CN109053711A - 一种用于汞离子检测的探针化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于汞离子检测的探针化合物及其制备方法和应用。所述用于汞离子检测的探针化合物其化学结构式如式(I)所示,简称为DCM‑Hg。本发明中用于汞离子检测的探针化合物的制备方法具有反应条件温和,产量较高等优点。该化合物DCM‑Hg可实现对汞离子的高灵敏、高选择性荧光检测,同时伴随明显的比色现象,也可实现简单有效的比色检测。该化合物DCM‑Hg不仅能定量检测环境水样中的汞离子,还能定性检测活细胞中汞离子。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域,具体涉及一种可用于汞离子检测的比色/近红外荧光探针的制备方法及其在环境和生物领域中的应用。
背景技术
随着人们生活水平和健康安全意识的提高,重金属离子污染越来越引起人们的广泛关注。汞离子作为一种毒害作用最强的重金属离子,它可以通过细菌代谢转化为毒性更强的甲基汞,然后经过食物链富集于有机体中。一旦进入人体内,即使低浓度的汞离子也会诱导一系列严重的健康问题,诸如肾功能衰竭,水俣病,运动神经疾病等。研究表明,汞离子具有很强的亲硫性,与蛋白质和酶中的巯基作用后,会引起蛋白质和酶失活,使细胞代谢功能失调,最终导致机体病变。汞污染具有易转移和高度的富集性等特性,它已成为困扰全世界的难题之一。因此,发展有效、可靠的方法来检测环境及生物系统的重金属汞离子具有十分重要的意义。
过去十来年,研究者发展了一些检测汞离子的方法,主要包括高效液相色谱法、毛细管电泳法、原子吸收光谱法、原子发射光谱法、紫外可见分光光度法、电化学法和电感耦合等离子质谱法。然而,这些方法需要复杂的样品预处理以及昂贵的仪器设备,且大多不能够用于活体中目标分析物的检测。相比之下,荧光分析技术具有操作便捷、灵敏性和选择性高、可用于高分辨活体成像等优点,因此备受广大研究者们的追捧。到目前为止,许多可用于汞离子检测的荧光探针被报道了,其识别机制,主要分为两大类:①基于汞离子亲硫特性的络合型探针;②基于汞离子催化特性的反应型探针。众所周知,汞离子与具有孤对电子的杂原子如硫、氮和氧作用形成络合物。络合型探针在与汞离子配位前后,探针分子的电子云结构发生明显变化,导致荧光增强或者淬灭。这类探针对汞离子检测的灵敏度比较高,然而选择性不尽人意。主要是因为络合型探针上的识别基团对化学性质、离子半径与汞离子相似的其他金属离子(如铜离子、金离子等)也具有类似的响应。相比之下,反应型探针利用汞离子特异性催化能力,使识别基团发生转化,导致荧光强度或者荧光发射波长改变,具有较高选择性,能够用于各种复杂样品中汞离子检测。尽管利用荧光探针检测汞离子取得了一定的进展,但仍存在诸多不足。例如:①大多数报道的汞离子荧光探针发射波长位于紫外-可见光区,在生物分析中容易遭受背景荧光的干扰(主要来源于生物样品中的蛋白质、核酸等吸收激发波长而产生的自发荧光),降低检测的信噪比。②大部分荧光探针需要高能量的紫外-可见光激发,在生物分析中存在不可避免的光损伤。③绝大多数汞离子探针的检测方式限于荧光光谱法。近些年来,比色/荧光探针由于检测的灵活性及准确性引起广泛关注和发展。另一方面,近红外(650–900nm)荧光探针因其具有低的背景干扰,低的光损伤和较好的组织穿透性等优点,有效地解决以上存在的问题,然而,目前报道的几个近红外汞离子荧光探针,存在合成困难、产率不高等问题,严重限制了其广泛应用。因此,发展一种易于制备的比色/近红外荧光探针检测环境及生物体系中的汞离子是非常有意义的。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种可用于汞离子检测的探针化合物及其制备方法和应用。本发明提供的探针以具有“推-拉”电子效应的苯并吡喃氰衍生物为近红外荧光基团,以二硫代缩醛为识别基团,其合成条件温和,产率较高,荧光发射波长位于近红外区域,有效克服了报道的大多数荧光探针在成像分析中背景干扰严重、光损伤大、光穿透性低等缺陷。本发明提供的探针不仅展现近红外荧光增强信号,同时伴随明显的颜色变化,可在不需要借助任何仪器设备的情况下实现对汞离子的比色检测。该探针对汞离子检测具有较高的灵敏性和选择性且不受其他金属离子的干扰,并成功实现对水溶液和活细胞中的汞离子分析检测,为环境保护和汞离子诱发的疾病诊断提供了一种非常有前景的检测方法。
本发明提供了一种用于汞离子检测的探针化合物,其化学结构式如式(I)所示,简称为DCM-Hg。
制备用于汞离子检测的探针化合物的方法,包括以下步骤:
(1)以4-(二氰基亚甲基)-2-(4-羟基-5-醛基-苯乙烯基)-4H-1-苯并吡喃为原料,在原料中加入1,3-丙二硫醇、三氟化硼乙醚和二氯甲烷,混合均匀,得混合液;所述4-(二氰基亚甲基)-2-(4-羟基-5-醛基-苯乙烯基)-4H-1-苯并吡喃简称为DCM-CHO-OH,所述混合液配方比例为:
(2)将上述混合液在20-40℃下搅拌5-24小时;
(3)反应结束后,溶液呈暗红色,经过萃取,水洗,减压浓缩后得到粗产物,随后通过柱层析分离得到纯净的探针DCM-Hg。
步骤(1)所述混合液配方比例优选为:
步骤(2)优选在20-40℃下中搅拌12-24小时。
该化合物的结构鉴定:
探针DCM-Hg核磁共振氢谱结果如下:
1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ11.97(s,1H),8.73(d,J=8.3Hz,1H),7.92(t,J=7.7Hz,1H),7.84(d,J=8.4Hz,1H),7.73(d,J=12.9Hz,2H),7.60(t,J=7.2Hz,2H),7.30(d,J=16.0Hz,1H),7.08(s,1H),6.95(d,J=8.5Hz,1H),5.65(s,1H),3.14(t,J=13.1Hz,2H),2.91(d,J=14.1Hz,2H),2.19–2.12(m,1H),1.82–1.73(m,1H)。
探针DCM-Hg核磁共振碳谱结果如下:
13C NMR(126MHz,DMSO-d6):δ159.21,156.46,153.45,152.56,139.29,135.74,130.14,129.86,127.04,126.89,126.52,125.06,119.57,117.91,117.59,116.98,116.72,116.47,106.50,59.92,43.15,31.80,25.33。
探针DCM-Hg高分辨质谱结果如下:
ESI-MS m/z:C24H17N2O2S2 -429.0888(实验测得值),429.5325(理论计算值)。
本发明还提供了所述比色/近红外荧光探针在汞离子检测中的应用。
优选方案,所述汞离子包括环境水样中的汞离子与活细胞中外源性的汞离子。
进一步优选方案,用所述探针化合物检测环境水样中的汞离子包括以下步骤:将待检测水样的pH值调整到7.4,采用标准加入法定量检测水样中的汞离子,即向预处理后的水样中添加汞离子标准溶液,然后加入探针DCM-Hg,用荧光分光光度计测定其荧光强度,再根据标准曲线计算出未知样品中汞离子含量;所述荧光分光光度计参数设置为激发狭缝5nm,发射狭缝5nm,激发波长514nm,发射波长659nm,扫描范围534-800nm。
再进一步优选方案,包括以下步骤:
(1)准确称取一定量探针DCM-Hg溶于色谱纯的二甲亚砜中,配制成浓度为1.0×10-3mol/L的DCM-Hg储备液,并保存于2-5℃的冰箱中,备用;
(2)准确称取一定量的氯化高汞溶于去离子水中,配制成浓度为1.0×10-1mol/L的汞离子储备液,采用逐级稀释法配置浓度为1.0×10-2mol/L和1.0×10-3mol/L汞离子标准液,并保存于2-5℃的冰箱中,备用;
(3)配制0.02mol/L,pH=7.4的PBS缓冲溶液备用:
(4)分别移取20μL步骤(1)所述DCM-Hg储备液和不同体积的步骤(2)所述汞离子标准液于多个2mL测试管中,然后用0.02mol/L,pH=7.4,5:5v/v的PBS-DMSO缓冲液定容到2mL,待测试溶液反应35分钟-50分钟后,用荧光分光光度计测定各溶液的荧光强度,确定荧光强度与汞离子浓度的定量关系并制作标准曲线;
水样前处理:水样取自衡阳师范学院临近的湘江河水和实验室中自来水;在光谱分析前,所有水样经过简单过滤处理,以去除水样中微溶杂质,其pH值调整到7.4;实际样品分析:采用标准加入法定量检测水样中的汞离子,即向预处理后的水样中添加一定量的汞离子标准溶液,然后加入探针DCM-Hg,在最佳条件下测定其荧光强度,在根据标准曲线计算出未知样品中汞离子含量;所述检测体系中DMSO与水相的体积比优选为5:5v/v。
进一步优选方案,应用所述比色/近红外荧光探针检测活细胞内汞离子,包括以下步骤:
(1)将HepG2细胞接种在96孔板中,在37℃含5%CO2的环境中,用含有10%小牛坯胎血清的DMEM培养24个小时。
(2)将HepG2细胞置于含有10μM的探针DCM-Hg培养液中孵育30分钟,再用37℃的PBS缓冲溶液洗涤三次,以洗去细胞外残余的探针分子,作为空白组。
(3)向一部分步骤(2)所述细胞中添加50μM汞离子,继续孵育35分钟,再用37℃的PBS缓冲液洗涤细胞3次,作为实验组。最后,在40倍物镜的荧光倒置显微镜(Nikon,EclipseTi-S)下,对空白照和实验组的细胞分别进行荧光成像。
本发明通过实验研究化合物DCM-Hg与多种金属离子的识别作用,发现DCM-Hg对汞离子具有特异性响应。该方法可在近红外区域(λem>650nm)实现对汞离子的高灵敏、高选择性荧光检测,同时伴随明显的比色现象,也可实现简单有效的比色检测。在实际应用方面,化合物DCM-Hg不仅能定量检测环境水样中的汞离子,还能定性检测活细胞中汞离子。本发明中比色/近红外探针的制备方法具有反应条件温和,产量较高等优点。
附图说明
本发明附图12幅,如下所示:
图1是本发明所提供探针DCM-Hg的氢谱;
图2是本发明所提供探针DCM-Hg的碳谱;
图3是本发明所提供探针DCM-Hg的高分辨质谱;
图4(A)是实施例14中探针DCM-Hg加入10倍当量的汞离子前后检测体系的紫外吸收光谱图;图4(B)是本发明所提供探针DCM-Hg加入10倍当量的汞离子前后检测体系的荧光发射光谱图;
图5是本发明实施例15中探针DCM-Hg加入10倍当量的汞离子前后检测体系的荧光强度随pH的变化曲线图
图6是本发明实施例16中探针DCM-Hg加入10倍当量的汞离子前后检测体系的荧光强度随反应时间的变化曲线;
图7(A)是本发明实施例17中探针DCM-Hg加入不同浓度的汞离子后检测体系的荧光发射光谱图,图7(B)为不同浓度汞离子的荧光发射强度的线性回归曲线;
图8是本发明实施例18中探针DCM-Hg加入不同金属离子后检测体系的荧光发射光谱图;
图9是本发明实施例19中探针DCM-Hg加入不同金属离子后检测体系的颜色变化图;上排为自然光照下的颜色变化图,下排为365nm紫外灯照射下的荧光颜色变化图;
图10是本发明实施例20中探针DCM-Hg在其他金属离子共存下加入汞离子后混合体系的荧光强度矩形图;
图11是本发明实施例21中探针DCM-Hg与汞离子作用后高分辨质谱图;
图12是本发明实施例23中用探针DCM-Hg孵育的HepG2细胞加入汞离子前后的显微成像图;
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明,但不应该将此理解为本发明对上述主体范围仅限于以下的实施例,凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
准确称取170.2毫克DCM-CHO-OH、21.6毫克1,3-丙二硫醇和71.0毫克三氟化硼乙醚于干燥的圆底烧瓶,然后加入20毫升二氯甲烷,在30℃下搅拌12个小时;反应结束后,溶液呈暗红色,TLC监控,发现还有大部分原料DCM-CHO-OH未反应完全。将反应液进行萃取、水洗减压浓缩后,再进行柱层析分离,得到砖黄色产物DCM-Hg(产率为28%)。
实施例2
准确称取170.2毫克DCM-CHO-OH、54.1毫克1,3-丙二硫醇和71.0毫克三氟化硼乙醚于干燥的圆底烧瓶,然后加入20毫升二氯甲烷,在30℃下搅拌12个小时;反应结束后,溶液呈暗红色,TLC监控,发现原料DCM-CHO-OH基本反应完全。将反应液进行萃取、水洗减压浓缩后,再进行柱层析分离,得到砖黄色产物DCM-Hg(产率为88%)。
实施例3
准确称取170.2毫克DCM-CHO-OH、108.2毫克1,3-丙二硫醇和71.0毫克三氟化硼乙醚于干燥的圆底烧瓶,然后加入20毫升二氯甲烷,在30℃下搅拌12个小时;反应结束后,溶液呈暗红色,TLC监控,发现原料DCM-CHO-OH反应完全,但产物中有杂质点。将反应液进行萃取、水洗减压浓缩后,再进行柱层析分离,得到砖黄色产物DCM-Hg(产率为41%)。
实施例4
准确称取170.2毫克DCM-CHO-OH、64.9毫克1,3-丙二硫醇和71.0毫克三氟化硼乙醚于干燥的圆底烧瓶,然后加入20毫升二氯甲烷,在30℃下搅拌12个小时;反应结束后,溶液呈暗红色,TLC监控,发现原料DCM-CHO-OH反应完全。将反应液进行萃取、水洗减压浓缩后,再进行柱层析分离,得到砖黄色产物DCM-Hg(产率为86%)。
实施例5
准确称取170.2毫克DCM-CHO-OH、54.1毫克1,3-丙二硫醇和28.4毫克三氟化硼乙醚于干燥的圆底烧瓶,然后加入20毫升二氯甲烷,在30℃下搅拌12个小时;反应结束后,溶液呈暗红色,TLC监控,发现原料DCM-CHO-OH部分反应。将反应液进行萃取、水洗减压浓缩后,再进行柱层析分离,得到砖黄色产物DCM-Hg(产率为33%)。
实施例6
准确称取170.2毫克DCM-CHO-OH、54.1毫克1,3-丙二硫醇和141.9毫克三氟化硼乙醚于干燥的圆底烧瓶,然后加入20毫升二氯甲烷,在30℃下搅拌12个小时;反应结束后,溶液呈暗红色,TLC监控,发现大部分原料DCM-CHO-OH反应。将反应液进行萃取、水洗减压浓缩后,再进行柱层析分离,得到砖黄色产物DCM-Hg(产率为78%)。
实施例7
准确称取170.2毫克DCM-CHO-OH、54.1毫克1,3-丙二硫醇和85.2毫克三氟化硼乙醚于干燥的圆底烧瓶,然后加入20毫升二氯甲烷,在30℃下搅拌12个小时;反应结束后,溶液呈暗红色,TLC监控,发现大部分原料DCM-CHO-OH已反应。将反应液进行萃取、水洗减压浓缩后,再进行柱层析分离,得到砖黄色产物DCM-Hg(产率为87%)。
实施例8
准确称取170.2毫克DCM-CHO-OH、54.1毫克1,3-丙二硫醇和71.0毫克三氟化硼乙醚于干燥的圆底烧瓶,然后加入10毫升二氯甲烷,在30℃下搅拌12个小时;反应结束后,溶液呈暗红色,TLC监控,发现大部分原料DCM-CHO-OH反应完全。将反应液进行萃取、水洗减压浓缩后,再进行柱层析分离,得到砖黄色产物DCM-Hg(产率为85%)。
实施例9
准确称取170.2毫克DCM-CHO-OH、54.1毫克1,3-丙二硫醇和71.0毫克三氟化硼乙醚于干燥的圆底烧瓶,然后加入50毫升二氯甲烷,在30℃下搅拌12个小时;反应结束后,溶液呈暗红色,TLC监控,发现少量原料DCM-CHO-OH未反应完全。将反应液进行萃取、水洗减压浓缩后,再进行柱层析分离,得到砖黄色产物DCM-Hg(产率为75%)。
实施例10
准确称取170.2毫克DCM-CHO-OH、54.1毫克1,3-丙二硫醇和71.0毫克三氟化硼乙醚于干燥的圆底烧瓶,然后加入20毫升二氯甲烷,在20℃下搅拌12个小时;反应结束后,溶液呈暗红色,TLC监控,发现原料DCM-CHO-OH反应完全。将反应液进行萃取、水洗减压浓缩后,再进行柱层析分离,得到砖黄色产物DCM-Hg(产率为82%)。
实施例11
准确称取170.2毫克DCM-CHO-OH、54.1毫克1,3-丙二硫醇和71.0毫克三氟化硼乙醚于干燥的圆底烧瓶,然后加入20毫升二氯甲烷,在40℃下搅拌12个小时;反应结束后,溶液呈暗红色,TLC监控,发现绝大部分原料DCM-CHO-OH反应完全。将反应液进行萃取、水洗减压浓缩后,再进行柱层析分离,得到砖黄色产物DCM-Hg(产率为88%)。
实施例12
准确称取170.2毫克DCM-CHO-OH、54.1毫克1,3-丙二硫醇和71.0毫克三氟化硼乙醚于干燥的圆底烧瓶,然后加入20毫升二氯甲烷,在30℃下搅拌5个小时;反应结束后,溶液呈暗红色,TLC监控,发现原料DCM-CHO-OH未反应完全。将反应液进行萃取、水洗减压浓缩后,再进行柱层析分离,得到砖黄色产物DCM-Hg(产率为52%)。
实施例13
准确称取170.2毫克DCM-CHO-OH、54.1毫克1,3-丙二硫醇和71.0毫克三氟化硼乙醚于干燥的圆底烧瓶,然后加入20毫升二氯甲烷,在30℃下搅拌24个小时;反应结束后,溶液呈暗红色,TLC监控,发现原料DCM-CHO-OH反应完全。将反应液进行萃取、水洗减压浓缩后,再进行柱层析分离,得到砖黄色产物DCM-Hg(产率为89%)。
实施例14
探针DCM-Hg识别汞离子的考察
取2个2mL测试管,向其中一个测试管中加入20μL DCM-Hg储备液(1.0×10-3mol/L),并用PBS-DMSO缓冲液(0.01mol/L,pH=7.4,5:5v/v)定容到2mL,作为空白组;另外一个依次加入20μL DCM-Hg储备液(1.0×10-3mol/L)和20μL汞离子标准液(1.0×10-2mol/L)并用PBS-DMSO缓冲液(0.01mol/L,pH=7.4,5:5v/v)定容到2mL,作为实验组。待测试溶液反应35分钟后,用紫外-可见吸收光谱仪(UV-2501PC,Japan)和荧光光谱仪(RF-5301PC,Japan)分别进行扫描。图4(A)表示探针DCM-Hg在加入汞离子前后的紫外光谱变化,在加入汞离子之前,探针DCM-Hg在562nm有一个明显的吸收峰,在加入汞离子之后,探针DCM-Hg的吸收峰发生明显蓝移(562nm→514nm)。图4(B)表示探针DCM-Hg在加入汞离子前后的荧光光谱变化,在没有汞离子存在时,探针DCM-Hg在669nm处的荧光强度比较弱。然而,往探针溶液中加入10倍当量的汞离子后,荧光光谱稍微蓝移且荧光强度明显增强。在自然光和紫外光(365nm)下,可以观察到探针溶液的颜色发生明显变化。这些实验结果初步的表明:DCM-Hg可作为一个比色/近红外汞离子荧光探针。
实施例15
溶液pH的选择
在具体研究中,我们固定一组待测溶液中DCM-Hg的最终浓度为1.0×10-5mol/L、汞离子的最终浓度为0mol/L及其他实验条件,测试探针DCM-Hg溶液在不同pH环境中的荧光强度。固定另外一组待测溶液中DCM-Hg的最终浓度为1.0×10-5mol/L、汞离子的最终浓度为1.0×10-4mol/L及其他实验条件,测试探针DCM-Hg与汞离子混合后的溶液在不同pH环境中的荧光强度。实验结果如图5所示。探针本身的荧光强度比较弱,其荧光强度对pH变化不敏感。在10倍当量的汞离子存在下,检测体系的荧光强度几乎随着pH的增加而增加,特别是在碱性环境中,其荧光强度增加的程度越来越大。这可以从机理上解释:探针DCM-Hg上的1,3-二硫代环己烷与汞离子形成鎓盐之后,容易遭受亲核性物质进攻,水解成醛基,而碱性环境中氢氧根离子含量比较高,容易进攻鎓盐,助于中间产物水解。考虑到后续的生物成像实验以及荧光响应情况,我们选择pH=7.4的PBS缓冲溶液作为检测介质。
实施例16
反应时间的选择。
在具体研究中,我们固定一组待测溶液中DCM-Hg的最终浓度为1.0×10-5mol/L、汞离子的最终浓度为0mol/L、pH=7.4及其他实验条件,测定探针DCM-Hg溶液在不同反应时间下的荧光强度。固定另外一组待测溶液中DCM-Hg的最终浓度为1.0×10-5mol/L、汞离子的最终浓度为1.0×10-4mol/L、pH=7.4及其他实验条件,测定探针DCM-Hg与汞离子混合后的溶液在不同反应时间下的荧光强度。由图6所示,探针DCM-Hg本身的荧光强度不随反应时间的变化而变化,然而在加入10倍当量汞离子后,探针DCM-Hg在659nm处的荧光强度随着反应时间的增加而增加;当反应时间为35min时,体系的荧光强度达到一个恒定值,此时表明探针与汞离子已经反应完全。因此,在后续实验中,我们选择35min作为最佳测试时间。
实施例17
线性及灵敏性考察
在多个2mL的测试管中分别加入20μL DCM-Hg储备液(1.0×10-3mol/L),再依次加入不同浓度的汞离子溶液([Hg2+](×10-6mol/L):0、0.2、0.4、0.8、1、2、6、8、10、15、18、20、26、34、38、44、48、54、68、80、90、100、110、120、130、150μM),最后用PBS-DMSO缓冲液(0.01mol/L,pH=7.4,5:5v/v)定容到2mL,待混合液反应35min后,用荧光光谱仪(RF-5301PC,Japan)测定各溶液的荧光强度。荧光测试参数为激发狭缝5nm,发射狭缝5nm,激发波长514nm,发射波长659nm,扫描范围634-800nm。如图7(A)所示,在没有加入汞离子之前,探针DCM-Hg展现微弱的荧光信号。然而,在加入汞离子后,探针在659nm处荧光强度明显增强,且检测体系的荧光强度与汞离子的浓度在0-100μM范围内呈现良好的线性关系。本发明中探针DCM-Hg与铜离子作用后荧光发射位于近红外区域,能有效避免背景荧光的干扰,在化学分析及生物应用中存在明显优势。如图7(B)所示,我们通过作图软件对实验数据进行拟合,得到线性回归方程为:Y=10.25+0.5258X(线性相关度:R2=0.9997),其中Y为检测体系的荧光强度,X为汞离子的浓度。根据检测下限计算公式(3σ/K),可计算出探针DCM-Hg对汞离子的检测下限为2.35×10-8M。
实施例18
选择性考察
在多个2mL的测试管中分别加入20μL DCM-Hg储备液(1.0×10-3mol/L),再依次加入20μL的不同金属离子的储备液(1.0×10-2mol/L,Bi2+,Al3+,K+,Sn2+,Ba2+,Mn2+,Co2+,Ni2+,Zn2+,Cd2+,Pd2+,Fe2+,Cu2+,Ag+,Fe3+,Hg2+),最后用PBS-DMSO缓冲液(0.01mol/L,pH=7.4,5:5v/v)定容到2mL,待混合液反应35分钟后,用荧光光谱仪(RF-5301PC,Japan)测定各溶液的荧光强度。如图8所示,只有汞离子的引入使得探针DCM-Hg在659nm处的荧光强度产生显著的增强效果。相比之下,其他金属离子的引入对DCM-Hg的荧光光谱几乎没有影响。这些结果探针DCM-Hg对汞离子的识别具有很好的选择性。探针DCM-Hg对汞离子的高选择性可能归因于汞离子对1,3-二硫代环己烷高的催化水解能力。
实施例19
比色检测
在多个2mL的测试管中分别加入20μL DCM-Hg储备液(1.0×10-3mol/L),再依次加入20μL的不同金属离子的储备液(1.0×10-2mol/L,Bi2+,Al3+,K+,Sn2+,Ba2+,Mn2+,Co2+,Ni2+,Zn2+,Cd2+,Pd2+,Fe2+,Cu2+,Ag+,Fe3+,Hg2+),最后用PBS-DMSO缓冲液(0.01mol/L,pH=7.4,5:5v/v)定容到2mL,待混合液反应35分钟后,分别放置在自然光和紫外光(365nm)下拍照。从图9可知,汞离子的存在可以引起探针DCM-Hg溶液的颜色发生显著变化:在自然光下,使探针的颜色由紫色变成粉红色,在紫外光(365nm)下,使探针荧光由无色变成红色。相比之下,其他金属离子不会引起任何明显的变化。因此,DCM-Hg能够作为一个比色探针,可实现对汞离子简单、快速、高选择性检测。
实施例20
干扰性实验
为了证明探针DCM-Hg对汞离子检测的实际适用性,我们进一步研究了探针DCM-Hg在其它金属离子共存的情况下对汞离子的荧光响应。在图12中,Blank表示空白组,白色矩形图代表DCM-Hg(1.0×10-5mol/L)和不同金属离子(1.0×10-4mol/L)混合后的荧光强度,黑色矩形图表示向含有DCM-Hg(1.0×10-5mol/L)和不同金属离子(1.0×10-4mol/L)的体系中加入同等浓度的汞离子(1.0×10-4mol/L)后的荧光强度。如图10所示,在其他金属离子存在的条件下,探针DCM-Hg仍然对汞离子具有良好的响应。这表明探针DCM-Hg对汞离子具有较高的选择性,有望在复杂环境下准确地检测汞离子。
实施例21
机理研究
探针DCM-Hg分子结构中含有荧光信号基团苯并吡喃氰衍生物和识别基团1,3-二硫代环己烷。根据汞离子催化二硫代缩醛的脱保护反应,我们预计探针DCM-Hg中的1,3-二硫代烷基可以被汞离子脱保护为醛基团,从而使探针DCM-Hg转化成化合物DCM-CHO-OH。为了验证这一假设,我们借助高分辨质谱对探针DCM-Hg与汞离子的反应产物进行表征。结果如图3和图11所示,在加入汞离子之前,探针DCM-Hg(m/z 429.0737理论值)显现一个分子离子碎片峰(m/z429.0888实验值);而加入汞离子后,探针本身的分子离子碎片峰消失。与此同时,质谱上出现一个新的分子离子碎片峰(m/z 339.1025实验值),该峰值恰好与DCM-CHO-OH的理论计算值一致(m/z 339.0775理论值)。因此,上述结果表明汞离子确实推动DCM-Hg发生脱硫缩醛反应,使之转化成荧光化合物DCM-CHO-OH。基于高分辨质谱的结果,探针DCM-Hg与汞离子的识别机理如下所示。
实施例22
环境水样中汞离子检测
汞离子是一种有毒有害、易溶于水的重金属离子,在工业生产、运输及排放中容易流入自然界,污染引用水。一旦经人或动植物吸收后,会残留在体内,造成不可逆转的生物损伤。因此,检测实际水样中的汞离子具有非常重要的意义。
用于汞离子检测的探针化合物检测环境水样中的汞离子,包括以下步骤:
(1)准确称取一定量探针DCM-Hg溶于色谱纯的二甲亚砜(DMSO)中,配制成浓度为1.0×10-3mol/L的DCM-Hg储备液,并保存于2–5℃的冰箱中,备用;
(2)准确称取一定量的氯化高汞溶于去离子水中,配制成浓度为1.0×10-1mol/L的汞离子储备液,采用逐级稀释法配置浓度为1.0×10-2mol/L和1.0×10-3mol/L汞离子标准液,并保存于2–5℃的冰箱中,备用;其他各种金属离子(Bi2+,Al3+,K+,Sn2+,Ba2+,Mn2+,Co2+,Ni2+,Zn2+,Cd2+,Pd2+,Fe2+,Cu2+,Ag+,Fe3+,Hg2+)储备液的配置:将适量的金属氯化盐或者硝酸盐溶于去离子水,使之浓度为1.0×10-2mol/L,保存备用;
(3)PBS缓冲溶液(0.02mol/L,pH=7.4)的配置:先配置浓度为0.2mol/L K2HPO4(称取78g K2HPO4·12H2O溶于1000mL去离子水中)和KH2PO4(称取27.2g KH2PO4·2H2O溶于1000mL去离子水中)溶液;取19mL 0.2mol/L KH2PO4溶液和81mL 0.2mol/L K2HPO4溶液混合,配成0.2mol/L PBS母液(pH=7.4);然后取50mL 0.2mol/L PBS母液,加去离子水稀释至1000mL即可。
(4)用移液枪分别移取20μL步骤(1)所述DCM-Hg储备液和不同体积的步骤(2)所述汞离子标准液于多个2mL测试管中,然后用PBS-DMSO缓冲液(0.01mol/L,pH=7.4,5:5v/v)定容到2mL。待测试溶液反应35分钟后,用荧光分光光度计(RF-5301PC,Japan)测定各溶液的荧光强度,确定荧光强度与汞离子浓度的定量关系并制作标准曲线;
(5)水样前处理:水样取自衡阳师范学院临近的湘江河水和实验室中自来水;在光谱分析前,所有水样经过简单过滤处理,以去除水样中微溶杂质,其pH值调整到7.4。实际样品分析:采用标准加入法定量检测水样中的汞离子,即向预处理后的水样中添加一定量的汞离子标准溶液,然后加入探针DCM-Hg,在最佳条件下测定其荧光强度,在根据标准曲线计算出未知样品中汞离子含量。
其中所述检测体系中DMSO与水相的体积比优选为5:5v/v。
其中所述荧光分光光度计参数设置为激发狭缝5nm,发射狭缝5nm,激发波长514nm,发射波长659nm,扫描范围534-800nm。
我们以衡阳师范学院附近湘江河水以及实验室自来水为分析对象,在分析测试前,所有水样经过0.22微米的膜过滤,pH调到7.4。考虑水样中汞离子浓度过低,我们采用标准加入法测定汞离子浓度。具体为:向预处理后的水样中加入已知浓度的汞离子(0,2μM,40μM)并在最优条件下测定其荧光强度,通过标准曲线计算回收量和回收率。分析结果如表1所示,每个样品中汞离子的回收率在98.7%-102.0%之间。较好的回收率和重现性表明探针DCM-Hg能够有效的检测环境水样中的汞离子,为检测环境的中汞离子提供一种强有力的方法。
表1用探针DCM-Hg检测环境水样中汞离子的分析结果
实施例23
活细胞中汞离子检测
为了探究探针的生物应用性,我们利用DCM-Hg来识别活细胞内汞离子。首先,我们将HepG2细胞放置在含有探针DCM-Hg(10μM)培基中孵育30分钟,然后用37℃的PBS缓冲溶液洗涤三次,以除去细胞外部残留的探针分子。接着将预处理过的细胞放置在含有50μM汞离子的PBS缓冲溶液孵育35分钟,然后进行荧光显微成像。实验结果如12所示。图12(A)和(B)是明场成像图像,从中可观察到细胞生长良好,形态正常,说明探针DCM-Hg具有良好细胞相容性。图12(C)和(D)是荧光成像图像,从中可观察到探针能够顺利进入细胞内部,并与汞离子发生反应,产生明亮的红色荧光。上述实验结果表明:DCM-Hg可以应用于活细胞内汞离子成像。
Claims (9)
1.一种用于汞离子检测的探针化合物,其化学结构式如式(I)所示,简称为DCM-Hg:
2.制备权利要求1所述探针化合物的方法,其特征是,包括以下步骤:
(1)以4-(二氰基亚甲基)-2-(4-羟基-5-醛基-苯乙烯基)-4H-1-苯并吡喃为原料,在原料中加入1,3-丙二硫醇、三氟化硼乙醚和二氯甲烷,混合均匀,得混合液;所述4-(二氰基亚甲基)-2-(4-羟基-5醛基-苯乙烯基)-4H-1-苯并吡喃简称为DCM-CHO-OH,所述混合液配方比例为:
(2)将上述混合液在20-40℃下搅拌5-24小时;
(3)反应结束后,溶液呈暗红色,经过萃取,水洗,减压浓缩后得到粗产物,随后通过柱层析分离得到纯净的探针DCM-Hg。
3.根据权利要求2所述探针化合物的制备方法,其特征是,步骤(1)所述混合液配方比例为:
4.根据权利要求2所述探针化合物的制备方法,其特征是,步骤(2)优选在20-40℃下中搅拌12-24小时。
5.权利要求1所述探针化合物在汞离子检测中的应用。
6.根据权利要求5所述应用,其特征是,所述汞离子包括环境水样中的汞离子与活细胞中外源性的汞离子。
7.根据权利要求6所述应用,其特征是,用所述探针化合物检测环境水样中的汞离子包括以下步骤:将待检测水样的pH值调整到7.4,采用标准加入法定量检测水样中的汞离子,即向预处理后的水样中添加汞离子标准溶液,然后加入探针DCM-Hg,用荧光分光光度计测定其荧光强度,再根据标准曲线计算出未知样品中汞离子含量;所述荧光分光光度计参数设置为激发狭缝5nm,发射狭缝5nm,激发波长514nm,发射波长659nm,扫描范围534-800nm。
8.根据权利要求6所述应用,其特征是,用所述探针化合物检测环境水样中的汞离子包括以下步骤:
(1)准确称取一定量探针DCM-Hg溶于色谱纯的二甲亚砜中,配制成浓度为1.0×10- 3mol/L的DCM-Hg储备液,并保存于2-5℃的冰箱中,备用;
(2)准确称取一定量的氯化高汞溶于去离子水中,配制成浓度为1.0×10-1mol/L的汞离子储备液,采用逐级稀释法配置浓度为1.0×10-2mol/L和1.0×10-3mol/L汞离子标准液,并保存于2-5℃的冰箱中,备用;将适量的金属氯化盐或者硝酸盐溶于去离子水,使之浓度为1.0×10-2mol/L,保存备用;
(3)配制0.02mol/L,pH=7.4的PBS缓冲溶液备用:
(4)分别移取20μL步骤(1)所述DCM-Hg储备液和不同体积的步骤(2)所述汞离子标准液于多个2mL测试管中,然后用0.02mol/L,pH=7.4,5:5v/v的PBS-DMSO缓冲液定容到2mL,待测试溶液反应35分钟-50分钟后,用荧光分光光度计测定各溶液的荧光强度,确定荧光强度与汞离子浓度的定量关系并制作标准曲线;
水样前处理:水样取自衡阳师范学院临近的湘江河水和实验室中自来水;在光谱分析前,所有水样经过简单过滤处理,以去除水样中微溶杂质,其pH值调整到7.4;实际样品分析:采用标准加入法定量检测水样中的汞离子,即向预处理后的水样中添加一定量的汞离子标准溶液,然后加入探针DCM-Hg,在最佳条件下测定其荧光强度,在根据标准曲线计算出未知样品中汞离子含量;所述检测体系中DMSO与水相的体积比优选为5:5v/v。
9.根据权利要求6所述应用,其特征是,用所述探针化合物检测活细胞内汞离子,包括以下步骤:
(1)将HepG2细胞接种在96孔板中,在37℃含5%CO2的环境中,用含有10%小牛坯胎血清的DMEM培养24个小时;
(2)将HepG2细胞置于含有10μM的探针DCM-Hg培养液中孵育30分钟,再用37℃的PBS缓冲溶液洗涤三次,以洗去细胞外残余的探针分子,作为空白组;
(3)向一部分步骤(2)所述细胞中添加50μM汞离子,继续孵育35分钟,再用37℃的PBS缓冲液洗涤细胞3次,作为实验组;最后,在40倍物镜的荧光倒置显微镜(Nikon,Eclipse Ti-S)下,对空白照和实验组的细胞分别进行荧光成像。
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