CN109400616B - 一种二氧化硫衍生物荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速、高选择性检测二氧化硫衍生物的荧光探针，其结构式如式(I)，该探针合成快速简单，并且产率较高；本发明探针实现了水溶液和活细胞水平中二氧化硫衍生物的高选择性即时检测，并且能避免杂质离子的干扰；对研究二氧化硫衍生物的生理病理作用有重要意义。

Description

一种二氧化硫衍生物荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于有机小分子荧光探针的制备技术领域，具体涉及一种二氧化硫衍生物荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
二氧化硫是空气污染气体之一，也是继一氧化碳，一氧化氮，硫化氢以后的第四种生物信号分子，溶于水极易形成亚硫酸盐和亚硫酸氢盐，这类亚硫酸盐能够抗氧化，抑制细菌生长，防止酶促褐变，在食品加工中常用作漂白剂，防腐剂和抗氧化剂。但是摄入高剂量的亚硫酸盐会引起人体腹泻，低血压，过敏，气喘等不良反应，甚至还与肺癌，心血管疾病和神经系统疾病有关。这可能与亚硫酸根或亚硫酸氢根在体内发生亲核反应有关，但是在体内具体的生理作用还不甚清楚，因此，发明一种方便检测生理环境中二氧化硫衍生物含量的方法具有重要的现实意义。
目前外源性检测二氧化硫衍生物的方法有很多，包括化学电位法，氧化还原滴定法，荧光分析法。在这些检测方法中，荧光探针方法以其简便性、高时空分辨能力、高选择性、高灵敏度、低检出限、适用于实时检测的特点受到广泛关注。因此近年来二氧化硫衍生物光学探针发展迅速，此类荧光探针包括酰丙酮酸酯的加成、醛基加成、其他双键的麦克尔加成、C＝N键异构化，但此类化合物的探针选择性差，易受生物体内其它亲和物质影响，成了阻碍二氧化硫衍生物检测发展的关键问题。因此发展一种简便、快速的高选择性二氧化硫衍生物含量检测方法是十分必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能高选择性快速检测二氧化硫衍生物的增强型荧光探针，简称探针Probe-SO2；并进一步提供了该探针的制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种荧光探针，其结构式如下式(I)：
Figure BDA0001852272180000021
本发明还要求保护所述荧光探针的合成方法，其合成路线如下：
Figure BDA0001852272180000022
优选的，所述荧光探针的合成方法，具体步骤如下：
(1)化合物1的制备：将原料4-(二乙氨基)水杨醛和3-溴丙炔混合后，用DMF溶解，随后加入K2CO3，然后在室温搅拌条件下反应10小时；反应完成后将反应液用饱和食盐水洗涤，再用二氯甲烷萃取，用旋转蒸发仪蒸干，之后用层析硅胶柱分离提纯得化合物1；
(2)化合物2的制备：将步骤(1)制备的化合物1和对氨基苯乙酮混合后，用DMF溶解，然后加入催化剂氯化亚铜，在氮气保护下搅拌条件反应10小时，反应完成后将反应液用饱和食盐水洗涤，再用二氯甲烷萃取，用旋转蒸发仪蒸干，之后用层析硅胶柱分离提纯得化合物2；
(3)荧光探针Probe-SO2的合成：将DMF加入圆底烧瓶中，并将其置于在冰水浴中，然后将三氯氧磷在氮气保护下逐滴加入DMF中，制得维斯迈尔试剂，之后将步骤(2)制备的化合物2用DMF溶解并用滴液漏斗缓慢加入维斯迈尔试剂中，在0摄氏度冰水浴30分钟后，将反应液升温至45摄氏度继续反应2小时，反应完成后将反应液用饱和食盐水洗涤，再用二氯甲烷萃取，用旋转蒸发仪蒸干，再用层析硅胶柱分离提纯得探针Probe-SO2。
优选的，步骤(1)中4-(二乙氨基)水杨醛和3-溴丙炔混合后，用5ml DMF溶解，随后加入K2CO3，原料4-(二乙氨基)水杨醛、3-溴丙炔和K2CO3用量的质量比例是1.37:1:1.07。
优选的，步骤(2)中将步骤(1)制备的化合物1和对氨基苯乙酮混合后，用DMF溶解，然后加入催化剂氯化亚铜，在氮气保护下搅拌条件反应10小时，原料化合物1、对氨基苯乙酮和氯化亚铜用量的质量比例是6.8:4:1。
优选的，步骤(3)中将三氯氧磷在氮气保护下逐滴加入DMF中，制得维斯迈尔试剂，将化合物2用DMF溶解并缓慢加入维斯迈尔试剂中继续反应两个小时，原料三氯氧磷、DMF和化合物2用量分别为1.5ml、2ml和34.6mg。
另外，本发明还要求保护所述荧光探针的用途，所述荧光探针用于检测水环境中的二氧化硫衍生物和生物样品的二氧化硫衍生物。包括用于检测水溶液和活细胞中的二氧化硫衍生物。
其中，所述用途的具体检测方法为：
(1)将探针溶于乙醇，制成探针母液；
(2)将探针母液加入到待测液或生物样品中；
(3)用荧光光谱仪测试待测液的荧光光谱，观测在525nm处的荧光峰值的变化以确定是否含二氧化硫衍生物，如果峰值变大，则说明含有二氧化硫衍生物；或者用激光共聚焦显微镜，使用激发波长为405nm的光源激发收集480-580nm范围的荧光，观察是否有绿色荧光以确定是否含二氧化硫衍生物，观察到绿色荧光，则说明含有二氧化硫衍生物。
首先，水溶液中的二氧化硫衍生物可以引起荧光探针的荧光光谱变化，因此，可以通过观察荧光光谱仪中光谱的变化程度判断溶液中的二氧化硫衍生物含量，从而定量检测；其检测下限为75nM。其次，通过激光共聚焦显微镜对孵育了荧光探针和二氧化硫衍生物的活细胞进行荧光成像，观察绿色通道荧光信号的变化以达到区分检测生物环境中二氧化硫衍生物的目的。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果为：
(1)探针合成快速简单，产率较高，通过维斯迈尔快速引入卤素和醛基双重淬灭基团，实现了探针背景荧光的双重淬灭，有效的降低了其他试剂的干扰；
(2)本发明实现了水溶液中二氧化硫衍生物的高选择性即时检测；
(3)本发明实现了活细胞水平中二氧化硫衍生物的快速检测，对二氧化硫衍生物的响应时间为5秒左右；
(4)本发明的二氧化硫衍生物荧光探针，能抗硫化氢、碳酸根、碳酸氢根、氯离子、谷胱甘肽、半胱氨酸、硝酸根、过氧根、钙离子、单线态氧、次氯酸根、烯丙基硫醇、硫代氨基脲和硫酸根的干扰；
(5)利用本发明的探针，采用激光共聚焦显微镜检测二氧化硫衍生物时，可以减少对生物样品的破坏。
附图说明
图1是实施例1中化合物1的1H NMR图谱；
图2是实施例1中化合物1的13C NMR图谱；
图3是实施例1中化合物2的1H NMR图谱；
图4是实施例1中化合物2的13C NMR图谱；
图5是实施例1中探针Probe-SO2的1H NMR图谱；
图6是实施例1中探针Probe-SO2的13C NMR图谱；
图7是实施例2中探针随不同量二氧化硫衍生物的加入荧光谱图的变化情况；
图8是实施例3中探针与二氧化硫衍生物随时间变化的525nm处荧光强度值变化图；
图9是实施例4中探针对不同干扰分析物的选择性柱状荧光数据图；
图10是实施例5中探针与HeLa细胞中二氧化硫衍生物响应的荧光成像图。
具体实施方式
实施例1
一种荧光探针的合成方法，具体步骤如下：
(1)化合物1的合成：
Figure BDA0001852272180000061
取960mg 4-(二乙氨基)水杨醛(分子式为：C11H15NO2)(5mmol)和700mg 3-溴丙炔(分子式为：C3H3Br)(5.8mmol)于圆底烧瓶中，加入DMF使之完全溶解，随后加入750mg碳酸钾(分子式为：KCO3)，在氮气保护和常温下搅拌10小时，反应完毕，将反应液用50mL食盐水洗涤三次，并用二氯甲烷萃取，通过旋转蒸发仪减压蒸馏将溶剂(二氯甲烷)除去得到粗产品。以二氯甲烷与石油醚为洗脱剂，按体积比1:10到1:2进行梯度洗脱，用硅胶(200-300目)层析柱进行纯化，得到806mg白色固体(产率为：74.6％)。1H NMR谱如图1，13C NMR如图2。1HNMR(400MHz,CDCl3)10.13(s,1H),7.73(d,J＝8.9Hz,1H),6.33(dd,J＝8.8Hz,1H),6.23(d,J＝2.3Hz,1H),4.80(d,J＝2.4Hz,2H),3.43(q,J＝7.1Hz,4H),2.58(t,J＝2.4Hz,1H),1.23(t,J＝7.1Hz,6H).13C NMR(100MHz,CDCl3)185.92,160.99,152.53,129.64,113.62,104.08,93.37,77.26，75.15,55.09,43.94,11.60.MS(ESI)m/z＝231.1[M]+。
(2)化合物2的合成：
Figure BDA0001852272180000071
取231mg化合物1(分子式为：C13H15NO2)(1mmol)和对氨基苯乙酮135mg(分子式为：C8H9NO)(1mmol)于圆底烧瓶中，加入DMF使反应物完全溶解，随后加入催化剂氯化亚铜34mg(0.3mmol)，在110摄氏度和搅拌条件下搅拌反应2小时。反应完毕后，将反应液用50mL食盐水洗涤三次，并用二氯甲烷萃取，通过旋转蒸发仪减压蒸馏将溶剂(二氯甲烷)除去得到粗产品。以二氯甲烷与石油醚为洗脱剂，用硅胶(200-300目)层析柱进行纯化，按体积比1：10-1：3梯度洗脱，得到126mg橙红色固体固体(产率为36％)。所得橙红色固体即为化合物2。1HNMR谱如图3，13C NMR如图4。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.37-8.26(m,2H),8.17(dd,J＝8.8,1.9Hz,1H),8.12-8.04(m,1H),7.82(s,1H),6.51(dd,J＝9.0,2.5Hz,1H),6.22(d,J＝2.5Hz,1H),5.28(s,2H),3.49-3.36(q,J＝7.1Hz,4H),2.70(s,3H),1.22(t,J＝7.1Hz,6H).13C NMR(100MHz,CDCl3)197.40,159.65,151.82,133.28,131.62,129.36,128.74,127.90,127.35,125.40,107.20,98.01,68.41,44.67,26.70,12.71.MS(ESI)m/z＝346.4[M]+.HRMS(ESI)Calcd for C22H22N2O2([M]+):346.1715,Found,346.1718。
(3)探针Probe-SO2的合成：
Figure BDA0001852272180000081
吸取2mL DMF于圆底烧瓶中，并用冰水冰浴，在氮气保护下，用滴液漏斗将1.5mL三氯氧磷缓慢加入圆底烧瓶中，直至产生白色固体，生成维斯迈尔试剂，称量34.6mg化合物2并用DMF溶解，用滴液漏斗将其缓慢加入制得的维斯迈尔实际中，氮气保护下0摄氏度反应30分钟，升温至45摄氏度反应2小时，反应完毕，将反应液用50mL食盐水洗涤三次，并用二氯甲烷萃取，通过旋转蒸发仪减压蒸馏将溶剂(二氯甲烷)除去得到粗产品。以二氯甲烷与石油醚为洗脱剂，按体积比1:3-1:0梯度洗脱，用硅胶(200-300目)层析柱进行纯化，得到15mg橙红色固体(产率为：38％)。1H NMR谱如图5，13C NMR如图6。1H NMR(400MHz,CDCl3)10.20(d,J＝6.8Hz,1H),8.22(d,J＝8.9Hz,1H),8.11(d,J＝2.1Hz,1H),8.00(d,J＝8.7Hz,1H),7.84(dd,J＝9.0,2.2Hz,1H),7.73(s,1H),6.74(d,J＝6.8Hz,1H),6.45(dd,J＝9.0,2.4Hz,1H),6.16(d,J＝2.4Hz,1H),5.22(s,2H),3.35(t,J＝7.1Hz,4H),1.16(q,J＝7.1,5.8Hz,6H).13CNMR(100MHz,CDCl3)190.38,158.84,150.58,130.24,126.71,125.66,125.10,124.74,123.14,106.19,96.99,67.38,43.65,11.68.MS(ESI)m/z＝393.1[M]+.HRMS(ESI)Calcdfor C23H22ClN2O2([M]+):393.1370,Found,393.1355。
实施例2
荧光探针Probe-SO2的应用：
取实施例1制备的探针溶于乙醇中，制成浓度为1mmol/L的探针母液，将10.4mg(0.1mmol)亚硫酸氢钠固体溶于10mL的去离子水中，得到浓度为10mmol/L的二氧化硫衍生物母液。从探针母液中取出30μL加入到5mL的离心管当中，加入不同当量(0-100eq)的二氧化硫衍生物母液(所述当量是指二氧化硫衍生物母液中二氧化硫衍生物的摩尔数相对于探针母液中探针的摩尔数的倍数)，用不同体积的PBS水溶液(浓度25mmol/L，pH 7.4)稀释至3mL，配置成探针浓度为10μmol/L，含1％乙醇的测试溶液。用荧光光谱仪测试探针与不同当量二氧化硫衍生物反应液的荧光光谱变化(激发波长为415nm)，荧光光谱变化情况如图7所示；
由图7可见，随着二氧化硫衍生物加入当量的逐渐增加，探针溶液在525nm处的荧光峰值逐渐增强。当荧光强度达到最大值时，比探针空白液的荧光强度增强接近10倍。实验结果说明探针可以通过荧光光谱仪检测水溶液中二氧化硫衍生物。
实施例3
荧光探针Probe-SO2的应用：
从实施例2中荧光探针母液中取出30μL加入到5mL的离心管当中，加入30μL浓度为100mmol/L的二氧化硫衍生物母液，再用3ml PBS水溶液(浓度25mmol/L，pH 7.4)稀释至3mL，配制成探针浓度为10μmol/L，含1％乙醇的测试液。用525nm的激发波长，测试其随时间变化的荧光光谱。由图8可见随着时间增加，525nm处的荧光强度逐渐变大，并且在5秒钟内达到最大值。
实施例4
探针Probe-SO2对不同干扰分析物的选择性研究：
从实施例2中荧光探针母液中取出30μL加入到5mL的离心管当中，分别加入以下不同浓度的分析物：二氧化硫衍生物、硫化氢、碳酸根、碳酸氢根、氯离子、谷胱甘肽、半胱氨酸、硝酸根、过氧根、钙离子、单线态氧、次氯酸根、烯丙基硫醇、硫代氨基脲和硫酸根。用不同体积的PBS水溶液(浓度25mmol/L，pH 7.4)稀释至3mL，配置成探针浓度为10μmol/L，含1％乙醇的测试溶液。如图9，加入各种生物相关试剂测试荧光强度几乎没有变化。然而，加入二氧化硫衍生物的测试液的荧光强度发生了显著增强。实验结果说明探针Probe-SO2对二氧化硫衍生物具有良好的选择性。
实施例5
荧光探针与细胞中二氧化硫衍生物的荧光成像：
将HeLa细胞培养在培养基中，并在37摄氏度，5％二氧化碳恒温培养箱中培养，待细胞状态良好，转移至35mm激光共聚焦皿中培养，保证细胞密度为4.5*104用于荧光成像。分成三组，将培养皿用PBS洗涤三次，分别加入1mLPBS，加入实施例2 10ul探针母液，一组为空白对照，一组加入实例2二氧化硫衍生物母液10ul，一组加入GSH母液10ul，用激光共聚焦显微镜，使用激发波长为405nm的光源激发，收集480-580nm范围的荧光；如图10，加入亚硫酸氢钠和GSH都观察到绿色荧光，则说明含有二氧化硫衍生物。此探针可用于细胞外源性和内源性二氧化硫衍生物的荧光成像。
最后需要说明的是：以上实施例不以任何形式限制本发明。对本领域技术人员来说，在本发明基础上，可以对其作一些修改和改进。因此，凡在不偏离本发明精神的基础上所做的任何修改或改进，均属于本发明要求保护的范围之内。

Claims (6)

1.一种荧光探针用于检测水环境中的二氧化硫衍生物的应用，其特征在于，所述荧光探针的结构式如下式(I)：
Figure FDA0002988643280000011
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，具体检测方法为：
(1)将所述荧光探针溶于乙醇，制成探针母液；
(2)将所述探针母液加入到待测液中；
(3)加入二氧化硫衍生物后，用荧光光谱仪观察含有所述荧光探针的待测水环境的荧光光谱的变化。
3.一种荧光探针Probe-SO2的合成方法，其特征在于，所述荧光探针Probe-SO2的结构式如下：
Figure FDA0002988643280000012
其中，所述荧光探针Probe-SO2的合成路线如下：
Figure FDA0002988643280000013
Figure FDA0002988643280000021
所述荧光探针Probe-SO2的具体合成步骤如下：
(1)化合物1的制备：将原料4-(二乙氨基)水杨醛和3-溴丙炔混合后，用DMF溶解，随后加入K2CO3，然后在室温搅拌条件下反应10小时；反应完成后将反应液用饱和食盐水洗涤，再用二氯甲烷萃取，用旋转蒸发仪蒸干，之后用层析硅胶柱分离提纯得化合物1；
(2)化合物2的制备：将步骤(1)制备的化合物1和对氨基苯乙酮混合后，用DMF溶解，然后加入催化剂氯化亚铜，在氮气保护下搅拌条件反应10小时，反应完成后将反应液用饱和食盐水洗涤，再用二氯甲烷萃取，用旋转蒸发仪蒸干，之后用层析硅胶柱分离提纯得化合物2；
(3)荧光探针Probe-SO2的合成：将DMF加入圆底烧瓶中，并将其置于在冰水浴中，然后将三氯氧磷在氮气保护下逐滴加入DMF中，制得维斯迈尔试剂，之后将步骤(2)制备的化合物2用DMF溶解并用滴液漏斗缓慢加入维斯迈尔试剂中，在0摄氏度冰水浴30分钟后，将反应液升温至45摄氏度继续反应2小时，反应完成后将反应液用饱和食盐水洗涤，再用二氯甲烷萃取，用旋转蒸发仪蒸干，再用层析硅胶柱分离提纯得荧光探针Probe-SO2。
4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，步骤(1)中原料4-(二乙氨基)水杨醛、3-溴丙炔和K2CO3的质量比为1.37:1:1.07。
5.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，步骤(2)中化合物1、对氨基苯乙酮和氯化亚铜的质量比为6.8:4:1。
6.根据权利要求3-5任一项所述的合成方法，其特征在于，步骤(3)中三氯氧磷、DMF和化合物2用量分别为1.5ml、2ml和34.6mg。
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