CN109851622B

CN109851622B - 一种靶向溶酶体的次氯酸根荧光探针

Info

Publication number: CN109851622B
Application number: CN201910057416.XA
Authority: CN
Inventors: 曹笃霞; 朱奕霖; 宫相硕; 邢苗苗
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2019-01-22
Filing date: 2019-01-22
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2039-01-22
Also published as: CN109851622A

Abstract

本发明公开了一种新型靶向溶酶体的荧光素类次氯酸根荧光探针及其制备方法和应用，该探针以吗啉结构作为溶酶体的靶向基团，属于分子探针技术领域。该探针的分子式为C₃₁H₂₅N₃O₅，具有如下所示结构:

Description

一种靶向溶酶体的次氯酸根荧光探针

技术领域

本发明涉及一种新型荧光素类次氯酸根荧光探针的制备及应用，属于有机小分子荧光探针领域。

背景技术

活性氧（ROS）是生物代谢过程的产品，已知次氯酸（HOCl）/次氯酸盐（ClO-）是生物学上重要的活性氧物之一。次氯酸（HOCl）是由髓过氧化物酶（MPO）催化过氧化氢和氯离子的过氧化反应产生的，主要定位于白细胞，包括中性粒细胞，巨噬细胞和单核细胞。此外，如果产生HOCl过剩，它可能导致HOCl与脂肪酸，胆固醇，RNA，DNA和蛋白质的反应，然后它会破坏宿主组织并导致许多疾病，例如阿兹海默症，关节炎，肾病，肺损伤，心血管疾病，哮喘甚至癌症。此外，HOCl是复杂细胞环境中参与细胞代谢的高活性和短寿命物种。因此，非常需要用于响应HOCl的实时和灵敏的分析技术来解释重要生物过程中的HOCl功能，所以本发明设计了一种新型靶向溶酶体检测次氯酸根的荧光探针。

近几年，已经报道了几种用于次氯酸根检测的方法，例如分光光度法，电位法，电分析和荧光探针用于HClO的分析，但是由于操作复杂，成本高昂，以及对生物组织有破坏性因而并不实用。此外，荧光探针作为近年来的优秀检测工具，由于其高灵敏度，优异的选择性和实时分析，已成为生物系统中感知生物分子的有吸引力的方法，因此荧光探针技术比其他方法更有优势。

目前为止，次氯酸根荧光探针仍存在探针在细胞中成像能力不明显、检测信号不够灵敏、响应时间长等缺点以及当今对溶酶体靶向定位的次氯酸荧光探针并不多。基于上述问题，开发新型能够可以实时检测次氯酸根的荧光探针，在水体系及生物环境中检测次氯酸根具有重要的研究价值。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种新型靶向溶酶体的检测次氯酸根的荧光探针。

一种靶向溶酶体的次氯酸根荧光探针，探针分子式为C31H25N3O5，简称FCMB，如式（I）所示的结构：

。

（I）

上述荧光探针的制备方法采用以下步骤：（1）将罗丹明衍生物a与水合肼溶于甲醇中，80℃-90℃条件下反应8-10h，待冷却至室温，减压除去溶剂，得到粗产物；

（2）将得到的粗产物用甲醇和二氯甲烷重结晶得到黄色固体化合物1，其结构式如下：

；

（3）将化合物1与4-（4-吗啉基）苯甲醛溶于甲醇中，90-100℃条件下反应4-10h，得到式（I）所示化合物，

所述罗丹明衍生物a结构为：

。

其中，所述步骤（1）中，荧光素与水合肼的摩尔比为1 ：2.0－4.0。

其中，所述步骤（2）中，重结晶所用的甲醇和二氯甲烷体积比为1：2.0－4.0。

其中，所述步骤（3）中，化合物1与4-（4-吗啉基）苯甲醛的摩尔比为1 ：1.0－1.2。

具体反应方程如下：

。

上述的荧光探针主要用于检测生物组织和环境中的次氯酸。

其中，所述的检测方法为荧光淬灭。

以上，所述的激发波长为370nm，发射波长为510nm。

本发明的有益效果：

1.本发明的次氯酸根荧光探针对次氯酸根检测的选择性高，灵敏度高，

2.本发明的制备方法较简单，制备的产品产率高;

3. 反应效果明显，在纯缓冲溶液或者纯PBS条件下，次氯酸根荧光探针随着次氯酸浓度提高，变为无色;

4. 响应速度快，5秒钟内可检测出荧光淬灭信号。

附图说明

图1为本发明探针随次氯酸浓度变化而变化的荧光光谱图，探针浓度10 μM。

图2为本发明探针对常见的金属离子、阴离子、生物硫醇的选择性。

图3为本发明探针应用于细胞内次氯酸根的检测。

图4为本发明探针靶向溶酶体实验。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。实施例中所用原料如无特殊说明均为常规市场购产品。

实施例1 化合物1的制备

在氮气保护下，称取0.66 g荧光素置于30 mL甲醇溶液中，待完全溶解后，缓慢加入2.5 mL的水合肼溶液，将温度提升至85℃在此条件下回流9 h，反应体系变为澄清的淡黄色液体，减压去除溶剂得到粗产物，将粗产物放入甲醇和二氯甲烷（v:v = 1：3）的40 mL混合溶剂中重结晶，最终得到黄色固体化合物1。得产物：0.50 g （73%）。

实施例2 本发明所述探针的制备

在氮气保护下，将0.50g 化合物1溶于40 mL甲醇中，升温至95℃使其完全溶解，随后将称取好的0.38 g 4-（4-吗啉基）苯甲醛倒入反应体系中，之后加入2滴冰醋酸，在95℃条件下反应9 h，反应完全后得到大量黄色沉淀，过滤，用甲醇反复洗涤数次得到目标化合物FCMB：0.79 g，76%。

以1 H NMR对其进行表征，数据如下：

1 H NMR (DMSO-d6, 400 MHz), δ(ppm): 3.13-3.15 (m, 4H), 3.68-3.70 (m,4H), 6.43-6.49 (m, 4H), 6.64 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 6.89 (d, J = 8.8 Hz, 2H),7.11 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 7.56-7.63 (m, 2H), 7.88(d, J = 6.4 Hz, 1H), 8.93 (s, 1H), 9.90 (s, 2H). 13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz),δ (ppm): 47.85, 65.75, 66.31, 100.00, 102.85, 110.87, 112.67, 114.73, 123.44,124.18, 125.06, 128.52, 129.47, 129.99, 134.08, 150.74, 150.84, 152.74,152.91, 158.93, 163.66. HRMS m/z: calcd for C31H25N3O5 [M+H]+: 520.18; found:520.19.

实施例3 本发明所述探针对溶液中次氯酸根浓度改变的检测

在磷酸缓冲溶液2 mL中，加入初始浓度为1 mM荧光探针20 μL，使得溶液中荧光探针浓度为10 μM。然后，依次加入0 μM、2 μM、4 μM、6 μM、8 μM、10 μM、12 μM不同浓度的次氯酸根溶液，用荧光光谱仪测试不同次氯酸根浓度条件下的荧光光谱，结果如图1所示。由图1可知，随着次氯酸根的浓度增加，在510 nm波长下的荧光强度逐渐降低，说明荧光探针可以非常明显的淬灭型识别次氯酸根。

实施例4 本发明所述探针对次氯酸根的选择性

如实施例3所述，在同样测试条件下，向溶液中加入常见的金属离子、阴离子、生物硫醇，测试加入不同金属离子、阴离子、生物硫醇之后的荧光光谱。结果表明本发明所述的探针对次氯酸根具有良好的选择性，结果如图2所示。(1): Ag+，(2)：Cu2+，(3)：Fe3+，(4)：Hg2+，(5): Ni2+，(6): Zn2+，(7): Al3+，(8): Mg2+，(9): Co2+，(10): Cd2+，(11)：Pd2+，(12): F-，(13)：Cl-，(14): Br-，(15)：I-，(16)：CO32-，(17)：SO42-，(18)：PO43-，(19)：SCN-，(20)：SO32-，(21)：HSO3-，(22)：CN-，(23): H2O2，(24)：GSH，(25)：Hcy，(26)：Cys，(27)：ClO-. Conditions：[HOCl] = 12 μM，[other ions] = 20 μM。

实施例5 本发明探针应用于细胞内的次氯酸根的检测

实验组：将Hela细胞用10 μM的探针孵育30分钟，随后加入外源性的次氯酸根2μM；细胞分别用PBS洗三遍，使用激光共聚焦显微镜进行荧光成像，收集500-550 nm的荧光。

对照组：将Hela细胞用10 μM的探针孵育30分钟；细胞分别用PBS洗三遍，使用激光共聚焦显微镜进行荧光成像，收集500-550 nm的荧光，收集绿色通道荧光，结果见图3。

实施例6

将Hela细胞用10 μM的探针孵育30分钟，随后在无血清培养基中加入溶酶体标记物Lyso Tracker Deep继续孵育5分钟。细胞分别用PBS洗3遍，使用激光共聚焦显微镜进行荧光成像，收集本发明探针(FCMB)和Lyso Tracker Deep的荧光照片。然后进行叠加分析，见图4。

Claims

1.一种靶向溶酶体的次氯酸根荧光探针，其特征在于，所述的荧光探针具有如式（I）所示的结构：

。

2.一种权利要求1所述的靶向溶酶体的次氯酸根荧光探针的制备方法，其特征在于，采用以下步骤：（1）将罗丹明衍生物a与水合肼溶于甲醇中，80℃-90℃条件下反应8-10h，待冷却至室温，减压除去溶剂，得到粗产物；

；

（3）将化合物1与4-（4-吗啉基）苯甲醛溶于甲醇中，90-100℃条件下反应4-10h，得到式（I）所示化合物；

所述的罗丹明衍生物a为

。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，罗丹明衍生物a与水合肼的摩尔比为1 ：2.0－4.0。

4.根据权利要求2所述的制备方法，所述步骤（2）中，重结晶所用的甲醇和二氯甲烷体积比为1：2.0－4.0。

5.根据权利要求2所述的制备方法，所述步骤（3）中，化合物1与4-（4-吗啉基）苯甲醛的摩尔比为1 ：1.0－1.2。

6.一种权利要求1所述的靶向溶酶体的次氯酸根荧光探针的应用，其特征在于，用于制备检测环境中的次氯酸根的试剂。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的检测的方法为荧光淬灭。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的荧光探针的激发波长为370nm，发射波长为510nm。