CN113072927A - 一种基于zif材料的近红外纳米荧光探针的制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了一种基于ZIF材料的三磷酸腺苷(ATP)近红外纳米荧光探针的制备和应用，该荧光探针的结构由纳米级别的沸石咪唑类金属有机框架(ZIF‑90)以及其内部包裹的基于香豆素‑吡喃的近红外荧光团构成。本发明提供了以4‑(二乙氨基)水杨醛，2‑(4‑二乙氨基‑2‑羟基苯甲酰基)苯甲酸，咪唑‑2‑甲醛，二水合乙酸锌等为原料合成该荧光探针的制备方法；该荧光探针是一种基于ZIF‑90的三磷酸腺苷近红外荧光探针；首先，该荧光探针合成方法简单，对ATP能产生32倍的荧光增强；其次，该荧光探针对ATP有相对理想的选择性，不受其他核苷酸以及生物体中常见离子的干扰；并且，该荧光探针与ATP作用迅速，响应时间在10min以内；此外，该荧光探针具有较长的近红外发射，可以应用于活细胞内ATP含量的检测。

Description

一种基于ZIF材料的近红外纳米荧光探针的制备和应用

技术领域

本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及基于沸石咪唑框架材料的三磷酸腺苷近红外纳米荧光探针的制备和应用。

背景技术

三磷酸腺苷(ATP)是生物体内组织细胞一切生命活动所需能量的直接来源，主要在线粒体中产生(Dennis P.B.,Jaeschke A.,Saitoh M.,Fowler B.,Kozma S.C.,ThomasG.Science.2001,294,1102-1105.)。作为一种多功能生物分子，ATP在能量传递、细胞呼吸、酶催化、信号传导等多种生理过程中发挥着至关重要的作用(KnowlesJ.R.Ann.Rev.Biochem.1980,49,877-919；Dennis P.B.,Jaeschke A.,Saitoh M.,FowlerB.,Kozma S.C.,Thomas G.Science.2001,294,1102-1105；Khlyntseva S.V.,Bazel Y.R.,Vishnikin A.B.,Andruch V.J.J.Anal.Chem.2009,64,657-673.)。细胞中ATP浓度的异常波动与许多疾病密切相关，如炎症、心血管病、恶性肿瘤和帕金森病等，因此可以将ATP作为某些疾病的标志物进行研究(Bours M.J.L.,Swennen E.L.R.,Di Virgilio F.,CronsteinB.N.,Dagnelie P.C.Adenosine.2006,5,358-404；Yokoshiki H.,Sunagawa M.,Seki T.,Sperelakis N.Am.J.Physiol.:Cell Physiol.1998,274(1),C25-C37；WallaceD.C.Science.1999,283,1482-1488；Zhou Z.,Du Y.,Dong S.Anal.Chem.2011,83,5122-5127；Di Virgilio F.Purinergic Signalling.2005,1,205-205.)。开发一种方便有效的ATP检测方法，有助于我们进一步了解和研究与ATP相关的生理和病理过程。

近年来，科研人员已开发出多种ATP检测方法，如比色法、化学发光法、电化学分析法、荧光法等(Li S.,Zhao X.,Yu X.,Wan Y.,Yin M.,Zhang W.,Cao B.,WangH.Anal.Chem.2019,91,14737-14742；Li X.Y.,Guo X.D.,Cao L.X.,Xun Z.Q.,Wang S.Q.,Li S.Y.,Li Y.,Yang G.Q.Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,7809-7813；Chang J.F.,LvW.X.,Li Q.,Li H.Y.,Li F.Anal.Chem.2020,92,8959-8964；Wu Z.,Liu M.M.,Liu Z.C.,TianY.J.Am.Chem.Soc.2020,142,7532-7541.)。其中，荧光法由于灵敏度高、选择性好、响应快和成像分辨率强等优点，成为生物检测分析中的强大工具(Zhu H.,Fan J.,Du J.,Peng X.J.Acc.Chem.Res.2016,49,2115-2126；Lichtman J.W.,ConchelloJ.A.Nat.Methods.2005,2,910-919；Ren T.B.,Xu W.,Zhang W.,J.Am.Chem.Soc.2018,140,7716-7722.)。然而，目前所报道的ATP荧光探针大部分发射波长较短，达不到生物活体成像的要求(Li W.,Gong X.Y.,Fan X.P.,Yin S.L.,Su D.D.Chinese ChemicalLetters.2019,30,1775-1790.)。因此，有必要设计一种近红外发射的荧光探针用于监测体内ATP水平的动态波动。

沸石咪唑骨架(ZIFs)是由金属离子和咪唑连接体自组装而成的金属有机框架(MOFs)的一个子类(Venna S.R.,Carreon M.A.J.Am.Chem.Soc.2010,132,76-78.)。由于其孔隙可调、结构可控、负载率高、生物相容性好、易于合成和功能化等优势，在催化、气体储存与分离、药物输送、生物成像和传感等领域被广泛研究和应用(Morris W.,Leung B.,Furukawa H.,Yaghi O.K.,He N.,Hayashi H.,Asta M.,Laird B.B.,YaghiO.M.J.Am.Chem.Soc.2010,132,11006-11008；Yaghi O.M.J.Am.Chem.Soc.2016,138,15507-15509；ParkJ.,Sun L.B.,ChenY.P.,Perry Z.,Zhou H.C.Angew.Chem.,Int.Ed.2014,53,5842-5846.)。近年来，ZIFs在有关生物过程和疾病标志物检测领域的研究越来越多(Yang J.,Yang Y.W.Small.2020,16,1906846.)，但是，利用ZIFs进行ATP检测的报道较少。因此，将纳米材料和荧光技术相结合，开发一种基于ZIFs的近红外纳米荧光探针来检测ATP具有重要意义。

发明内容

根据所提出的要求，本发明人对此进行了深入研究，在付出大量创造性劳动后，提供了一种基于沸石咪唑框架(ZIF-90)的三磷酸腺苷近红外纳米荧光探针。

本发明的技术方案是，一种基于ZIF材料的近红外纳米荧光探针，其结构是由沸石咪唑框架(ZIF-90)和香豆素-吡喃基近红外荧光染料(CP)自组装而成。

一种基于ZIF材料的近红外纳米荧光探针的制备方法。步骤如下：

1)香豆素-吡喃基近红外染料(CP)的制备方法：将10当量的4-(二乙氨基)水杨醛，10当量的乙酰乙酸乙酯，以及1.0当量的哌啶分别加入到100mL圆底烧瓶中，然后加入20mL无水乙醇将其溶解。反应在75～80℃下回流搅拌6h，反应完成后，减压除去溶剂。粗产品用硅胶柱层析法提纯，洗脱液为二氯甲烷，减压抽滤除去溶剂，得到深黄色固体中间产物(产率60％)。在100mL圆底烧瓶中，将1.0当量的中间产物和1.0当量的2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸溶解在5～8mL的浓硫酸中，在90℃下搅拌反应6h。停止反应，将所得到的溶液迅速倒入冰水中，然后加入0.5mL的70％高氯酸以沉淀固体。粗产品经减压抽滤和冷水洗涤后，再用硅胶柱层析法提纯，洗脱液比例为二氯甲烷：甲醇(20:1)，减压抽滤除去溶剂，得到深绿色固体产物(产率69％)。

2)基于ZIF材料的近红外纳米荧光探针(CP@ZIF-90)的制备方法：将100当量的咪唑-2-甲醛和1.0当量的近红外荧光染料CP加入10mL离心管中，滴加1～5mLN,N-二甲基甲酰胺使其完全溶解；将50当量的二水合乙酸锌加入5mL离心管中，滴加1～5mLN,N-二甲基甲酰胺使其完全溶解，再将5mL离心管中的溶液倒入10mL离心管内；然后，把离心管放入超声波清洗机中振荡5min，再滴加5～10mLN,N-二甲基甲酰胺，继续超声振荡10～20min；接着，将所得到的悬浊液进行离心分离，用无水乙醇冲洗固体3～5次，直至上清液无明显颜色；最后，将所得到的固体放入真空干燥箱中，在25℃下干燥24小时，得到浅绿色固体，即为所述荧光探针。

本发明的有益效果是，一种基于ZIF材料的三磷酸腺苷(ATP)近红外纳米荧光探针的良好的光谱响应性能。首先，研究了该探针的荧光光谱性质。加入ATP之前，探针本身没有明显的荧光发射；加入ATP之后，在近红外区(704nm)出现了明显的荧光发射峰。随着ATP浓度的增大，探针分子的近红外荧光强度不断增强。当加入10mM的ATP时，荧光强度增强32倍，因此该探针可以用来检测ATP。该探针的荧光增强变化在1mM到10mM检测范围内与ATP的浓度呈线性关系，说明该探针在该范围内可以通过检测荧光强度来反映ATP浓度。其次，研究了探针的紫外吸收光谱。在没有加入ATP时，探针无紫外吸收；加入ATP后，探针在650nm处出现吸收峰。接着，研究探针的选择性，考察探针与其他核苷酸(ADP,AMP,GTP,CTP,UTP)，生物体中常见的离子(P₃O₁₀ ^5-,P₂O₇ ^4-,H₂PO₄ ^-,HPO₄ ^2-,PO₄ ^3-,Cl^-,SO₄ ^2-,NO₃ ^-,CH₃COO^-,CO₃ ^2-,Ca²⁺,K⁺,Cu²⁺)，以及检测物(ATP)的荧光响应情况。结果发现，只有ATP能引起荧光光谱强烈改变，其他检测物对探针的荧光光谱没有明显影响。然后，研究了pH值对荧光探针测定ATP的影响，当pH值介于5.0到9.0之间时，不影响荧光探针对ATP的测定。此外，该荧光探针响应迅速，响应时间在10分钟以内。

一种三磷酸腺苷近红外荧光探针的应用。在对照组细胞中观察不到明显的荧光，当细胞中加入荧光探针后，可以观察到较强的荧光，这说明探针能够检测到细胞中存在的ATP。当细胞用三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)预处理清除细胞内产生的ATP后，发现荧光明显减弱。这些结果说明：荧光探针能够检测到细胞内ATP含量的变化，这为监控活细胞内ATP水平的动态波动提供一种可靠的手段。

附图说明

图1为荧光探针的制备路线及与ATP作用示意图。

图2为荧光探针与不同浓度的ATP作用后的荧光光谱图。

横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。荧光探针的浓度均为4mg/mL，ATP浓度分别为：0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0mM。荧光激发波长为650nm，发射波长为704nm。

图3为荧光探针对不同ATP浓度的荧光线性响应图。

图4为荧光探针与ATP作用前后的紫外可见吸收光谱图。

横坐标为波长，纵坐标为吸光度。荧光探针的浓度为4mg/mL，ATP浓度为10mM。

图5为荧光探针的选择性图。

荧光探针的浓度为4mg/mL，ATP浓度为10mM，其它分析物浓度均为10mM。

图6为pH对荧光探针的影响图。

图7为荧光探针与不同浓度ATP作用后荧光强度随时间变化的关系曲线图。

图8为细胞毒性实验图。横坐标为荧光探针的浓度，纵坐标为细胞的存活率。

图9为荧光探针与ATP作用的细胞成像图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不限于此。

实施例1：

荧光探针的制备

香豆素-吡喃基近红外染料(CP)的制备：将10当量的4-(二乙氨基)水杨醛，10当量的乙酰乙酸乙酯，以及1.0当量的哌啶分别加入到100mL圆底烧瓶中，然后加入20mL的无水乙醇将其溶解。反应在75～80℃下回流搅拌6h，反应完成后，减压除去溶剂。粗产品用硅胶柱层析法提纯，洗脱液为二氯甲烷，减压抽滤除去溶剂，得到深黄色固体中间产物(产率60％)。在100mL圆底烧瓶中，将1.0当量的中间产物和1.0当量的2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸溶解在5mL的浓硫酸中，在90℃下搅拌反应6h。停止反应，将所得到的溶液迅速倒入冰水中，然后加入0.5mL的70％高氯酸以沉淀固体。粗产品经减压抽滤和冷水洗涤后，再用硅胶柱层析法提纯，洗脱液比例为二氯甲烷：甲醇(20:1)，减压抽滤除去溶剂，得到深绿色固体产物，即为近红外染料CP(产率69％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,ppm)δ9.11(s,1H),8.17(d,J＝8.0Hz,1H),7.88(t,J＝8.0Hz,2H),7.81(d,J＝8.0Hz,1H),7.75(d,J＝8.0Hz,1H),7.53(d,J＝8.0Hz,1H),7.25-7.16(m,3H),7.00(d,J＝8.0Hz,1H),6.73(s,1H),3.65(q,J＝4.0Hz,8H),1.20(t,J＝8.0Hz,12H).MS(TOF,m/z):537.2.

基于ZIF材料的近红外纳米荧光探针(CP@ZIF-90)的制备：如图1所示，将100当量的咪唑-2-甲醛和1.0当量的近红外荧光染料CP加入10mL离心管中，滴加2mL N,N-二甲基甲酰胺使其完全溶解；将50当量的二水合乙酸锌加入5mL离心管中，滴加2mLN,N-二甲基甲酰胺使其完全溶解，再将5mL离心管中的溶液倒入10mL离心管内；然后，把离心管放入超声波清洗机中振荡5min，再滴加6mLN,N-二甲基甲酰胺，继续超声振荡20min；接着，将所得到的悬浊液进行离心分离，用无水乙醇冲洗固体5次，直至上清液无明显颜色；最后，将所得到的固体放入真空干燥箱中，在25℃下干燥24小时，得到浅绿色固体，即为所述荧光探针。

实施例2：

荧光探针和ATP溶液配制

探针溶液的制备：称取一定量探针分散在蒸馏水中，配成4mg/mL的探针溶液。ATP溶液的配制：称取一定量的腺苷-5'-三磷酸二钠盐溶解在蒸馏水中，配置成20mM的ATP溶液，保存在4～8℃的环境中。

实施例3：

荧光探针与ATP作用的荧光光谱的测定

图2为荧光探针与ATP作用的荧光光谱，荧光探针的浓度为4mg/mL，ATP的浓度依次为0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0mM。激发波长固定为650nm，发射波长范围为660～800nm。狭缝宽度为5.0nm/5.0nm，所用的荧光测定仪器为日立F4600荧光分光光度计。从图2可以看出，加入ATP之前，荧光探针没有明显的荧光发射；加入ATP之后，在近红外区(704nm)出现了发射峰。这是因为ATP与构成探针结构中的Zn²⁺竞争性配位结合，导致探针的沸石咪唑结构崩塌，从而释放出包裹在其中的荧光团CP，释放出CP的近红外荧光。并且随着ATP浓度的增大，探针分子的近红外荧光强度不断增强。当加入10mM的ATP时，荧光强度增强32倍，因此可以用来检测ATP。图3为探针对不同ATP浓度的线性响应图。ATP浓度范围在1.0～10.0mM时，探针的荧光强度与ATP浓度呈现线性关系，说明探针可以在该浓度范围内定量检测ATP。

实施例4：

荧光探针与ATP作用的紫外可见吸收光谱的测定

图4为荧光探针与ATP作用前后的紫外可见吸收光谱图，荧光探针的浓度为4mg/mL，ATP的加入量为10mM。紫外可见吸收光谱测定用的仪器为安捷伦Cary60紫外可见分光光度计。从图4中可以看出，在没有加入ATP时，探针无明显吸收；加入ATP后，探针在650nm处出现了吸收峰，且与CP本身的紫外吸收峰一致，说明ATP导致探针结构崩坍，从而释放出荧光染料CP，产生了紫外吸收。

实施例5：

荧光探针对ATP测定的选择性

图5为荧光探针对ATP测定的选择性图。考察在浓度为4mg/mL的荧光探针悬浊液中加入ATP(10mM)及其他核苷酸类(ADP,AMP,GTP,CTP,UTP)，和生物体中常见的离子(P₃O₁₀ ^5-,P₂O₇ ^4-,H₂PO₄ ^-,HPO₄ ^2-,PO₄ ^3-,Cl^-,SO₄ ^2-,NO₃ ^-,CH₃COO^-,CO₃ ^2-,Ca²⁺,K⁺,Cu²⁺)(10mM)的荧光响应情况。从图5中可以看出，只有ATP能引起32倍的荧光增强，而其他检测物对探针的荧光强度没有明显影响。这些结果表明，荧光探针对ATP有较好的选择性。

实施例6：

溶液pH值对荧光探针测定ATP的荧光性质的影响

考察pH值对荧光探针测定ATP的荧光光谱的影响，其结果如图6。我们研究的pH范围为2.0～12.0，荧光探针的浓度为4mg/mL，ATP的浓度为10mM。从图中可以看出，荧光探针在pH为5.0～9.0时，荧光强度基本不变，说明pH在此范围内对探针本身以及对探针检测ATP没有影响，是比较合适的pH值范围。这非常有利于该探针用于实际样品中ATP的测定。

实施例7：

荧光探针与ATP作用的响应时间的测定

我们研究了荧光探针对ATP的响应时间，其结果如图7。从图中可以看出，该探针对各种浓度ATP的响应时间均在600s以内，这能够满足在实际样品中进行实时监测的要求。从图7我们还可以看出，荧光强度达到最大值后，在之后的时间里，几乎不再发生变化，这表明此荧光探针光稳定性较好。

实施例8：

荧光探针在活细胞中的应用

首先，我们做了细胞毒性试验，如图8所示。当加入0～100μg/mL荧光探针，细胞的成活率均在90％以上。这可以说明，该荧光探针毒性较小，可应用于检测活细胞内的ATP。然后，我们研究荧光探针在活细胞中的应用，选择HeLa细胞进行共聚焦显微成像，结果如图9所示。在对照组细胞中，几乎没有观察到荧光。然后细胞中加入探针(100μg/mL)，可以观察到强烈荧光，说明荧光探针与细胞中的ATP作用，产生了荧光。当在细胞中加入ATP清除剂三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)预处理，再加入探针，发现细胞内荧光几乎消失。这些结果说明该探针能够检测到细胞内ATP含量的变化，为监控活细胞内ATP水平的动态波动提供了一种可靠的手段。

Claims (3)

1.一种基于ZIF材料的近红外纳米荧光探针，其结构是由纳米级别的沸石咪唑类金属有机框架ZIF-90以及其内部包裹近红外荧光染料CP构成。

2.根据权利要求1所述的一种基于ZIF材料的近红外纳米荧光探针的制备方法，其特征在于，反应步骤如下：

将100当量的咪唑-2-甲醛和1当量的近红外荧光染料CP加入10mL离心管中，滴加1～5mLN,N-二甲基甲酰胺使其完全溶解；将50当量的二水合乙酸锌加入5mL离心管中，滴加1～5mLN,N-二甲基甲酰胺使其完全溶解，再将5mL离心管中的溶液倒入10mL离心管内；然后，把离心管放入超声波清洗机中振荡5min，再滴加5～10mLN,N-二甲基甲酰胺，继续超声振荡10～20min；接着，将所得到的悬浊液进行离心分离，用无水乙醇冲洗固体3～5次，直至上清液无明显颜色；最后，将所得到的固体放入真空干燥箱中，在25℃下干燥24小时，得到浅绿色固体，即为荧光探针。

3.根据权利要求1所述的一种基于ZIF材料的纳米荧光探针的应用，其特征在于，所述纳米荧光探针应用于活细胞内三磷酸腺苷的近红外荧光成像检测。

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