CN115594672A - 一种亚甲基蓝类近红外荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
Description
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域,具体涉及一种亚甲基蓝类近红外荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
次氯酸(HClO)是生物体内一种重要的活性氧物种,主要由过氧化氢和氯离子在髓过氧化酶(MPO)催化反应下产生,具有抗菌杀菌作用。(文献1:Klebanoff S J,Kettle A J,Rosen H,Winterbourn C C,Nauseef W M.Myeloperoxidase:a front-line defenderagainst phagocytosed microorganisms.J Leukoc Biol.2013;93(2):185-198)。然而,它的异常表达涉及各种氧化应激相关的病理生理过程,如心血管疾病、关节炎和神经退行性疾病。(文献2:Daugherty A,Dunn J L,Rateri D L,Heinecke J W.Myeloperoxidase,acatalyst for lipoprotein oxidation,is expressed in human atheroscleroticlesions.J Clin Invest.1994;94(1):437-444;文献3:Gorrini C,Harris I S,Mak TW.Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy.Nat Rev DrugDiscov.2013;12(12):931-947)。因此,直接、快速、灵敏、选择性地检测生命系统中内源性HOCl对更好地理解HOCl相关的化学生物学至关重要。目前,已有化学发光法、比色法、电化学法和色谱法对HOCl进行检测(文献4:Andina D,Leroux J C,Luciani P.Ratiometricfluorescent probes for the detection of reactive oxygenspecies.Chemistry.2017;23(55):13549-13573)。这些方法具有优异的灵敏度和选择性。然而,这些方法不能满足离体样本中HOCl的无创实时原位成像。
相较于这些现有分析方法,荧光探针由于其制备和操作简单、选择性和灵敏度高、对组织无损、成像保真度高,是检测HClO有效的检测方法。(文献5:Wang J,Ni Y,Shao S.Areversible fluorescence probe for detection of ClO-/AA redox cycle in aqueoussolution and in living cells.Talanta.2016;147:468-472)此外,相较于可见光区的荧光探针,本发明近红外荧光探针可有效避免生物背景荧光干扰,使探针能够获得较高的信噪比,并降低生物样品的光损伤。该探针灵敏性高,选择性强、细胞毒性低,能应用于检测活细胞内HClO水平的变化。
发明内容
本的目的在于提供一种亚甲基蓝类近红外荧光探针,该荧光探针发射在近红外区,可高灵敏度、高选择性的检测HClO,并能对细胞中HClO进行荧光成像。
为实现上述技术目的,本发明所采用的技术方案为:
一种亚甲基蓝类近红外荧光探针的制备方法为,其特征在于,包括以下步骤:
(1)向容器中加入5g亚甲基蓝,并用50mL二氯甲烷将其溶解,将6.63g碳酸钠溶解在50mL水中并逐滴加入到容器中,随后以同样方法将10.89g连二亚硫酸钠溶解在50mL超纯水中,并逐滴加入到容器中,室温下磁力搅拌30分钟后将反应环境转为冰浴,氮气保护下将2.78g三光气溶于25mL二氯甲烷中逐滴加入到容器中,继续搅拌1小时,将所得物质进行柱层析分离提纯,得到化合物MB-COCl,结构式为:
(2)将0.5g化合物MB-COCl和0.35g 5-甲氧基色胺溶解于25mL二氯甲烷中混合均匀,得到混合液,随后将0.44g三乙胺加入上述混合液中,以室温条件搅拌2小时,柱层析分离提纯,得到0.52g浅蓝色固体,即为目标探针。
反应路线如下:
一种亚甲基蓝类近红外荧光探针的应用,用于检测离体细胞中的HOCl。
对空白组细胞不做处理后加探针孵育,观察到较弱的红色荧光;向细胞内分别加入一定量的脂多糖(LPS)、乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)、脂多糖(LPS)和乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)刺激细胞后再加探针孵育,能检测到较强的红色荧光信号。
一种亚甲基蓝类近红外荧光探针的应用,用于区分离体的肝癌细胞和正常细胞。
分别向肝癌细胞HepG2、人脐静脉内皮细胞HUVEC、人正常肝细胞L02、小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7、人肾皮质近曲小管上皮细胞HK-2内加入一定量的HOCl,随后用PBS洗三次后加探针孵育,能观察到探针在HepG2肝癌细胞中荧光要强于HUVEC、L02、RAW264.7、HK-2正常细胞中的荧光。
有益效果
(1)本发明的一种亚甲基蓝类近红外荧光探针在HOCl存在下荧光发生显著变化,可以用于高灵敏度的检测HOCl,该荧光探针的线性范围为1-35μM,检测限为0.24μM。同时,该荧光探针对HClO响应迅速,响应时间在2秒内。并且该近红外荧光探针对HClO表现出很好的选择性,不受H2O2、ONOO-、O2 ·-、Cys、GSH、Hcy、H2S、Na+、Ca2+、K+、Fe2+、Fe3+、Cl-、NO2 -、SO4 2-、HCO3 2-的影响;
(2)与现有的HClO荧光探针相比,该探针能够在复杂体系下专一性的检测HClO的含量,并且具有肝肿瘤细胞靶向性,且合成方法简单,反应快速灵敏,将在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明探针与不同浓度的HClO作用后的荧光光谱图,横坐标为波长,纵坐标为荧光强度,荧光探针的浓度为10μM,HClO浓度依次为:0、5、10、15、20、25、30、35、40μM,荧光激发波长为640nm;
图2为本发明探针对HClO浓度的线性响应图;
图3为本发明探针与HClO的作用机理图;
图4为本发明探针空白组与加入次氯酸组的pH响应荧光光谱。其中a线为纯探针溶液,b线为加入HOCl响应后的溶液;
图5为本发明探针加入不同浓度HClO前后的时间响应荧光光谱,HClO浓度依次为:0、10、20、35μM;
图6为本发明探针对不同干扰分析物的选择性柱状荧光图,F0和F表示探针溶液加入HClO前后的荧光强度;
图7为本发明探针的细胞毒性试验,横坐标为荧光探针的浓度,纵坐标为细胞的存活率;
图8为本发明探针在HepG2细胞中与外源性HClO的荧光成像图;
图9为本发明探针在HepG2细胞中与内源性HClO的荧光成像图;
图10为本发明探针在不同细胞系中与HClO响应的荧光成像图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明,但不限于此。
实施例1
MB-COCl的合成:向圆底烧瓶(250mL)中加入亚甲基蓝(5g,15.63mmol)并用二氯甲烷(50mL)将其溶解,将碳酸钠(6.63g,62.5mmol)溶解在水(50mL)中并逐滴加入到圆底烧瓶中,随后以同样方法将连二亚硫酸钠(10.89g,62.5mmol)溶解在超纯水(50mL)中并逐滴加入到上述圆底烧瓶中,室温下磁力搅拌30分钟后将反应环境转为冰浴,氮气保护下将三光气(2.78g,9.38mmol)溶于二氯甲烷(25mL)中逐滴加入到圆底烧瓶中,继续搅拌1小时。将所得物质进行柱层析分离提纯,得到化合物MB-COCl。
探针MB-MT的合成:将化合物MB-COCl(0.5g,1.44mmol)和5-甲氧基色胺(0.35g,1.87mmol)溶解于二氯甲烷(25mL)后加入到圆底烧瓶(100mL)中,随后将三乙胺(0.44g,4.3mmol)加入上述圆底烧瓶中,以室温条件搅拌2小时,柱层析分离提纯,得到0.52g浅蓝色固体,产率为72.8%。核磁共振氢谱结果下:1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.92(s,1H),7.15(dd,J=11.9,8.8Hz,3H),6.93(s,1H),6.86(s,1H),6.77(d,J=8.7Hz,1H),6.59(d,J=2.6Hz,2H),6.43(d,J=11.4Hz,2H),3.77(s,3H),3.45(q,J=6.5Hz,2H),2.84(s,12H),2.51(s,2H)。核磁共振碳谱结果下:13C NMR(126MHz,CDCl3)δ156.12,154.00,148.91,134.05,131.39,128.50,127.83,127.20,122.99,113.04,112.35,111.78,111.29,110.91,100.46,55.95,46.21,41.18,40.74,25.41,11.28。结果表明,所得产物结构正确。
实施例2
荧光探针与HClO作用的溶液配制
用分析天平精确地称取探针固体10mg,并将其溶于2mL乙醇溶液中,得到浓度为10mM的探针备用溶液。在做分析实验时,根据实验需要再将储备液稀释到特定的浓度。
实施例3
荧光探针与HClO作用的荧光光谱测定
用浓度为10mM,pH为7.4的PBS缓冲溶液作溶剂,测定了荧光探针与HClO作用的荧光光谱,结果如图1。荧光探针的浓度为10μM,HClO的浓度依次为0、5、10、15、20、25、30、35、40μM,激发波长为620nm,收集640-800nm处的荧光发射峰。随着HClO的加入,690nm处荧光发射峰大幅增强,并且随着HClO浓度的增大,探针的荧光强度不断增强。如图2所示,荧光强度跟HClO的浓度呈现线性关系。所用的荧光测定仪器为Hitachi/F-7100荧光分光光度计。图3为荧光探针与HClO作用的机理图。
实施例4
荧光探针与HClO作用的响应pH的测定
用浓度为10mM,pH为4、5、6、7、7.4、8、9、10的PBS缓冲溶液作溶剂,测定了荧光探针与HClO作用的pH响应,从图4中可以看出,不加次氯酸响应的探针在不同的pH环境下荧光强度无大的变化;加入次氯酸响应的探针随着pH的升高荧光强度也升高,荧光强度在pH为7.4时到达顶点而后逐渐降低。说明探针在可以在生理环境下很好的工作。
实施例5
荧光探针与HClO作用的响应时间的测定
为了研究荧光探针对HClO的响应时间,我们考察了荧光探针(10μM)在HClO(0、10、20、35μM)中的荧光光谱的变化情况,其结果如图5。从图中可以看出,该探针对HClO的响应时间不到2s,满足在实际样品中进行实时监测时对响应时间的要求。随着时间增加,690nm处荧光强度基本不变。
实施例6
荧光探针对HClO测定的选择性
在浓度为10μM的荧光探针溶液中加入H2O2、ONOO-、O2 ·-、Cys、GSH、Hcy、H2S、Na+、Ca2 +、K+、Fe2+、Fe3+、Cl-、NO2 -、SO4 2-、HCO3 2-。由图6可以发现,相对于空白测试液,各种分析物的测试液荧光强度均没有明显变化。然而,加入HClO的测试液的荧光强度发生了显著增强。实验结果说明探针对HClO具有良好的选择性。
实施例7
荧光探针在HepG2细胞中的毒性测试
如图7所示,当加入0-40μM探针,细胞的成活率均在80%以上,因此可以说明,该荧光探针毒性较小。
实施例8
探针在HepG2细胞中与外源性HClO的荧光成像研究
将10μM的探针与HepG2细胞孵育20min然后用PBS缓冲溶液清洗细胞3次,分别加入浓度依次为0、5、25、50μM的HClO孵育20min,最后用共聚焦显微镜进行细胞成像。结果如图8所示。只加探针组观察到极为微弱的红色荧光。随着外加HClO浓度的增加,红色通道荧光逐渐增强。实验结果说明探针可以通过共聚焦显微镜检测到HepG2细胞中外源性的HClO。
实施例9
探针在HepG2细胞中与内源性HClO的荧光成像研究
将HepG2细胞分别用LPS(2.5μg/mL)、PMA(2.5μg/mL)、LPS(2.5μg/mL)和PMA(2.5μg/mL)孵育4h,再加入10μM探针孵育20min,清洗细胞后进行成像。结果如图9所示。HepG2细胞与10μM探针孵育20min,红色通道几乎没有荧光;而用LPS和PMA分别孵育细胞4h,再加入10μM探针后,可以明显观察到红色通道的荧光显著增强;当用LPS、PMA一起和探针孵育细胞时,可以看出红色通道的荧光受到明显增强,说明探针能够检测到细胞内源性HClO的变化。
实施例10
图10为探针不同细胞加次氯酸的荧光成像图。从图中可以看出探针在HUVEC、L02、RAW264.7、HK-2四种正常细胞中与HClO的响应很低,而在人肝癌细胞HepG2细胞中与HClO的响应很好,探针在肿瘤细胞中产生的荧光强度远高于正常细胞。验证了褪黑素在筛选细胞中的作用,证实了所述探针的肝癌细胞靶向作用。
需要说明的是,上述实施例仅仅是实现本发明的优选方式的部分实施例,而非全部实施例。显然,基于本发明的上述实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他所有实施例,都应当属于本发明保护的范围。
Claims (4)
2.一种权利要求1所述亚甲基蓝类近红外荧光探针的制备方法为,其特征在于,包括以下步骤:
(1)向容器中加入5g亚甲基蓝,并用50mL二氯甲烷将其溶解,将6.63g碳酸钠溶解在50mL水中并逐滴加入到容器中,随后以同样方法将10.89g连二亚硫酸钠溶解在50mL超纯水中,并逐滴加入到容器中,室温下磁力搅拌30分钟后将反应环境转为冰浴,氮气保护下将2.78g三光气溶于25mL二氯甲烷中逐滴加入到容器中,继续搅拌1小时,将所得物质进行柱层析分离提纯,得到化合物MB-COCl,结构式为:
(2)将0.5g化合物MB-COCl和0.35g 5-甲氧基色胺溶解于25mL二氯甲烷中混合均匀,得到混合液,随后将0.44g三乙胺加入上述混合液中,以室温条件搅拌2小时,柱层析分离提纯,得到0.52g浅蓝色固体,即为目标探针。
3.一种权利要求1所述亚甲基蓝类近红外荧光探针的应用,其特征在于,用于检测离体细胞中的HOCl。
4.一种权利要求1所述亚甲基蓝类近红外荧光探针的应用,其特征在于,用于区分离体的肝癌细胞和正常细胞。
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