CN109796493B - 一种具有双光子和近红外发光特性的亚硝酰氢荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有双光子和近红外发光特性的亚硝酰氢荧光探针及其制备方法和应用，涉及生物化学材料领域。本发明提供的亚硝酰氢荧光探针具有式I所示结构，该亚硝酰氢荧光探针具有双光子吸收和近红外发射特性，能够应用于检测细胞内亚硝酰氢，且能够延长细胞和组织中检测亚硝酰氢的激发波长(920nm)和发射波长(700nm)，降低对细胞和组织的光损伤，增加组织穿透深度和成像深度，降低生物背景荧光的干扰，获得更高的成像分辨率；同时，本发明提供的亚硝酰氢荧光探针能快速检测亚硝酰氢，在37℃下响应时间短，对pH不敏感，对细胞内亚硝酰氢成像具有特异性，能够在双光子激发条件下在活细胞中检测亚硝酰氢。

Description

一种具有双光子和近红外发光特性的亚硝酰氢荧光探针及其 制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物化学材料技术领域，特别涉及一种具有双光子和近红外发光特性的亚硝酰氢荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

亚硝酰氢(Nitroxyl，HNO)是活性氮物种家族(Reactive Nitrogen Species，RNS)的重要成员之一，在生命体的生理和病理过程中起着关键性作用。亚硝酰氢是一氧化氮(NO)的单电子还原并质子化的衍生物。其所具有的生物和药理作用特征与NO迥然不同。由于其潜在的生物药理活性，近年来引起了广泛关注。HNO与心绞痛、急性高血压、动脉粥样硬化等众多心血管疾病有着紧密的关系。有文献报道证实，在体内外实验中，Angeli's盐(HNO供体)是强效的血管舒张剂，它能引起离体大动脉、小阻力动脉及完整的冠状动脉舒张。另外，在心肌收缩功能方面HNO与NO所起的药理作用也不同，HNO以心肌肌浆的兰尼碱受体为靶点增强心肌收缩。该药理特性为应对心力衰竭提供了一种潜在的治疗方案，并可有效避免硝酸甘油耐受性的问题。尽管越来越多的证据表明了HNO生物药理作用的重要性，然而由于HNO活性高，在生物体环境中极易脱水发生不可逆的二聚化反应生成N₂O，使得对细胞内源性HNO作用机制的研究因缺乏有效的检测手段而无法顺利开展。

传统检测亚硝酰氢的方法有电化学法、电子自旋共振波谱法、高效液相色谱法、比色法和荧光法等。其中，荧光法由于具有操作简单、灵敏度高、检测限低、可用于细胞内或活体成像等优点受到了科学家们的广泛关注。目前文献报道的检测亚硝酰氢的探针较少，且主要基于铜络合物。该类含金属内核的荧光探针易受到细胞内源性还原物种(例如谷胱甘肽和抗坏血酸等)的干扰；而且大部分存在对pH较敏感、在细胞培养液中稳定性差、细胞穿透能力差、受生物背景荧光干扰严重等缺点，无法应用于活细胞或组织中成像。此外，已有可用于细胞成像的亚硝酰氢荧光探针在细胞成像中所需要的激发波长较短(<500nm)、发射波长短(<650nm)，短波长的激发光容易导致细胞光损伤，产生活性氧物质，并且组织穿透深度和成像深度较浅，短波长的发射易受生物背景荧光的干扰，限制了其在活细胞和活体成像中的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于提供一种具有双光子和近红外发光特性的亚硝酰氢荧光探针及其制备方法和应用。本发明提供的亚硝酰氢荧光探针具有双光子吸收和近红外发射特性，能够应用于检测细胞内亚硝酰氢，且能够延长细胞和组织中检测亚硝酰氢的激发波长和发射波长，获得更高的成像分辨率和更深的组织穿透深度。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种具有双光子和近红外发光特性的亚硝酰氢荧光探针，具有式I所示结构：

式I中，R₁、R₂、R₃和R₄独立地为氢、胺基、烷基、烷氧基、烷胺基、卤代烷基、芳基、芳氧基或芳胺基。

优选的，所述烷基、烷氧基、烷胺基和卤代烷基中碳原子个数独立地为1～6。

优选的，所述亚硝酰氢荧光探针包括

本发明提供了上述方案所述亚硝酰氢荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)将具有式II所示结构的化合物、具有式III所示结构的化合物、第一有机碱、有机酸和第一有机溶剂混合进行Knoevenagel反应，得到具有式IV所示结构的化合物；

式III和式IV中，R₁、R₂、R₃和R₄为氢、胺基、烷基、烷氧基、烷胺基、卤代烷基、芳基、芳氧基或芳胺基；

(2)将所述具有式IV所示结构的化合物与2-(二苯基膦基)苯甲酸、第二有机碱、缩合试剂和第二有机溶剂混合，在保护气氛下进行缩合反应，得到具有式I所示结构的亚硝酰氢荧光探针。

优选的，所述步骤(1)中具有式II所示结构的化合物、具有式III所示结构的化合物、第一有机碱和有机酸的摩尔比优选为1:(1.0～1.5):(0.002～0.005):(0.3～0.8)。

优选的，具有式IV所示结构的化合物与2-(二苯基膦基)苯甲酸、第二有机碱、缩合试剂的摩尔比优选为1:(1.0～1.5):(2.5～3.0):(0.8～1.2)。

优选的，所述步骤(2)中缩合反应的温度为20～45℃，时间为12～18h。

本发明提供了上述方案所述亚硝酰氢荧光探针或上述方案所述方法制备的亚硝酰氢荧光探针非治疗目的的在检测亚硝酰氢中的应用。

优选的，所述亚硝酰氢为细胞内的亚硝酰氢。

本发明提供了一种具有式I所示结构的亚硝酰氢荧光探针，本发明提供的亚硝酰氢荧光探针是具有双光子吸收单元和近红外发射单元的化合物，具有双光子吸收和近红外发射特性，能够应用于检测细胞内亚硝酰氢，且能够延长细胞中检测亚硝酰氢的激发波长和发射波长，降低对细胞和组织的光损伤，增加组织穿透深度和成像深度，降低生物背景荧光的干扰，获得更高的成像分辨率，且能够快速检测亚硝酰氢，对pH不敏感。实施例结果表明，本发明提供的亚硝酰氢荧光探针能够延长细胞中检测亚硝酰氢的激发波长至920nm，延长发射波长至700nm；同时，本发明提供的亚硝酰氢荧光探针在37℃下响应时间仅为5min，且不受pH的影响，对细胞内亚硝酰氢成像具有特异性，能够在双光子激发条件下在活细胞中检测亚硝酰氢。

本发明还提供了所述亚硝酰氢荧光探针的制备方法，本发明提供的制备方法步骤简单，容易操作。

附图说明

图1为实施例2中DCMHNO在不同pH值的PBS/DMF混合溶液中荧光强度的变化图；

图2为DCMHNO在不同浓度的亚硝酰氢存在条件下在PBS/DMF混合溶液中孵化不同时间后荧光强度的变化图；

图3为DCMHNO溶液中加入不同浓度亚硝酰氢孵化后荧光发射光谱的变化图；

图4为DCMHNO溶液在700nm处荧光强度与亚硝酰氢浓度的线性曲线图；

图5为在DCMHNO溶液中分别加入不同竞争分子后的荧光强度变化图；

图6为DCMOH在激发波长为820nm，不同功率双光子激发条件下的发射光谱图；

图7为DCMOH荧光输出光谱积分面积与输入功率的对数关系图；

图8为DCMHNO与HeLa细胞在37℃下孵化5min后的单光子激光共聚焦显微成像照片；

图9为DCMHNO与HeLa细胞37℃下孵化5min后的单光子和双光子激光共聚焦显微成像照片。

具体实施方式

本发明提供了一种具有双光子和近红外发光特性的亚硝酰氢荧光探针，具有式I所示结构：

式I中，R₁、R₂、R₃和R₄独立地为氢、胺基、烷基、烷氧基、烷胺基、卤代烷基、芳基、芳氧基或芳胺基。

在本发明中，所述烷基、烷氧基、烷胺基和卤代烷基中碳原子的个数优选独立地优选为1～6，更优选为2～5，具体的如甲基、乙基、甲氧基、甲胺基、三氟甲基等；所述芳基、芳氧基和芳胺基中芳基的个数优选独立地优选为1～2，具体的如苯基、苯氧基、苯胺基等。

在本发明中，所述亚硝酰氢荧光探针优选包括

本发明提供的亚硝酰氢荧光探针结构中，萘为双光子吸收单元，苯并吡喃腈共轭链接萘基团为近红外发射单元，因而本发明提供的亚硝酰氢荧光探针同时具有双光子吸收特性和近红外发射特性，能够应用于检测细胞内亚硝酰氢，且能够延长细胞和组织中检测亚硝酰氢的激发波长和发射波长，降低对细胞和组织的光损伤，增加组织穿透深度和成像深度，降低生物背景荧光的干扰，获得更高的成像分辨率，并且本发明提供的亚硝酰氢荧光探针响应时间短，对pH不敏感。

本发明还提供了上述方案所述亚硝酰氢荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)将具有式II所示结构的化合物、具有式III所示结构的化合物、第一有机碱、有机酸和第一有机溶剂混合进行Knoevenagel反应，得到具有式IV所示结构的化合物；

式III和式IV中，R₁、R₂、R₃和R₄为氢、胺基、烷基、烷氧基、烷胺基、卤代烷基、芳基、芳氧基或芳胺基；

(2)将所述具有式IV所示结构的化合物与2-(二苯基膦基)苯甲酸、第二有机碱、缩合试剂和第二有机溶剂混合，在保护气氛下进行缩合反应，得到具有式I所示结构的亚硝酰氢荧光探针。

本发明将具有式II所示结构的化合物、具有式III所示结构的化合物、有机碱、有机酸和第一有机溶剂混合进行Knoevenagel反应，得到具有式IV所示结构的化合物。在本发明中，所述式III和式IV中，R₁、R₂、R₃和R₄的种类和上述方案相同，在此不再赘述。在本发明中，所述有机酸优选为乙酸，本发明对于所述第一有机碱没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的适用于进行Knoevenagel反应的有机碱即可，具体如哌啶或吡啶；本发明对所述第一有机溶剂没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的适用于进行Knoevenagel反应的有机试剂即可，具体如甲苯或四氢呋喃。在本发明中，所述具有式II所示结构的化合物、具有式III所示结构的化合物、有机碱和有机酸的摩尔比优选为1:(1.0～1.5):(0.002～0.005):(0.3～0.8)，更优选为1:1.3:0.003:0.5。

在本发明中，所述Knoevenagel反应的温度优选为60～150℃，更优选为100～150℃，进一步优选为130℃。本发明对于所述Knoevenagel反应的时间没有特殊的限定，优选通过TCL板对反应进行监控，反应至具有式II所示结构的化合物完全消失即可。在本发明中，所述Knoevenagel反应优选在搅拌条件下进行，本发明对于所述搅拌的速率没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的搅拌速率即可。

Knoevenagel反应完成后，本发明优选将得到的产物体系依次进行洗涤、干燥、浓缩和柱层析，得到具有式IV所示结构的化合物。在本发明中，所述洗涤所采用的洗涤试剂优选为饱和食盐水；所述洗涤的次数优选为2～5次，更优选为3～4次。本发明优选将所述洗涤后所得有机相进行干燥；本发明对于所述干燥所采用的干燥剂没有特殊的限定，采用本领域技术熟知的干燥剂即可，具体如无水硫酸钠。本发明优选将所述干燥后所得有机物料进行浓缩；本发明对于所述浓缩没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的浓缩方法即可；在本发明的实施例中，优选通过旋转蒸发将干燥后所得有机物料浓缩至固体。在本发明中，所述柱层析用洗脱剂优选为乙酸甲酯和二氯甲烷混合溶剂，所述混合溶剂中乙酸甲酯和二氯甲烷的体积比优选为1:20。

得到具有式IV所示结构的化合物后，本发明将所述具有式IV所示结构的化合物与2-(二苯基膦基)苯甲酸、有机碱、缩合试剂和第二有机溶剂混合，在保护气氛下进行缩合反应，得到具有式I所示结构的亚硝酰氢荧光探针。在本发明中，所述第二有机碱优选为4-二甲氨基吡啶，所述缩合试剂优选为二环己基碳二酰亚胺；所述第二有机溶剂优选为二氯甲烷；具有式IV所示结构的化合物与2-(二苯基膦基)苯甲酸、有机碱、缩合试剂的摩尔比优选为1:(1.0～1.5):(2.5～3.0):(0.8～1.2)，更优选为1:(1.2～1.3):(2.6～2.8):(0.9～1.1)。

在本发明中，所述缩合反应的温度优选为20～45℃，更优选为25℃，时间优选为12～18h，更优选为13～15h，在本发明的具体实施例中，在室温下进行缩合反应即可。本发明对于提供所述保护气氛的保护气体种类没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的保护气体即可，具体如氮气。

缩合反应完成后，本发明优选将得到的缩合产物体系进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：

将缩合产物体系进行固液分离，得到液态混合物；

将所述液态混合物萃取后浓缩，得到浓缩物；

将所述浓缩物进行柱层析，得到具有式I所示结构的亚硝酰氢荧光探针。

本发明对所述固液分离的具体方法没有特殊要求，抽滤即可；在本发明中，所述萃取用萃取剂优选为二氯甲烷-饱和食盐水混合溶液，所述混合溶液中二氯甲烷和饱和食盐水的体积比优选为1:1；所述萃取的次数优选为3次；所述柱层析用洗脱剂优选为二氯甲烷和甲醇的混合液，所述混合液中二氯甲烷和甲醇的体积比优选为15:1；柱层析完成后，本发明优选将柱层析产物中的溶剂旋干，得到干燥、纯净的式I所示结构的亚硝酰氢荧光探针。

本发明还提供了上述方案所述亚硝酰氢荧光探针或上述方案所述方法制备的亚硝酰氢荧光探针非治疗目的的在检测亚硝酰氢中的应用；所述亚硝酰氢优选为细胞内的亚硝酰氢；所述细胞具体的如人宫颈癌细胞；在本发明的具体实施例中，所述亚硝酰氢优选由Angeli's盐(亚硝酰氢供体，Na₂N₂O₃)提供。

以

(简写为DCMHNO)为例，本发明提供的亚硝酰氢荧光探针检测亚硝酰氢的机理如式a所示：

本发明提供的亚硝酰氢荧光探针本身荧光较弱，在与亚硝酰氢作用后，会产生强荧光物质，且荧光强度和亚硝酰氢在一定浓度范围内成线性关系，根据具体的荧光强度值以及线性曲线即可得到亚硝酰氢的浓度；所述线性曲线为荧光强度和亚硝酰氢浓度的关系曲线，本发明对所述线性曲线的绘制方法没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的方法即可；此外，本发明的荧光探针与亚硝酰氢作用后产生物质还具有双光子吸收和发射性质，能够进行双光子细胞成像，因而能够在双光子激发条件下在活细胞中检测亚硝酰氢。

本发明对所述亚硝酰氢荧光探针的具体应用方法没有特殊限定，使用本领域技术人员熟知的方法进行应用即可。

下面结合实施例对本发明提供的方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

按以下反应流程制备亚硝酰氢荧光探针：

(1)将化合物1(400mg，1.92mmol)、对羟基苯甲醛(300mg，2.47mmol)、哌啶(0.6ml，0.006mmol)、乙酸(0.6ml，0.01mmol)和甲苯混合，在氮气的保护下130℃回流17h，用TCL板监控反应进程直至化合物1完全消失；将所得产物用饱和食盐水洗涤，乙酸乙酯萃取三次，所得有机相用无水硫酸钠干燥，旋转蒸发浓缩至固体后用硅胶柱层析法进行纯化，所用洗脱剂为乙酸乙酯和二氯甲烷(乙酸乙酯和二氯甲烷的体积比为1:20)，得到红色固体250mg。

经计算产率为42％；

对所得红色固体进行表征，具体数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.14(s,1H),8.68(d,J＝8.0Hz,1H),7.88(t,J＝7.3Hz,1H),7.74(d,J＝8.2Hz,1H),7.65-7.54(m,4H),7.21(d,J＝15.9Hz,1H),6.89-6.83(m,3H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ160.51,159.31,153.25,152.46,139.72,135.67,130.80,126.57,126.47,125.05,119.43,117.81,117.56,116.49,116.34,106.12,59.62.

根据上述表征数据可知，所得红色固体为化合物2所示结构。

(2)将化合物2(156mg，0.5mmol)、二苯基邻苯甲酸(184mg，0.6mmol)、二环己基碳二亚胺(288mg，1.4mmol)、4-二甲氨基吡啶(61.1mg，0.5mmol)与二氯甲烷(无水级)混合，在室温搅拌下反应，用TCL板监控至化合物2消失，反应12h；将所得产物进行抽滤，用饱和食盐水洗涤，二氯甲烷萃取三次，用硅胶柱层析法进行纯化，所用洗脱剂为二氯甲烷和甲醇(二氯甲烷和甲醇的体积比为15:1)，得到棕绿色固体195mg。

经计算产率为65％；

对所得棕绿色固体进行表征，具体数据如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.91(dd,J＝8.4,1.2Hz,1H),8.31-8.22(m,1H),7.76-7.72(m,1H),7.63-7.52(m,4H),7.50-7.42(m,3H),7.41-7.27(m,10H),7.06-6.98(m,3H),6.86(s,1H),6.75(d,J＝15.9Hz,1H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ164.94,157.26,152.81,152.32,152.21,141.67,141.39,137.85,137.55,137.44,134.71,134.52,134.16,133.95,132.76,132.28,131.40,128.96,128.86,128.65,128.58,128.39,126.02,125.84,122.49,118.79,118.63,117.84,116.71,115.62,106.98,63.05.

根据上述表征数据可知，所得棕绿色固体为DCMHNO。

实施例2

对实施例1制备的亚硝酰氢探针进行性能测试，具体步骤如下：

(1)亚硝酰氢探针对pH的敏感性测定：在2mL PBS/DMF混合溶液(pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，PBS和DMF的体积比为1:1)中加入10μL DCMHNO的DMF溶液(1mM)，得到5μM的DCMHNO溶液，然后加入50μM的Angeli's盐溶液，所得混合溶液在37℃下孵化5min后，测定所述混合溶液的荧光强度随PBS缓冲溶液pH值的变化情况。

图1为DCMHNO在不同pH值的PBS/DMF混合溶液中荧光强度的变化图，由图1可知，DCMHNO对亚硝酰氢的响应对pH不敏感。

(2)亚硝酰氢探针的响应时间测定：在2mL PBS/DMF混合溶液(pH值为7.4，体积比为1:1)中加入10μL DCMHNO的DMF溶液(1mM)，得到5μM的DCMHNO溶液，然后分别加入5μM、10μM、25μM、50μM的Angeli's盐溶液，所得混合溶液在37℃下孵化不同的时间(1、2、3、4、5、6、7、8min)，测定所述混合溶液的荧光强度随孵化时间的变化情况。

图2为DCMHNO在不同浓度的亚硝酰氢存在条件下在PBS/DMF混合溶液中孵化不同时间后荧光强度的变化图，由图2可知，在37℃下孵化5min后，荧光强度基本达到饱和，这说明亚硝酰氢探针响应时间较短，仅为5min。

(3)亚硝酰氢探针的荧光滴定测试：在2mL PBS/DMF混合溶液(pH值为7.4，体积比为1:1)中加入10μL DCMHNO的DMSO溶液(1mM)，得到5μM的DCMHNO溶液，然后分别加入不同浓度的Angeli's盐溶液(亚硝酰氢浓度范围为0～100μM)，在37℃下孵化5min后，测定加入不同浓度亚硝酰氢后所得溶液的荧光发射光谱(E_x＝556nm)，并以700nm处的荧光强度为纵坐标、亚硝酰氢的浓度为横坐标建立DCMHNO对亚硝酰氢检测的线性曲线。

图3为在5μM的DCMHNO溶液中加入不同浓度亚硝酰氢孵化后荧光发射光谱的变化图；根据图3可以看出，随着亚硝酰氢浓度的增大，荧光强度逐渐增强。

图4为DCMHNO溶液在700nm处的荧光强度与亚硝酰氢浓度的线性曲线图，所述线性曲线具体为Y＝1832.84X+14251.97，荧光强度对于亚硝酰氢的浓度的线性响应在5～50μM(R²＝99.6％)之间。

(4)亚硝酰氢探针的选择性测试：在2mL PBS/DMF混合溶液(pH值为7.4，体积比为1:1)中加入10μL DCMHNO的DMSO溶液(1mM)，得到5μM的DCMHNO溶液，分别加入100μM的ZnCl₂、FeCl₃、CaCl₂、MgCl₂、FeCl₂、ClO^-、·OH、双氧水、过氧化叔丁醇、NO₃ ^-、NO₂ ^-、ONOO^-、Na₂S、GSNO、HNO、以及1mM的半胱氨酸、谷胱甘肽和同型半胱氨酸，所得混合溶液分别在37℃下孵化5min，然后测定混合溶液的荧光发射光谱(E_x＝556nm)。

图5为DCMHNO溶液中分别加入不同竞争分子后的荧光强度变化图；其中，a-ZnCl₂、b-FeCl₃、c-CaCl₂、d-MgCl₂、e-FeCl₂、f-半胱氨酸、g-谷胱甘肽、h-同型半胱氨酸、i-ClO^-、j-·OH、k-双氧水、l-过氧化叔丁醇、m-NO₃ ^-、n-NO₂ ^-、o-ONOO^-、p-Na₂S、q-GSNO、r-HNO。由图5可知，除HNO外的其它生物分子与DCMHNO反应前后的荧光强度均没有明显增强，说明DCMHNO可以选择性的识别HNO。

实施例3

对实施例1制备的亚硝酰氢探针的双光子性质进行测定，DCMHNO与亚硝酰氢反应后生成DCMOH

测定DCMOH是否具有双光子吸收和发射性质是该亚硝酰氢探针能够用于双光子细胞成像的基础，测定步骤具体如下：

(1)选择荧光素作为参比物，将其溶于氢氧化钠水溶液(pH＝11)中配制成0.1μM的标准溶液；将DCMOH配制成25μM的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液；

(2)分别取3mL步骤(1)中所得两种溶液，在SP-5W掺钛蓝宝石飞秒脉冲激光器上固定激发功率为200mW，改变激发波长从790nm到880nm，分别测定两种溶液的双光子发射光谱；

(3)固定激发波长为820nm，改变激发功率从180mW到340mW，分别测定步骤(1)中所得两种溶液的发射光谱；

(4)按照如下公式计算双光子截面：

公式中δ为DCMOH的双光子吸收截面，δ_ref为荧光素的双光子吸收截面，Ф为DCMOH的荧光量子产率，Ф_ref为荧光素的荧光量子产率，c为DCMOH的浓度，c_ref为荧光素的浓度，n为DCMOH溶液的折光率，n_ref为荧光素溶液的折光率，F为DCMOH的发射峰积分面积，F_ref为荧光素的发射峰积分面积。

图6为DCMOH在不同功率820nm双光子激发条件下的发射光谱图，图7为DCMOH荧光输出光谱积分面积与输入功率的对数关系图；由图6和图7可知，DCMOH具有双光子吸收和发射能力。

实施例4

对人宫颈癌细胞(HeLa)内亚硝酰氢荧光成像情况进行测试，具体步骤如下：

HeLa细胞经过复苏接种于含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中，在37℃、5％CO₂、100％饱和湿度的培养箱中培养，然后在18mm盖玻片上培养24h，待用。

将培养后的HeLa细胞浸入含5μM DCMHNO的培养基中，在37℃、5％CO₂、100％饱和湿度的培养箱中培养15min后，倒出培养基，用新鲜培养基清洗细胞3遍；分别在激光共聚焦荧光显微镜下观察，并用556nm作为单光子激发光源，用920nm作为双光子激发光源，对其进行明场和暗场下拍照。

图8为DCMHNO与HeLa细胞37℃下孵化5min后的激光共聚焦显微成像照片，其中，(A)为DCMHNO与HeLa细胞在37℃下孵化5min后的明场照片，(B)为DCMHNO与HeLa细胞在37℃下孵化5min后的单光子荧光照片，(C)为(A)和(B)的叠加图；(D)为DCMHNO与HeLa细胞在37℃下孵化5min后再与HNO孵化10min的明场照片，(E)为DCMHNO与HeLa细胞在37℃下孵化5min后再与HNO孵化10min的单光子荧光照片；(F)为(D)与(E)的叠加图。由图8可知，DCMHNO在HeLa细胞中呈现弱的荧光信号，而在加入了HNO的HeLa细胞中呈现强的荧光信号，说明DCMHNO可以对细胞内亚硝酰氢进行单光子荧光成像。

图9为DCMHNO与HeLa细胞37℃下孵化5min后再与HNO孵化10min后的单光子和双光子激光共聚焦显微成像照片，图9中(A)为DCMHNO与HeLa细胞在37℃下孵化5min后的明场照片，(B)为DCMHNO与HeLa细胞在37℃下孵化5min后再与HNO孵化10min的单光子荧光照片，(C)为DCMHNO与HeLa细胞在37℃下孵化5min后再与HNO孵化10min的双光子荧光照片；(D)为(B)和(C)的叠加图；从图9中可以看出，双光子激发条件下，DCMHNO也能够对细胞内亚硝酰氢进行荧光成像。

实施例5

其他条件和实施例1相同，仅将对羟基苯甲醛替换为

对所得产物进行表征，可知得到的亚硝酰氢荧光探针为

实施例6

其他条件和实施例1相同，仅将对羟基苯甲醛替换为

对所得产物进行表征，可知得到的亚硝酰氢荧光探针为

实施例7

其他条件和实施例1相同，仅将对羟基苯甲醛替换为

对所得产物进行表征，可知得到的亚硝酰氢荧光探针为

按照实施例2～4的方法对实施例5～7所得亚硝酰氢荧光探针进行pH敏感性、响应时间、荧光滴定、选择性、双光子性质和人宫颈癌细胞内成像情况进行测试，所得结果和实施例2～4相似。

由以上实施例可知，本发明提供的亚硝酰氢荧光探针具有双光子吸收特性和红外发光特性，且响应时间短，对pH不敏感，能够应用于在双光子激发条件下检测细胞内亚硝酰氢，且能够延长细胞和组织中检测亚硝酰氢的激发波长(920nm)和发射波长(700nm)，降低对细胞和组织的光损伤，增加组织穿透深度和成像深度，降低生物背景荧光的干扰，获得更高的成像分辨率，具有广阔的应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种具有双光子和近红外发光特性的亚硝酰氢荧光探针，具有式I所示结构：

式I中，R₁、R₂、R₃和R₄独立地为氢、胺基、烷基、烷氧基、烷胺基、卤代烷基、芳基、芳氧基或芳胺基；所述R₁、R₂、R₃和R₄不同时为氢。

2.根据权利要求1所述的亚硝酰氢荧光探针，其特征在于，所述烷基、烷氧基、烷胺基和卤代烷基中碳原子个数独立地为1～6。

3.根据权利要求1～2任一项所述的亚硝酰氢荧光探针，其特征在于，所述亚硝酰氢荧光探针为

4.权利要求1～3任一项所述亚硝酰氢荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)将具有式II所示结构的化合物、具有式III所示结构的化合物、第一有机碱、有机酸和第一有机溶剂混合进行Knoevenagel反应，得到具有式IV所示结构的化合物；

式III和式IV中，R₁、R₂、R₃和R₄为氢、胺基、烷基、烷氧基、烷胺基、卤代烷基、芳基、芳氧基或芳胺基；

(2)将所述具有式IV所示结构的化合物与2-(二苯基膦基)苯甲酸、第二有机碱、缩合试剂和第二有机溶剂混合，在保护气氛下进行缩合反应，得到具有式I所示结构的亚硝酰氢荧光探针。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中具有式II所示结构的化合物、具有式III所示结构的化合物、第一有机碱和有机酸的摩尔比为1:(1.0～1.5):(0.002～0.005):(0.3～0.8)。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中具有式IV所示结构的化合物与2-(二苯基膦基)苯甲酸、第二有机碱、缩合试剂的摩尔比为1:(1.0～1.5):(2.5～3.0):(0.8～1.2)。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中缩合反应的温度为20～45℃，时间为12～18h。

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