CN106967078B

CN106967078B - 一种溶酶体靶向次氯酸荧光探针及其制备和应用

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Publication number: CN106967078B
Application number: CN201710159459.XA
Authority: CN
Inventors: 林伟英; 任明光; 邓贝贝; 周凯
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2017-03-17
Filing date: 2017-03-17
Publication date: 2019-03-15
Anticipated expiration: 2037-03-17
Also published as: CN106967078A

Abstract

本发明提供了一种具有光敏感性质、溶酶体靶向的次氯酸的荧光探针和合成方法及在检测水溶液及溶酶体次氯酸中的应用。所述荧光探针，以荧光素为荧光基团，以2‑硝基苄溴为光敏保护基，以吗啉为溶酶体靶向定位基团。本溶酶体靶向次氯酸荧光探针用于水溶液或生物体系中次氯酸的传感检测，所述的传感检测包含荧光检测和细胞成像。检测样品前需经紫外光照射。检测溶液时，以480nm为激发波长，检测细胞时，激发波长为488nm，均在525nm处有荧光峰值。本溶酶体靶向次氯酸荧光探针的各合成步骤简单，产物提纯简单；对次氯酸反应的专一性强，抗多种干扰物；并引入溶酶体定位基团，具有靶向性，荧光反应时间空间可控，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。

Description

一种溶酶体靶向次氯酸荧光探针及其制备和应用

技术领域

本发明涉及一种快速检测次氯酸的光敏性荧光探针及其制备和在检测溶酶体次氯酸中的应用，属于分析化学技术领域。

背景技术

次氯酸（HClO）属于活性氧的一种，作为一种高效的杀菌剂，在生命的免疫系统中起到重要的作用。细胞内源性的次氯酸主要由白细胞（如单核细胞，嗜酸性细胞，嗜中性粒细胞等）中的髓过氧化物酶系统产生。细胞免疫反应产生可产生次氯酸，但是一旦细胞中次氯酸的浓度发生异常，就会引起包括风湿性关节炎、心血管疾病和癌症在内的多种疾病。在细胞内溶酶体作为一类较为重要的细胞器，次氯酸可以维持溶酶体的氧化-还原的平衡，对溶酶体的功能的稳定起到了十分重要的作用，检测溶酶体内次氯酸对判断机体状态具有重要意义。

可用于选择性检测次氯酸/次氯酸盐的方法有很多，如碘量滴定法、比色法、化学发光法、库仑法、极谱法和辐解法等。然而，这些方法往往比较繁琐，一些工作必须在有机介质或有机/水介质中进行，限制其应用。与传统检测方法相比，荧光探针被认为是生物研究理想的手段，因为荧光检测所需的仪器相对简单，选择性和灵敏度高，检测范围广，响应时间快速，而且检测过程对样品没有破坏，对细胞危害也很小，荧光检测结合显微镜可以提供实时检测。然而，荧光探针现阶段面临的一个关键问题是当荧光探针进入到细胞内后人们就对其失去了控制。当探针遇到分析物后，立即对分析物进行荧光成像，而不能在我们想要的时间和空间内对分析物进行荧光成像。

发明内容

针对目前次氯酸分子荧光探针检测所面临的问题的现状，本专利通过分子结构设计，结合光敏保护基团，并在反应位点增加溶酶体定位基团，提供一种具有光敏感性质、溶酶体靶向的次氯酸的荧光探针并提供一种步骤简单的合成方法。

本发明另一目的是提供该光敏性次氯酸荧光探针在检测水溶液及溶酶体次氯酸中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种溶酶体靶向次氯酸荧光探针，具有如下式（Ⅰ）所示的结构：

式（I）。

所述溶酶体靶向次氯酸荧光探针，简称为Lyso-HClO-UV，以荧光素为荧光基团，以2-硝基苄溴为光敏保护基，以吗啉为溶酶体靶向的定位基团。

所述溶酶体靶向次氯酸荧光探针，在紫外光下，生成具有式（II）的化合物：

式（II）。

所述溶酶体靶向次氯酸荧光探针的合成路线如下：

。

一种上述溶酶体靶向次氯酸荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

（1）将荧光素溶于甲醇，加入过量的80%水合肼，回流5h，蒸出溶剂，柱层析得FLN；

（2）将FLN、邻硝基苄溴和碳酸铯，溶于N, N-二甲基甲酰胺（DMF）中，氮气保护下，反应 3h，得粗品，经萃取、水洗、干燥、蒸出溶剂，柱层析后得FLNph纯品；

（3）将FLNph溶于氯仿，0℃条件滴加溴乙酰溴，滴加完毕，室温反应3-4h，得粗品，经萃取、水洗、干燥、蒸出溶剂，柱层析得FLNphBr纯品；

（4）将FLNphBr、碳酸钾、碘化钾和吗啉溶解在DMF中，室温反应4h，得粗品，经萃取、水洗、干燥、蒸出溶剂，柱层析得化合物Lyso-HClO-UV。

上述溶酶体靶向次氯酸荧光探针的合成方法中，FLN与邻硝基苄溴的摩尔比为1:2~4；FLNph与溴乙酰溴的摩尔比为1:2~4；FLNphBr与吗啉的摩尔比为1:2~4。

上述溶酶体靶向次氯酸荧光探针的合成方法中，步骤（1）回流温度为70℃，步骤（2）反应温度为120℃。

上述溶酶体靶向次氯酸荧光探针的制备方法中，各中间产物柱层析的硅胶颗粒大小为200-300目；步骤（1）中洗脱剂配比为二氯甲烷：甲醇=20:1；步骤（2）中洗脱剂配比为乙酸乙酯：石油醚=1:2；步骤（3）中洗脱剂配比为二氯甲烷：甲醇=15:1；步骤（4）中洗脱剂配比为二氯甲烷：石油醚=1:1。

所述溶酶体靶向次氯酸荧光探针应用于检测次氯酸时，荧光探针本身无荧光或荧光很弱，在365nm紫外光下，生成具有式（II）的化合物，该化合物本身无荧光或荧光很弱；具有式（II）的化合物与次氯酸反应后具有式（III）的化合物，使荧光发生改变，用于定性检测次氯酸。检测次氯酸溶液时，经过紫外光照射后，以波长480nm光进行激发，随着次氯酸含量的逐渐增加，其在525nm处的荧光峰值逐渐增强；检测细胞中次氯酸时，经紫外光照射，激发波长为480nm，在525nm处有荧光峰值。在一定浓度范围内，荧光强度与次氯酸浓度呈线性正相关，从而实现定量测定次氯酸的浓度。该荧光探针可以应用于水溶液或生物体系中次氯酸的传感检测；所述的传感检测包含荧光检测和细胞成像。

本发明具有以下优点：探针的各合成步骤简单，产物提纯简单；对次氯酸反应的专一性强，抗多种干扰物；引入溶酶体定位集团，具有靶向性；通过在荧光探针分子中引入光敏基团，当探针遇到分析物后，不立即产生荧光，在光刺激的条件下才能对分析物进行荧光成像，实现了在特定时间及空间内对靶向目标中次氯酸的快速检测，灵敏度高，检测限低，线性范围广。基于本发明中次氯酸探针的特异性和显著的颜色变化，其可作为显示水溶液中和生物细胞内次氯酸分子存在的专一性指示剂，可进行实时定性检测和含量传感检测。故而，本发明是一种简单，快速，灵敏的次氯酸分子特异性检测试剂，且可在合适的时间和空间内对相应的生物分子进行荧光成像研究，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是实施例1中探针Lyso-HClO-UV的¹H NMR图谱；

图2是探针Lyso-HClO-UV荧光强度随HCLO浓度的变化；

图3是探针Lyso-HClO-UV荧光强度与HCLO浓度的线性关系；

图4是探针Lyso-HClO-UV荧光强度随紫外光照射时间的变化；

图5是探针Lyso-HClO-UV与不同干扰物质荧光强度图谱；

图6是探针Lyso-HClO-UV选择性图谱；

图7是探针Lyso-HClO-UV应用于细胞中外源性HClO的荧光成像。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制，实施例中化合物的号码对应上述方案中化合物。

实施例1 荧光探针Lyso-HClO-UV的合成。

（1）荧光素（3.0 mmol，1.0 g）溶于50 ml甲醇，滴加80%的水合肼（4ml），回流5h，冷却到室温，旋出溶剂，柱层析得纯品FLN，产率80%。

（2）化合物FLN（1.7 mmol，600mg），邻硝基苄溴（5.2 mmol，1.2 g）和碳酸铯（3.4mmol，1.1 g）溶于DMF (3 ml)，氮气保护条件下，室温搅拌6h，然后倒入300ml乙酸乙酯中，300ml水洗三次，无水硫酸钠干燥，过滤，柱层析（乙酸乙酯：石油醚=1：2）得化合物FLNph，产率78%。¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.14 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.83 – 7.78 (m, 5H),7.66 – 7.62 (m, 2H), 7.52 (dd, J = 5.5, 3.1 Hz, 2H), 7.05 – 7.01 (m, 1H),6.93 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 6.73 (dd, J = 8.8, 2.5 Hz, 2H), 6.57 (d, J = 8.7Hz, 2H), 5.50 (s, 4H), 4.53 (s, 2H)。

（3）将化合物FLNph（1 mmol，100 mg）溶于2 ml三氯甲烷中，滴加3-4滴三乙胺，溴乙酰溴200µL溶于1ml氯仿中，0℃条件下缓慢滴加。用TCL板检测反应，反应完全后，用二氯甲烷萃取2次，水洗2-3次，盐水洗1次，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂后得粗产品，柱层析（二氯甲烷/甲醇=15:1）提纯，得化合物FLNphBr，产量为70%。¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ10.15 (s, 1H), 8.15 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.90 (dd, J = 5.7, 2.7 Hz, 1H), 7.81– 7.78 (m, 4H), 7.66 - 7.61 (m, 4H), 7.14 – 7.11 (m, 1H), 6.89 (d, J = 2.4Hz, 2H), 6.74 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 2H), 6.68 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 5.50 (s,4H), 3.73 (s, 2H)。

（4）将化合物FLNphBr（76 mg，0.1mmol），K₂CO₃（45 mg，0.3 mmol），KI微量，溶于2mL DMF中，吗啉（26 mg，0.3 mmol）溶于DMF中加入，室温反应6小时，用TCL板薄层层析检测反应产物，反应完全后，乙酸乙酯萃取，水洗2-3次，无水硫酸钠干燥，旋蒸出溶剂，柱层析的硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为二氯甲烷/石油醚=1:1，得产品Lyso-HClO-UV，产量为75%。¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.62 (s, 1H), 8.15 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.91– 7.88 (m, 1H), 7.83 – 7.76 (m, 4H), 7.68 – 7.62 (m, 4H), 7.14 (dd, J = 5.5,2.9 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 2.5 Hz, 2H), 6.73 (dd, J = 8.8, 2.5 Hz, 2H), 6.67(d, J = 8.8 Hz, 2H), 5.49 (s, 4H), 3.44 – 3.38 (m, 4H), 2.83 (s, 2H), 2.13(d, J = 4.2 Hz, 4H)。

实施例2 荧光探针Lyso-HClO-UV荧光强度随HClO浓度的变化。

取实施例1制备的Lyso-HClO-UV次氯酸荧光探针溶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，制成1mmol/L 储备液。从储备液中取出20uL 加入到5mL 的离心管当中，用0.1mol/L，pH=7.4磷酸盐缓冲溶液（PBS）与DMF体积比为2:1的溶液稀释至4 mL，加入不同当量（0-100µM）的NaClO标准溶液（NaClO 在中性条件下水溶液中即自发产生酸碱平衡移动而产生HClO，下同），在365nm的紫外光下照射10 min，并用480nm为激发波长测量其荧光谱图。荧光光谱如图2 所示。以NaClO浓度为横坐标，以为荧光强度为纵坐标作图，得图3，随着NaClO浓度浓度增加，荧光强度显著增加。由图中数据可知，在0-100µM浓度范围内，荧光强度与NaClO浓度呈线性正相关。

实施例3 荧光探针Lyso-HClO-UV的荧光强度随紫外光照射时间的变化。

从实施例2 中的中荧光探针储备液中取出20μL加入到5mL的离心管当中，用PBS（0.1mol/L，pH=7.4）与DMF体积比为2:1的溶液稀释至4 mL，加入100µM的NaClO标准溶液，经365nm的紫外光照射，于0-330 s内每隔15s，测量其荧光谱图，检测条件如实施例2。随着紫外光照射时间的增长溶液的荧光谱图变化情况，如图4所示，横坐标为波长，纵坐标为相对荧光强度。由图4可见，探针溶液中加入次氯酸后，随着紫外光照射时间的增长，荧光强度逐渐增大。

实施例4 荧光探针Lyso-HClO-UV对不同分子或离子的选择性。

从实施例2中荧光探针储备液中取出20μL加入到5 mL的离心管当中，分别加入等摩尔量的叔丁基过氧化氢（t-butylhydroperoxide），过氧化氢（H₂O₂），一氧化氮（NO），过氧化叔丁基醚（peroxide tert-butyl ether），氢氧根离子（OH^-），亚硝酸根离子（NO₂ ^-），硝酸根离子（NO₃ ^2-），半胱氨酸（Cys），谷胱甘肽（GHS），同型半胱氨酸（Hcy），铜离子（Cu ²⁺），铁离子（Fe³⁺）等竞争分子及金属离子的标准溶液，另取两只试管分别加入等摩尔量的次氯酸钠标准溶液和等量的水（空白对照），30min 后以PBS:DMF (2:1)为溶剂，在365nm的紫外光下照射10 min，以480 nm为激发光，检测溶液的荧光发射光谱变化，结果如图5所示。根据不同竞争分子或离子的荧光强度作图，如图6所示。由图5与图6看可以发现，荧光探针Lyso-HClO-UV对多种竞争分子有较强的抗干扰性；其他金属离子对化合物Lyso-HClO-UV在525nm处的荧光几乎没有影响，而次氯酸溶液的加入使化合物Lyso-HClO-UV在525nm处的荧光显著增强。

实施例5 荧光探针Lyso-HClO-UV对细胞外源性次氯酸荧光成像

将本发明荧光探针Lyso-HClO-UV应用于HeLa细胞中，对外源性的次氯酸进行荧光成像，结果如图7所示。具体操作步骤如下：

a）将5μM荧光探针Lyso-HClO-UV的DMSO溶液加入到育有HeLa细胞的培养液中在二氧化碳培养箱中培养0.5h，加入20μM的次氯酸钠水溶液后，在培养箱中培养10 min，避光保存10 min，用磷酸缓冲液洗涤三次后，明场成像，如图7-（A），可以看到细胞大致的轮廓；

b）将a）中细胞用488 nm激光激发，得到成像图7-（B）；

c）将图7-（A）和图7-（B）叠加，得图像7-（C）；

d）将5μM荧光探针Lyso-HClO-UV的DMSO溶液加入到育有HeLa细胞的培养液中在二氧化碳培养箱中培养0.5h，加入20μM的次氯酸钠水溶液后，在培养箱中培养10 min，用365nm的紫外灯照射10 min，用磷酸缓冲液洗涤三次后，明场成像，如图7-（D），可以看到细胞大致的轮廓；

e）将d）中细胞用488nm激光激发得到成像图7-（E）；

f）将图7-（D）和图7-（E）叠加，得图像7-（F）。

根据图7所示，没有用365 nm紫外光照射的细胞在488 nm的激发下在红通道几乎观察不到荧光发出。然而，另一份通过365 nm的紫外光照射过的细胞，在488 nm的激发光的照射下在红通道能够明显的观察到荧光发射，并能够进行荧光成像。这说明本荧光探针Lyso-HClO-UV可以在紫外光的照射下对外源性的次氯酸进行荧光成像。

Claims

1.一种溶酶体靶向次氯酸荧光探针，具有如下式（Ⅰ）所示的结构：

式（I）。

2.一种如权利要求1 所述的溶酶体靶向次氯酸荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

（1）将荧光素溶于甲醇，加入过量的80%水合肼，回流5h，蒸出溶剂，柱层析得FLN：

；

（2）将FLN、邻硝基苄溴和碳酸铯，溶于N, N-二甲基甲酰胺（DMF）中，氮气保护下，反应3h ，得粗品，经萃取、水洗、干燥、蒸出溶剂，柱层析后得纯品FLNph ：

；

（3）将FLNph 溶于氯仿，0℃条件滴加溴乙酰溴，滴加完毕，室温反应3-4h，得粗品，经萃取、水洗、干燥、蒸出溶剂，柱层析得纯品FLNphBr：

；

（4）将FLNphBr、碳酸钾、碘化钾和吗啉溶解在DMF 中，室温反应4h，得粗品，经萃取、水洗、干燥、蒸出溶剂，柱层析得式（I）所示荧光探针。

3.根据权利要求2 所述的制备方法，其特征在于，FLN 与邻硝基苄溴的摩尔比为1:2~4；FLNph 与溴乙酰溴的摩尔比为1:2~4；FLNphBr 与吗啉的摩尔比为1:2~4。

4.根据权利要求2 所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）回流温度为70℃，步骤（2）反应温度为120℃。

5.根据权利要求2 所述的制备方法，其特征在于，各中间产物柱层析的硅胶颗粒大小为200-300 目；步骤（1）中洗脱剂配比为二氯甲烷：甲醇=20:1；步骤（2）中洗脱剂配比为乙酸乙酯：石油醚=1:2；步骤（3）中洗脱剂配比为二氯甲烷：甲醇=15:1；步骤（4）中洗脱剂配比为二氯甲烷：石油醚=1:1。