保护下添加无水三乙胺(2.1毫升，15mmol)的溶液在室温下搅拌10分钟。之后，在氮气保护下分别向烧瓶中加入无水氯化镁(1.45g,15 mmol)和多聚甲醛(0.75g)，室温搅拌30分钟后将反应烧瓶放入69°油浴锅中，反应过夜。在反应过程中可以看到有黄色固体析出。TLC监测反应进程，反应结束后，烧瓶冷却至室温，用1M HCl(3×50mL)和H2O(2×50mL)分别洗涤，再用乙酸乙酯(3×100mL)提取。收集有机层，使用无水MgSO4干燥，减压过滤浓缩。用乙酸乙酯/石油醚(1:2，v/v)为洗脱剂进行硅胶柱层析纯化，得到化合物5’为油性物质(4.19g，产率87.7％)。
2)荧光染料II-B的合成
称取化合物5’和2-氨基苯硫醇(1.09g,10mmol)于250mL圆底烧瓶中，加入50mL二氯甲烷/甲醇(体积比3:5)的混合溶剂溶解。混合物在室温下搅拌，约10min后逐渐生成黄绿色沉淀。之后，混合物再搅拌2小时，待反应完毕后将反应液过滤，收集固体，用冷CH3OH洗多次，固体干燥后柱层析分离纯化，分别得到金黄色固体4.71g(产率80.5％)，即为该例的荧光染料II-B。
II-C合成方法
本实施例的II-C合成技术路线如图3所示，具体包括以下步骤：
1)化合物4”的合成
称取化合物1’(R1＝O(CH2)5CH3，双己烷氧基取代苯偶酰，3.80g，10mmol) 置于250mL圆底烧瓶中，加入40mL乙酸，溶解后室温搅拌下滴入化合物2对羟基苯甲醛(1.22g，10mmol)和化合物3苯胺(0.93g，10mmol)，120℃搅拌5h，在反应过程中，反应溶液逐渐由灰色浊液变为淡黄色澄清液体；TLC监测反应进程，原料暗点斑逐渐减少，出现相对极性更小的绿色荧光点。待反应完毕后，将反应液倾入200mL水中，析出黄灰色沉淀，使用浓度为1M氢氧化钠溶液调节体系至中性后，大量淡黄色色固体沉淀析出，减压抽滤得到淡黄色固体，并用饱和氯化钠水溶液洗涤3次，置于45℃烘箱中烘干，复溶于二氯甲烷后使用环己烷重结晶得到4.09g淡黄色固体粉末化合物4”，产率分别92.3％。
2)化合物5”的合成
称取化合物4”(5mmol)置于250mL双颈圆底烧瓶中，加入无水四氢呋喃(50mL)，将反应体系抽真空并用氮气置换三次，常温下搅拌，直至固体完全溶解。然后在氮气保护下添加无水三乙胺(2.1毫升，15mmol)的溶液在室温下搅拌10分钟。之后，在氮气保护下分别向烧瓶中加入无水氯化镁(1.45g,15 mmol)和多聚甲醛(0.75g)，室温搅拌30分钟后将反应烧瓶放入69°油浴锅中，反应过夜。在反应过程中可以看到有黄色固体析出。TLC监测反应进程，反应结束后，烧瓶冷却至室温，用1M HCl(3×50mL)和H2O(2×50mL)分别洗涤，再用乙酸乙酯(3×100mL)提取。收集有机层，使用无水MgSO4干燥，减压过滤浓缩。用乙酸乙酯/石油醚(1:2，v/v)为洗脱剂进行硅胶柱层析纯化，得到化合物5”为油性物质(4.19g，产率89.1％)。
3)荧光染料II-C的合成
称取化合物5”和2-氨基苯硫醇(1.09g,10mmol)于250mL圆底烧瓶中，加入50mL二氯甲烷/甲醇(体积比3:5)的混合溶剂溶解。混合物在室温下搅拌，约10min后逐渐生成黄绿色沉淀。之后，混合物再搅拌2小时，待反应完毕后将反应液过滤，收集固体，用冷CH3OH洗多次，固体干燥后柱层析分离纯化，分别得到黄色油状固体6.17g(产率85.0％)，即为该例的荧光染料II-C。
实施例2
荧光探针III的合成
称取荧光染料II(233mg,0.4mmol)置于100mL圆底烧瓶中，加入二氯甲烷溶剂(5mL)的搅拌溶解，在低温(0℃)氮气保护下，依次分别向烧瓶中加入三乙胺(200μL,1.6mmol)和烯丙基溴(114.0mg,0.95mmol)。置反应混合物在0℃搅拌30分钟和室温下1小时。TLC监测反应进程，待反应完毕后，将反应液复溶于二氯甲烷中，旋干，采用干法上样，由硅胶柱层析法纯化(石油醚：乙酸乙酯＝2:1，v/v)为洗脱剂，得白色固体(221mg，产率89％)，即为该例的荧光分子探针III，其结构式如合成路线图4中所示。
实施例3
荧光染料II的ICT验证
称取实施例1制备的荧光染料5.82mg溶入到100mL的各种有机溶剂中(四氢呋喃，丙酮，N,N-二甲基甲酰胺，二甲基亚砜，乙醇，甲醇)，得到在不同极性溶剂中浓度为100μM的荧光染料溶液。使用365nm波长的光源激发，观察各溶剂的颜色情况，得到结果如图5所示。
从图5中可以看出，随着溶剂中极性的增加，荧光染料II在365nm荧光光源下，在不同极性溶剂中，呈现不同的颜色，且溶剂极性越大，溶剂颜色越往红移，说明探针具有明显的ICT效应。
实施例4
荧光染料II的ESIPT验证
称取实施例1制备的荧光染料5.82mg溶入到100mL的各种有机溶剂中(四氢呋喃，丙酮，N,N-二甲基甲酰胺，二甲基亚砜，乙醇，甲醇)，得到在不同极性溶剂中浓度为100μM的荧光染料溶液。使用368nm波长的光源激发，测定荧光发射光谱，得到结果如图6所示。在非质子极性溶剂中，如四氢呋喃、 N,N-二甲基甲酰胺，二甲基亚砜荧光发射波长最短，且为单一发射，最强发射波长小于500nm(发射峰分别位于417nm、456nm与491nm)，这应该归属于短波长的烯醇式发射，这是由于溶剂分子中的极性基团易与荧光探针分子内的氨基形成分子间氢键，导致探针分子的分子内氢键完全被取代，激发态分子内质子转移过程完全受阻。在甲醇和乙醇中，由于极性的增大与其较强的给质子能力，荧光探针的最强发射波长出现了双发射峰(发射峰分别位于549nm/415 nm和559nm/447nm)，应是由于较大极性的质子溶剂中甲醇和乙醇分子与荧光探针分子形成了分子间氢键，一定程度上的取代了溶剂分子内部的分子内氢键，从而导致激发态中的ESIPT过程部分受阻，既出现短波长的烯醇式发射和长波长的酮式发射；说明探针具有明显的ESIPT效应。
实施例5
荧光染料II的AIE效应验证
精密称取实施例1制备的荧光染料II 116.2mg，加入到100mL容量瓶中，加入二甲基亚砜使其充分溶解并定容，摇匀后得到浓度为2mM的探针储备液。
配置二甲基亚砜：水不同比例的溶液(100：0，90：10，80：20，70：30， 60：40，50：50，40：60，30：70，20：80，10：90，5：95，1：99，0.5：99.5)，将荧光染料II母液加入这些溶液中，准确配置成10μM的探针溶液。在368nm 的荧光分光光度计下分别测定其在552nm和490nm处荧光强度，并观察各溶液在365nm UV灯下的颜色变化，绘制曲线如图7。
从图7中可以看出，随着溶剂中水含量的增加，荧光染料II在490nm处荧光强度呈逐渐降低趋势，而552nm处荧光强度呈逐渐增加的变化，其中此两处荧光强度比值在水含量50％处，荧光强度存在突变点，说明探针具有明显的AIE 效应。此外，随着溶剂中水含量的增加，在紫外灯下观察各比例溶液的颜色发生从绿色到黄色的变化。
实施例6
荧光探针III的CO比色和光谱响应
准确配制2mM荧光探针III，2mM的PdCl2和10mM的CO释放剂 (CORM-3)储备液。精密称取实施例2制备的荧光分子探针III 124.2mg，加入到100mL容量瓶中，加入二甲基亚砜使其充分溶解并定容，摇匀后得到浓度为2mM的探针储备液；精密称取PdCl2试剂35.5mg加入到100mL容量瓶中，加入二甲基亚砜使其充分溶解并定容，摇匀后得到浓度为2mM的PdCl2储备液；精密称取CORM-3 294.6mg，加入到100mL容量瓶中，加入二甲基亚砜使其充分溶解并定容，摇匀后得到浓度为10mM的CORM-3储备液。取10μL所配置的探针III，10μL PdCl2和20μL CORM-3储备液分别加入pH7.0的水溶液中，得到2mL探针浓度为10μM、PdCl2浓度为10μM与CORM-3浓度为100μM 的响应体系。如图8所示，以365nm为激发光源，可以观察到响应体系颜色发生显著的变化，由蓝色变成黄色，并且440nm处的荧光强度下降，在552nm 处出现新的发射峰。这说明探针III可以用于CO的比色检测。
实施例7
荧光探针III的荧光强度比值-CO浓度变化曲线测试
分别用10μM实施例2的探针III对0,1,2,4,8,10,15,20,25,30,35和40μM CORM-3进行荧光响应测试，得到探针III对的荧光强度比值(I552/I440)和 CORM-3浓度变化的关系曲线；实验条件：激发＝330nm，pH7.0水溶液(0.5％ DMSO)，37℃下孵育30分钟；测试荧光强度曲线。测试效果如图9所示，可以看出，在440nm处荧光随着CORM-3浓度增大，荧光逐渐降低，而在552nm 处的荧光逐渐增强。以此两处荧光强度比值(I552/I440)与CORM-3浓度作图，在CORM-3(0～40μM)范围内表现出良好的线性，线性方程： Y＝0.21507[CO]-0.19582,R2＝0.99534。这说明探针III可以用于CO的定量检测。
实施例8
荧光探针III的选择性和抗干扰性实验
分别用10μM实施例2的探针III与近30种不同的生物活性物种包括常见的阴离子(SO4 2-，PO4 3-，HSO3 -，AcO-，F-，Cl-，Br-，NO3 -，SCN-，CN-和HCO3 -)，氨基酸(Glu，Gly，Pyr，Ser，Thr)，活性硫物种(GSH，Cys，Hcy，H2S)，活性氧物种(ROO·，·OH，ClO-，H2O2)，活性氮物种(HNO，ONOO-)孵育，将其荧光光谱变化与与探针孵育CORM-3对比。测试结果如图10所示，可以说明本发明的探针III具有超高的选择性，其他生物活性小分子不干扰。
实施例9
荧光探针III对空气中CO可视化响应实验
用实施例2的探针III对空气中CO进行响应测试。首先，制备出探针试纸：将中性滤纸与探针溶液(50μM探针III+50μM PdCl2)浸入水中(含有0.5％ DMSO，v/v)，在40℃下干燥半个小时即得；然后，将干燥后的试纸放在盛有 CORM-3溶液的器皿顶端，微热(37℃)缓慢加热致CO释放在器皿的容器内，大约20分钟后，可以观察到试纸颜色发生显著的变化；并且与其他气体如(H2S， HClO，SO2，H2O2，CO2，NO)响应进行对比。实验结果如图11所示，可以说明本发明的探针能够对空气中的CO进行可视化响应，且对其他其他分子具有良好的抗干扰性。
实施例10
荧光探针III的细胞活力测试
细胞活力的研究采用MTT法，以AGS细胞(人胃腺癌细胞)和MCF-7(人乳腺癌细胞)作为研究对象。培养基采用的是DMEM完全培养基：DMEM基础培养基(89％)、双抗青霉素/链霉素(104U/mL、1％)、胎牛血清FBS(10％)。分别将AGS细胞和MCF-7细胞接种到96孔板中，控制每孔细胞个数约为5000 个；第二天用移液枪贴壁吸出培养基，注意不要吸出细胞，然后加100μL的PBS 缓冲溶液冲洗细胞后慢慢吸去废液，随后加入100μL不同浓度的探针III和等当量的PdCl2，每组八个平行试验，十字方向摇晃多次，放入在细胞培养箱中恒温继续培养24小时；第三天吸出培养基后同样用PBS缓冲溶液冲洗细胞，吸出废液，每孔加入培养基和MTT盐溶液(最终浓度为1mg/mL)，十字方向摇匀后，在培养箱中培养2小时；吸出液体，不要将底部的结晶体吸出，每孔加入 150μL的生物级的二甲基亚砜，溶解后将96孔板放入酶联免疫检测仪上，测试吸光度，通过计算得出细胞存活的百分率。如图12所示，即使加入50μM探针 III和50μM PdCl2两种细胞均具有85％以上的存活率，说明探针III不存在明显的细胞毒性。
实施例11
荧光探针III对细胞外源性CO的激光共聚焦显微成像实验
本发明实施例2的荧光探针对人胃腺癌细胞(AGS)的激光共聚焦显微成像；AGS细胞由高糖的DMEM培养液培养，成像前，细胞贴壁于盖玻片上，孵育24小时，然后加入10μM的探针III+PdCl2溶液，37℃孵育30分钟，分别加入不同浓度的CORM-3(20μM，50μM，100μM)，再孵育15分钟，然后进行激光共聚焦显微成像。其结果如图13所示，空白组在蓝色通道有明显的荧光，而黄色通道无荧光，这可以说明探针III具有细胞通透性，且对细胞内生物分子无活性；当加入不同浓度CORM-3后，可见蓝色通道荧光降低，黄色通道荧光增强，这说明探针III能够在细胞中检测外源性的CO。
实施例12
荧光探针III对细胞内源性CO的激光共聚焦显微成像实验
本发明实施例2的荧光探针对无氧诱导的AGS细胞共聚焦显微成像。AGS 分别置于正常条件下(5％CO2/95％air)和无氧条件下(98％N2/2％O2)分别孵育24小时，然后分别加入10μM的探针III+PdCl2溶液，37℃孵育30分钟。如果14所示，加入探针10min后，无氧诱导细胞组出现较强的蓝色荧光，微弱的黄色荧光，随着时间增长，细胞中蓝色荧光逐渐变弱，出现很强的黄色荧光，而正常细胞组无此变化，这说明无氧诱导细胞产生内源性CO，且该CO的波动可以用探针III进行监测。

Claims (4)

1.一种比率比色型检测CO的荧光分子探针，其结构式如式Ⅲ所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
其中：R4为烯丙基。
2.根据权利要求1所述比率比色型检测CO的荧光分子探针的制备方法，包括以下步骤：
向圆底烧瓶中加入式Ⅱ-A荧光染料与溶剂，在氮气保护和冰水浴条件下，向其中滴加化合物8，滴加完毕后，在冰水浴下搅拌一段时间，然后再移至设定温度下进行反应，待反应完毕后将反应液倾入水中，调节溶液pH至6~7后析出固体沉淀，反应液进行抽滤，滤渣经洗涤干燥纯化后，柱层析分离，得到式III结构所示的荧光分子探针；
其合成路线如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
。
3.根据权利要求2所述比率比色型检测CO的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述的溶剂为甲醇，N,N-二甲基甲酰胺，二氯甲烷，乙腈、四氢呋喃、氯仿中的一种或多种；式II-A荧光染料与溶剂的摩尔体积比为(0.5~1.5) : 10 mmol/mL；式II-A荧光染料与化合物8的投料摩尔比为(1~1.5) : (1.5~3.0)；加热回流反应的温度为20~60 ℃，反应时间为2~24 h；纯化过程为：柱层析，石油醚/乙酸乙酯 = 5/1, v/v。
4.根据权利要求1所述的比率比色型检测CO的荧光分子探针在制备检测CO试剂盒中的应用。
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