CN107286173B - Rhodol类衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

Rhodol类衍生物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可用于细胞荧光成像的Rhodol类衍生物（I）以及一类用于次氯酸根离子检测的Rhodol类衍生物（II）。本发明通过2‑(4‑二乙氨基)‑2‑羟基苯甲酰苯甲酸和2,4‑二羟基苯甲醛之间的缩合反应合成了一种新型Rhodol类染料（I），且将此染料成功应用于生物成像中；进而以化合物（I）为荧光团，构建了一类次氯酸根荧光探针（II），并在其中筛选出了两种高灵敏性、高选择性的实时响应型次氯酸根荧光探针RO610和RO585。

Description

Rhodol类衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及两种化学传感器的制备方法及其应用，属于化学传感器技术领域。
背景技术
活性氧（reactive oxygen species，ROS）包括羟基自由基、超氧自由基、单线态氧、过氧化氢和次氯酸/次氯酸盐等，在生命系统中起着至关重要的作用。次氯酸（HClO）作为一种不稳定的弱酸性活性氧，具有很强的氧化性。一定浓度的次氯酸盐常作为有效的消毒液和漂白剂广泛用于日常生活中。另外，生物体内的内源性次氯酸也是一种正常的细胞代谢的副产物，是由氯离子与过氧化氢在髓过氧化物酶（MPO）的催化作用下生成，在免疫系统中扮演着抵御外来病原体入侵的角色并且还对维持细胞内微环境的氧化还原平衡状态起着非常重要的作用。然而，细胞内次氯酸的水平一旦过高就会引发氧化应激，破环生物自身的防御系统，导致蛋白质、磷脂、DNA等生物大分子的严重损害，从而引起一系列的疾病如肺部炎症、神经元退化、风湿性关节炎、动脉硬化、心血管疾病、癌症和肾脏疾病等。因此，实时监测活细胞中次氯酸的动态分布情况以及浓度变化已经成为当今细胞生物学研究和临床诊断等领域的一项重要课题。传统检测次氯酸/次氯酸盐的方法有很多，如电位分析法（Ordeig O, Mas R, Gonzalo J, et al. Electroanalysis, 2005, 17, 1641）、碘量滴定法（Soto N O, Horstkotte B, March J G, et al. Analytica Chimica Acta, 2008,611, 182）、色谱法（Gallina A, Pastore P, Magno F. Analyst, 1999, 124, 1439）等，但这些方法或多或少都存在着一些问题，如灵敏度差，检测过程复杂，仪器使用成本昂贵，所以我们急需研发一种更方便，简单，灵敏的次氯酸根检测方法。
荧光分析法具有其高选择性、高灵敏性、实时检测、易于操作、无损检测以及良好的生物样品相容性等优点，已经成为研究者们检测化学与生物样品的一种重要手段。在实际应用过程中，选择光谱性能优良的荧光分子对荧光分析法至关重要。然而，一些荧光分子的光物理性质缺陷限制了自身的应用范围。因此，新型荧光团的开发及应用迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的是提供一种可用于细胞荧光成像的Rhodol类衍生物（I）以及一类用于次氯酸根离子检测的Rhodol类衍生物（II）。
本发明的另一目的是提供上述Rhodol类衍生物的制备方法。
结构式（I）和（II）所示化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
其中，R为或；
IA与IB互为互变异构体，在不同溶剂中以不同形式存在：在非质子性溶剂中主要以IA形式存在，而在质子性溶剂中主要以IB形式存在。
结构式（I）和（II）所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）2-(4-二乙氨基)-2-羟基苯甲酰苯甲酸和2,4-二羟基苯甲醛在温度为60～110°C，浓硫酸作为溶剂和催化剂的条件下，发生缩合反应，得到化合物（I）；
反应式：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE005
（2）化合物（I）与R-H在温度为60～85 °C，使用体积比为5:1～1:5的醇与卤代烷的混合溶剂，在无催化剂或在有机胺类催化剂条件下，通过缩合反应得到如结构式（II）所示化合物；
反应式：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
R为或
Figure DEST_PATH_IMAGE008
。
上述的制备方法中，步骤（3）所述的醇包括但不限于甲醇、乙醇、异丙醇；卤代烷包括但不限于二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷；有机胺包括但不限于六氢吡啶、三乙胺、吡啶。
本发明所述的化合物（I）可应用于细胞荧光成像。
本发明所述的化合物（II）可用于次氯酸根离子的定量荧光检测。
Rhodafluor即Rhodol荧光团，以其特有的荧光素和罗丹明混合结构兼具了两者荧光量子产率高、摩尔消光系数大、以及光稳定性好和溶解性优良的光物理学性质。本发明通过2-(4-二乙氨基)-2-羟基苯甲酰苯甲酸和2,4-二羟基苯甲醛之间的缩合反应合成了一种新型Rhodol类染料（I），且将此染料成功应用于生物成像中。进而以化合物（I）为荧光团，构建了一类次氯酸根荧光探针（II），并在其中筛选出了两种高灵敏性、高选择性的实时响应型次氯酸根荧光探针RO610（R-=
Figure DEST_PATH_IMAGE009
）和RO585（R-=
Figure DEST_PATH_IMAGE010
）。
本发明的优点：（1）、化合物（I）荧光量子产率高，发射波长长，可以很好地应用于细胞荧光成像中并不受背景荧光的影响。（2）、化合物（II）可实现环境、细胞和动物体内次氯酸根离子的高选择性、高灵敏性实时检测。举例说明：由于次氯酸根离子有很强的氧化性，可以氧化RO610中C=N双键，进而水解为甲酰基，移除异构化作用，从而引起荧光信号增强。基于这种荧光信号的变化，探针分子RO610能够实现缓冲溶液测试体系中次氯酸根的实时检测且不受其他活性氧类物质和常见阴离子的干扰，其检测限为0.17 µM，同时此探针已被成功应用于活细胞及小鼠体内次氯酸根检测。除此之外，本发明还设计、合成了一种同时具有C=N双键和联氨基的Rhodol类衍生物RO585。研究发现次氯酸根作用于此分子的联氨基团，将其氧化为重氮基后经过分子内质子转移形成一种稳定的结构，以此机理实现了次氯酸根离子的高选择性，高灵敏性实时检测。
附图说明
图1为化合物（IA）晶体结构图；
图2为化合物（I）的细胞荧光成像图；
图3为探针RO610在缓冲溶液中对次氯酸根离子离子浓度的荧光光谱；
图4为探针RO610在缓冲溶液中对次氯酸根离子浓度工作曲线图；
图5为探针RO610在缓冲溶液中对次氯酸根离子在活性氧类化合物中选择性荧光光谱；
图6为探针RO610对次氯酸根离子在常见阴离子及氨基酸类化合物中选择性荧光光谱；
图7为探针RO610细胞内外源性次氯酸荧光成像研究；
图8为探针RO610小鼠体内外源性次氯酸荧光成像研究；
图9为探针RO585在缓冲溶液中对次氯酸根离子离子浓度的荧光光谱；
图10为探针RO585在缓冲溶液中对次氯酸根离子浓度工作曲线图；
图11为探针RO585在缓冲溶液中对次氯酸根离子在活性氧类化合物中选择性荧光光谱；
图12为探针RO585对次氯酸根离子在常见阴离子及氨基酸类化合物中选择性荧光光谱。
具体实施方式
下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 化合物（I）的制备
（1）准确称量3-二乙胺基苯酚（8.25 g, 0.05 mol），邻苯二甲酸酐（9.5 g, 0.064mol）和甲苯35 mL于100 mL圆底烧瓶中。利用程序升温的方法，80 °C加热10 h，90 °C加热5h，100 °C加热2 h,110 °C回流1 h。反应完成后析出紫红色固体，抽滤，用甲醇洗涤滤饼，得到粉白色固体，即为产物2-(4-二乙氨基)-2-羟基苯甲酰苯甲酸。
（2）准确称量化合物2-(4-二乙氨基)-2-羟基苯甲酰苯甲酸（0.15 g, 0.48mmol），2, 4-二羟基苯甲醛（0.066 g, 0.48 mmol），甲磺酸5 mL于25 mL圆底烧瓶中90 °C反应约1 h，待反应体系冷却至室温，倾入40 mL冰水中，用氨水调pH至7-8，大量红色固体析出，抽滤收集固体，冰水洗涤，干燥，最后经过柱层析纯化（CH2Cl2:CH3OH = 300:1, v:v）得到淡粉色固体，即化合物（Ⅰ）。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ ppm 1.19 (t, J = 6.8 Hz,6H), 3.38 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 6.40 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.49 (s, 1H), 6.58(d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.81 (s, 1H), 7.02 (s, 1H), 7.23 (d, J = 7.4 Hz, 1H),7.69 (m, 2H), 8.06 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 9.58 (s, 1H), 11.20 (s, 1H); 13C NMR(CDCl3, 100 MHz): δ ppm 12.38, 44.45, 82.99, 97.67, 104.37, 108.86, 113.24,117.80, 123.86, 125.07, 125.92, 126.94, 128.72, 129.83, 135.07, 135.49,149.71, 152.19, 152.47, 157.83, 162.91, 169.28, 194.62; ESI-HRMS: [M+H]+ m/z 416.1483, calcd for C25H22NO5 416.1492； FT-IR (KBr, cm-1): 3672, 1750, 1625,1521, 1405, 875, 801, 697.
通过溶剂（二氯甲烷：CH2Cl2）挥发法得到Rhodol类化合物（IA）的晶体，并利用单晶衍射仪测定分析了其单晶结构（图1）。化合物（IA）的分子式为C25H21NO5，该晶体结构属于单斜晶系，晶胞参数为：α = 90 deg，β = 91.616 deg，γ = 90 deg。
Rhodol类化合物（I）细胞荧光成像研究：在直径为35 mm激光共聚焦培养皿上种植细胞，对照组孵育24 h后在2 mL的培养基中加入1 µL，10 mM的化合物（Ⅰ）探针母液（DMSO溶解，终浓度为5 µM）进行染色培养10 min。然后用PBS，pH = 7.4缓冲溶液冲洗细胞3次，拍摄荧光成像照 片（图2）。
实施例2 探针RO610的制备及应用
Figure DEST_PATH_IMAGE011
（1）2-(4-二乙氨基)-2-羟基苯甲酰苯甲酸的制法与实施例1中的相同；
（2）Rhodol类的化合物（I）制法与实施例1中的相同；
（3）准确称取化合物（I）（83.05 mg, 0.2 mmol），二氨基顺丁烯二腈（32.43 mg,0.3 mmol）溶于4 mL的混合溶剂（CH3OH:CH2Cl2 = 5:3），搅拌回流，TLC监测至化合物（Ⅰ）反应完全。反应结束后冷却至室温有黄色固体析出，减压抽滤用冰甲醇洗涤3次，室温干燥后即为纯品，即为Rhodol类衍生物RO610。1H NMR (400 MHz, Acetone-d 6 ): δ ppm 8.46 (S,1H), 7.97 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.80 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.73 (t, J = 7.6 Hz,1H), 7.39 (S, 1H), 7.33 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.13 (S, 2H), 6.79 (S, 1H), 6.57(d, J = 9.6 Hz, 1H), 6.51 (m, 2H), 3.44 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.17 (t, J = 6.8Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, Acetone-d 6 ): δ ppm 210.57, 173.79, 166.24, 164.64,160.69, 157.79, 157.61, 154.96, 140.30, 139.57, 135.06, 133.98, 132.50,130.39, 129.78, 129.24, 121.78, 119.14, 118.43, 117.93, 114.16, 110.55,109.77, 108.52, 102.56, 49.30, 17.07; HRMS (ESI): [M+H]+ m/z 506.1831, calcdfor C29H24N5O4 506.1823; FT-IR (KBr, cm-1): 3432, 2976, 2233, 2205, 1739, 1626,1501, 1373, 1264, 1215, 1108, 874, 767, 692, 546。
探针RO610对次氯酸根离子浓度的荧光光谱测试：在10 mL的比色管中加入0.1 mL1 mM的RO610母液，3 mL 乙醇，1 mL 磷酸缓冲溶液（pH = 7.4, 20 mM），再向其中分别加入浓度为0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 50 μM的次氯酸根溶液。定容摇匀后，测定各组的荧光光谱，如图3所示。由图3可知，当体系中逐渐加入ClO−(0-50 μM) 时，随着ClO−浓度增大，RO610在波长577 nm处的荧光强度逐渐增强。
探针RO610对次氯酸根离子浓度工作曲线测定：由RO610对次氯酸根离子浓度的荧光光谱得到在577 nm处荧光响应强度随次氯酸根离子浓度工作曲线。如图4可知，当体系中逐渐加入ClO− (0-20 μM) 时，577 nm处的荧光强度与ClO−浓度呈现很好的线性关系，线性方程为y = 150.448 x + 50.182，相关系数为0.9910，并且通过计算得其检测限为0.17 µM(3σ/slope)。
探针RO610对次氯酸根离子在活性氧类化合物中选择性荧光光谱测试：在10 mL的比色管中加入0.1 mL 1 mM的RO610母液，3 mL 乙醇，1 mL 磷酸缓冲溶液（pH = 7.4, 20mM），再向其中分别加入200 µM H2O2，•OH，O2 −，1O2，NO•，TBHP，TBO•和50 µM ClO−。定容摇匀后，测定各组的荧光光谱，如图5所示。由图5可知，加入次氯酸根离子的体系在577 nm处荧光强度大大增强，而其它活性氧类化合物则没有明显变化，说明Rhodol类衍生物RO610对次氯酸根离子的检测不受其他活性氧类物质影响，具有很好的选择性。
探针RO610对次氯酸根离子在常见阴离子及氨基酸类化合物中选择性荧光光谱测试：同活性氧类化合物选择性检测条件，向各组溶液中分别加入200 µM F−，Cl−，Br−，I−，S2O3 2−，AcO−，SO4 2−，NO2 −，NO3 −，CN−，HS−，SCN−，PO4 3−，H2PO4 −，HPO4 2−，CO3 2−，HCO3 −，HSO4 −，HSO3 −，SO3 2 −，Cys，Hcy，GSH和50 µM ClO−。定容摇匀后，测定各组的荧光光谱，如图6所示。由图6可知，加入次氯酸根离子的体系在577 nm处荧光强度大大增强，而加入其它阴离子和氨基酸类化合物不会引起荧光的变化，说明RO610对次氯酸根离子的检测不受其他阴离子及氨基酸类化合物影响，具有很好的选择性。
探针RO610细胞内外源性次氯酸荧光成像研究：在直径为35 mm激光共聚焦培养皿上种植细胞，对照组孵育24 h后在2 mL的培养基中加入1 µL，10 mM的RO610探针母液（DMSO溶解，终浓度为5 µM）进行染色培养10 min。然后用PBS，pH = 7.4缓冲溶液冲洗细胞3次，拍摄荧光成像照 片（激发波长为543 nm，收集555-655 nm波长范围）。另一实验组则是在细胞中加入探针母液染色后再加入10 µM和25 µM的次氯酸钠溶液，孵育10 min后进行荧光成像（激发波长为543 nm收集，555-655 nm波长范围），得到荧光成像图7。如图7b所示RO610在细胞内呈现极其微弱的红色荧光，随后分别将2当量和5当量的次氯酸钠溶液加入至染色后的细胞培养皿中，此时图7e和7h显示加入次氯酸钠后探针分子的荧光显著增强，且图7h荧光比7e更强，这说明RO610可以实现MCF-7细胞内外源性次氯酸的荧光成像。
探针RO610小鼠体内外源性次氯酸荧光成像研究：选用4-6周未脱毛的小鼠作为实验材料，将小鼠麻醉后用探针分子RO610 (1 mM, 25µL) 培养10 min后进行小鼠成像实验。从外加次氯酸在小鼠体内的荧光成像图8可以看出，随着时间的延长，探针分子和次氯酸钠在小鼠体内发生反应，使得小鼠皮下注射部位的荧光强度显著增强，此实验说明RO610也可以用于活体动物内次氯酸的荧光成像研究。
实施例3 探针RO585的制备及应用
Figure DEST_PATH_IMAGE012
（1）2-(4-二乙氨基)-2-羟基苯甲酰苯甲酸的制法与实施例1中的相同；
（2）Rhodol类化合物（I）的制法与实施例1中的相同；
（3）准确称取化合物（I）30 mg（0.07 mmol），2-吡啶肼11 mg（0.1 mmol）于10 mL圆底烧瓶中，加入乙醇 2 mL溶解，加热回流，TLC监测直至原料反应完全停止反应，体系冷却至室温，大量粉白色固体析出，抽滤，冰乙醇多次洗涤滤饼，得到粉白色固体，即为纯品Rhodol类衍生物RO585。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ ppm 8.12 (s, 1H), 8.03 (d, J =7.3 Hz, 1H), 7.66 (m, 2H), 7.62 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 7.20 (d, J = 7.4 Hz,1H), 6.99 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.83 (s, 1H), 6.80 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 6.59(S, 1H), 6.55 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.45 (s, 1H), 6.35 (d, J = 9.0 Hz, 1H),3.36 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.17 (t, J = 6.7 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ): δ ppm 169.29, 158.09, 156.64, 152.83, 152.61, 152.42, 149.66, 148.43,138.42, 137.42, 136.04, 130.52, 129.10, 126.86, 126.67, 125.02, 124.61,118.38, 115.47, 111.63, 109.08, 106.13, 104.94, 103.21, 97.44, 83.97, 44.24,12.78; HRMS (ESI): [M+Na]+ m/z 529.1851, calcd for C30H27N4O4 529.1846; FT-IR(KBr, cm-1): 2971, 1744, 1600, 1622, 1441, 1216, 1166, 1108, 868, 766, 697,522.
探针RO585对次氯酸根离子浓度的荧光光谱测试：在10 mL的比色管中加入0.1 mL1 mM的Rhodol类衍生物RO585母液，2 mL 乙醇，1 mL 磷酸缓冲溶液（pH = 7.4, 20 mM），再向其中分别加入浓度为0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20 μM的次氯酸根溶液。定容摇匀后，测定各组的荧光光谱，如图9所示。由图9可知，当体系中逐渐加入ClO− (0-20 μM) 时，随着ClO−浓度增大，RO610在波长563 nm处的荧光强度逐渐增强。
探针RO585对次氯酸根离子浓度工作曲线测定：由Rhodol类衍生物RO585对次氯酸根离子浓度的荧光光谱得到在563 nm处荧光响应强度随次氯酸根离子浓度工作曲线。如图10可知，当体系中逐渐加入ClO− (0-18 μM) 时，563 nm处的荧光强度与ClO−浓度呈现很好的线性关系，y = 211.405 x – 41.677，相关系数为0.9978，通过计算得出其检出限为33nM (3σ/slope)。
探针RO585对次氯酸根离子在活性氧类化合物中选择性荧光光谱测试：在10 mL的比色管中加入0.1 mL 1 mM的Rhodol类衍生物RO585母液，2 mL 乙醇，1 mL 磷酸缓冲溶液（pH = 7.4, 20 mM），再向其中分别加入200 µM H2O2，•OH，O2 −，1O2，NO•，TBHP，100 µM TBO•，50 µM ONOO−和20 µM ClO−。定容摇匀后，测定各组的荧光光谱，如图11所示。由图11可知，加入次氯酸根离子的体系在563 nm处荧光强度大大增强，而其它活性氧类化合物则没有明显变化，说明Rhodol类衍生物RO585对次氯酸根离子的检测不受其他活性氧类物质影响，具有很好的选择性。
探针RO585对次氯酸根离子在常见阴离子及氨基酸类化合物中选择性荧光光谱测试：同活性氧类化合物选择性检测条件，向各组溶液中分别加入100 µM F−，Cl−，Br−，I−，S2O3 2−，AcO−，SO4 2−，NO2 −，NO3 −，CN−，HS−，SCN−，PO4 3−，H2PO4 −，HPO4 2−，CO3 2−，HCO3 −，HSO4 −，HSO3 −，SO3 2 −，Cys，Hcy，GSH和20 µM ClO−。定容摇匀后，测定各组的荧光光谱。由图12可知，加入次氯酸根离子的体系在563 nm处荧光强度大大增强，而加入其它阴离子和氨基酸类化合物不会引起荧光的变化，说明Rhodol类衍生物RO585对次氯酸根离子的检测不受其他阴离子及氨基酸类化合物影响，具有很好的选择性。

Claims (6)

1.结构式（I）和（II）所示化合物：
Figure 712578DEST_PATH_IMAGE001
其中，R为或
Figure 732148DEST_PATH_IMAGE003
；
IA与IB互为互变异构体。
2.权利要求1所述结构式（I）所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
Figure 488489DEST_PATH_IMAGE004
2-(4-二乙氨基)-2-羟基苯甲酰苯甲酸和2,4-二羟基苯甲醛在温度为60～110 °C，浓硫酸作为溶剂和催化剂的条件下，发生缩合反应，得到化合物（I）。
3.权利要求1所述结构式（II）所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）2-(4-二乙氨基)-2-羟基苯甲酰苯甲酸和2,4-二羟基苯甲醛在温度为60～110 °C，浓硫酸作为溶剂和催化剂的条件下，发生缩合反应，得到化合物（I）；
Figure DEST_PATH_IMAGE005
（2）化合物（I）与R-H在温度为60～85 °C，使用体积比为5:1～1:5的醇与卤代烷的混合溶剂，在无催化剂或在有机胺类催化剂条件下，通过缩合反应得到如结构式（II）所示化合物；
Figure 797896DEST_PATH_IMAGE006
R=为
Figure DEST_PATH_IMAGE007
或
Figure 567750DEST_PATH_IMAGE008
。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：上述步骤（2）中，醇选自甲醇、乙醇、异丙醇。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：卤代烷选自二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：有机胺选自六氢吡啶、三乙胺、吡啶。
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