CN106932368A - 一种碳量子点靶向检测线粒体中onoo‑的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种碳量子点靶向检测线粒体中ONOO‑的方法，属于生物传感器及离子识别领域。本发明合成的碳量子点(C‑dots‑TPP)荧光探针与ONOO‑由于光诱导电子转移在575nm处的荧光强度会明显降低。本发明的碳量子点荧光探针，在pH＝7.4缓冲溶液中对ONOO‑检测最低限度达到13.5nM。本发明的碳量子点荧光探针合成方法简单、生物相容性好、细胞毒性小、检测灵敏度高、检测迅速且信号稳定，为实现临床检测细胞线粒体中的ONOO‑提供了可能。
Description
技术领域
本发明涉及一种碳量子点靶向检测线粒体中ONOO-的方法，属于生物传感器及离子识别领域。
背景技术
目前检测过氧亚硝酸根(ONOO-)的方法有很多，如：电子顺磁共振光谱法(EPR)、紫外可见吸收光谱法、电化学分析法、色谱法等。非常不幸的是，所有的这些方法都存在前期样品准备工作很复杂，实验设备比较昂贵，灵敏度较低，选择性较差，且不适合用于细胞检测等问题。
为了避免上面问题，开发了荧光检测技术，这种检测技术具有高灵敏度、无损探伤，并且已经用在了过氧亚硝酸根的检测中。然而，目前报道的有机荧光探针存在光稳定性差、合成步骤较为复杂，水溶性较差的问题，此外，无机荧光探针因为含有重金属离子具有较强的毒性限制了生物检测方面的应用。
碳量子点作为一种新型的荧光材料，这些年引起广泛关注,主要是由于具有光稳定性好、生物相容性好、水溶性好、表面易修饰等优点。这也证明了碳量子点在很多方面具有潜在应用价值如：化学传感、生物传感、生物成像、生物医学、光电设备等。尤其，碳量子点优异的生物相容性使得其在生物方面有很大的应用前景。最近，et al.和Yang etal.分别发表的碳量子点检测过氧亚硝酸根的文章，但是他们的碳量子点不能实现线粒体内ONOO-的检测，且离子选择性较差、灵敏度较低。因此，开发一种选择性好、灵敏度高、检测迅速且具有靶向检测线粒体内ONOO-的方法，将对ONOO-的研究发展具有至关重要的作用。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有的碳量子点检测过氧亚硝酸根时靶向性差的问题，提供一种碳量子点靶向检测线粒体中ONOO-的方法，该方法创造性的提出检测细胞线粒体内过氧亚硝酸根离子的难题，为实现临床检测细胞线粒体中的ONOO-提供了可能。
本发明的目的是通过下述技术方案实现的。
一种碳量子点靶向检测线粒体中ONOO-的方法，具体步骤如下：
步骤一、用pH＝7.4的PBS缓冲液,将碳量子点(C-dots-TPP)配置成已知浓度的碳量子点分散液。
步骤二、将上述分散液转移到石英比色皿中(石英比色皿的厚度为1cm)，配置500μM浓度的ONOO-储备液，每次加入储备液并进行荧光强度测试，保证每次加入后能够形成0.2μM、0.4μM、0.6μM、0.8μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM的浓度梯度，所述加入的储备液总体积不大于石英比色皿中分散液总体积的5％。
步骤三、根据步骤二中不同浓度的ONOO-对探针荧光发射光谱影响，确定荧光发射光谱575nm处荧光强度与ONOO-浓度的对应关系，在ONOO-含量为0.2-1μM区间内，拟合出一条定量检测ONOO-的标准方程y＝a+bx，其中y为所测的含ONOO-的探针在最大发射峰575nm位置处对应的荧光强度，x为样品中含有的ONOO-的含量(单位：μM)a＝0.95279，b＝-0.14706。
步骤四、将含有ONOO-的待测液样品加入到已知碳量子点(C-dots-TPP)探针浓度的pH＝7.4的PBS缓冲液中，测定荧光光谱，将所测得样品在575nm位置处对应的荧光强度数值带入步骤三中所得的ONOO-定量标准方程中，可以定量确定样品中ONOO-的含量。
步骤一所述的碳量子点(C-dots-TPP)的合成方法为：
(3-羧丙基)三苯基溴化磷溶于甲醇中，加入摩尔比为1:1的1-羟基苯并三氮和二环己基碳二亚胺，室温搅拌1h，然后再加入C-dots，室温条件下反应18h，得到初始产物。初始产物用二氯甲烷进行萃取，用无水硫酸镁或无水硫酸钠进一步除水，然后通过减压旋蒸的方法除去溶剂，得到粗产物。将粗产物通过硅胶柱色谱法，利用二氯甲烷和甲醇作为洗脱液(v/v,50:1)进一步提纯，得到黄绿色产物，再减压浓缩、减压真空干燥最终得到产物黄色粉末C-dots-TPP。
反应式如下所示：
碳量子点(C-dots-TPP)化学结构式：
有益效果
1、本发明的一种碳量子点靶向检测线粒体中ONOO-的方法，可以靶向检测线粒体中的ONOO-。
2、本发明的一种碳量子点靶向检测线粒体中ONOO-的方法，是通过探针C-dots-TPP和ONOO-间的光诱导电子转移，在575nm处的荧光强度明显淬灭，检测最低限度达到13.5nM。本发明的碳量子点荧光探针合成方法简单、生物相容性好、细胞毒性小、检测灵敏度高、检测迅速且信号稳定，为实现临床检测细胞线粒体中的ONOO-提供了可能。
3、本发明的一种碳量子点靶向检测线粒体中ONOO-的方法，以邻苯二胺为原料，通过一步合成碳量子点C-dots，并在其表面修饰线粒体靶向剂TPP制得碳量子点荧光探针C-dots-TPP，原料便宜，反应条件温和，后处理简单，产物产率较高。
附图说明
图1是本发明中碳量子点C-dots-TPP和C-dots的红外光谱图；
图2是本发明中碳量子点C-dots-TPP荧光探针的TEM图；
图3是本发明中碳量子点C-dots-TPP荧光探针的XPS图；
图4是本发明中碳量子点C-dots-TPP荧光探针的荧光寿命图；
图5是本发明中碳量子点C-dots-TPP荧光探针的细胞毒性图；
图6是本发明中碳量子点C-dots-TPP荧光探针的细胞靶向性图；
图7是本发明中碳量子点C-dots-TPP荧光探针对ONOO-选择性荧光光谱图；
图8是本发明中碳量子点C-dots-TPP荧光探针随ONOO-浓度增加荧光光谱图；
图9是本发明中碳量子点C-dots-TPP荧光探针在575nm处荧光强度与ONOO-浓度的关系图；
图10是本发明中碳量子点C-dots-TPP荧光探针与ONOO-在0.2-1.0μM线性范围内的拟合曲线；
图11是本发明中碳量子点C-dots-TPP荧光探针的细胞成像图。
具体实施方式
下面结合实施例与附图对本发明做进一步说明。
实施例1
碳量子点C-dots的制备方法
称取0.9g邻苯二胺，加入到90mL的乙醇中搅拌至完全溶解，然后将上述溶液快速转至聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，然后放置烘箱180℃反应12h，自然冷却至室温，取出。将反应后的混合溶液减压浓缩，得到黑色粉末的粗产物。粗产物通过硅胶柱色谱法，利用二氯甲烷和甲醇作为洗脱液(v:v,50:1)，获得黄绿色产物，通过减压旋蒸、减压真空干燥最终得到黄色粉末为C-dots。
碳量子点C-dots-TPP荧光探针的制备方法
(3-羧丙基)三苯基溴化磷(TPP-COOH 20mg,0.0466mmol)加入到50mL圆底烧瓶中，再加入30mL的甲醇，搅拌至完全溶解，最终得到透明溶液。在上述溶液中加入1-羟基苯并三氮唑(HoBt 7.873mg,0.0514mmol)和二环己基碳二亚胺(DCC 9.615mg,0.0466mmol)室温搅拌1h。然后再加入20mg C-dots室温条件下，反应18h，得到初始产物。将初始产物用二氯甲烷进行萃取，用无水硫酸镁或无水硫酸钠进一步除水，然后通过减压旋蒸的方法除去溶剂，得到粗产物。将粗产物通过硅胶柱色谱法，利用二氯甲烷和甲醇作为洗脱液(v:v,50:1)进一步提纯，得到黄绿色产物，再减压浓缩、减压真空干燥最终得到产物黄色粉末C-dots-TPP，并对产物C-dots-TPP进行相关表征红外光谱(图1)、TEM(图2)、XPS(图3)、荧光寿命(图4)、细胞毒性测试(图5)、细胞靶向性实验(图6)。通过表征C-dots-TPP已经成功合成，荧光寿命1.61ns，具有较低的细胞毒性和线粒体靶向性。
实施例2、ONOO-的选择性实验
将碳量子点C-dots-TPP加入到pH＝7.4的PBS缓冲液中配置成已知浓度溶液，分别向其中加入一定量的不同干扰物质配成的储备液，并测试荧光强度。干扰物质包含：O2 .-、·OH、H2O2、1O2、NO、Fe3+、Mg2+、Zn2+、K+、NO2 -、NO3 -、AA、Glu、GSH、L-cys、L-asp、Gly、所有的物质ROS/RNS:10μM，其他离子或是氨基酸都是100μM。从荧光光谱中可以明显的看到，只有含ONOO-的样品溶液在575nm处对探针有很强的荧光淬灭表现出对ONOO-的高效选择性(如图7所示)，而含有其他常见活性物质、离子、氨基酸等样品表现出非常弱的荧光变化。由此，可以判断出本发明所制备的C-dots-TPP荧光探针对ONOO-有很好的选择性。
实施例3、传感器溶液的配制
将碳量子点C-dots-TPP加入到pH＝7.4的PBS缓冲液中配置成已知浓度溶液。用配置后的溶液可以用于ONOO-的定性和定量检测，如图8-图10所示。从图10的定量分析数据可以得到本发明中碳量子点C-dots-TPP用于ONOO-定量检测的标准方程。
下面结合实例进一步描述本发明对ONOO-的定量识别检测。
实施例4
为验证不同碳量子点浓度下本发明ONOO-的检测方法的准确性和可靠性，配置浓度为0.2μg/mL的C-dots-TPP的探针溶液，采用人工为配制含ONOO-的五组试样，其ONOO-的含量分别为0.2μM，0.4μM，0.5μM，0.7μM，0.9μM。在充分搅拌均匀后采集荧光光谱，采用本发明检测方法对上述试样的ONOO-含量进行检测，其检测结果如下表所示。
表一：试样使用浓度为0.2μg/mL的C-dots-TPP对ONOO-的定量识别检测
由表一所示的结果可知，采用浓度为0.2μg/mL的C-dots-TPP探针，本发明方法对ONOO-含量的实际检测值与制作试样时加入的含量值，即理论含量基本相同，具有较小的误差范围。
实施例5
为采用与具体实例3基本相同的检测条件，配置浓度为1μg/mL的C-dots-TPP的探针溶液，采用本发明检测方法对上述试样的ONOO-含量进行检测，其检测结果如下表所示。
表二：试样使用浓度为1μg/mL的C-dots-TPP对ONOO-的定量识别检测
| 试样 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 理论含量 | 2×10-5 | 4×10-5 | 5×10-5 | 7×10-5 | 9×10-5 |
| 检测含量 | 1.98×10-5 | 3.97×10-5 | 4.98×10-5 | 6.97×10-5 | 9.02×10-5 |
由表二所示的结果可知，采用浓度为1μg/mL的C-dots-TPP探针，本发明方法对ONOO-含量的实际检测值与制作试样时加入的含量值，即理论含量基本相同，具有较小的误差范围。
实施例6
为采用与具体实例3基本相同的检测条件，配置浓度为5μg/mL的C-dots-TPP的探针溶液，采用本发明检测方法对上述试样的ONOO-含量进行检测，其检测结果如下表所示。
表三：试样使用浓度为5μg/mL的C-dots-TPP对ONOO-的定量识别检测
| 试样 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 理论含量 | 2×10-5 | 4×10-5 | 5×10-5 | 7×10-5 | 9×10-5 |
| 检测含量 | 1.96×10-5 | 3.98×10-5 | 4.98×10-5 | 6.96×10-5 | 8.99×10-5 |
由表三所示的结果可知，采用浓度为5μg/mL的C-dots-TPP探针，本发明方法对ONOO-含量的实际检测值与制作试样时加入的含量值，即理论含量基本相同，具有较小的误差范围。
实施例7
为采用与具体实例3基本相同的检测条件，配置浓度为10μg/mL的C-dots-TPP的探针溶液，采用本发明检测方法对上述试样的ONOO-含量进行检测，其检测结果如下表所示。
表四：试样使用浓度为10μg/mL的C-dots-TPP对ONOO-的定量识别检测
| 试样 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 理论含量 | 2×10-5 | 4×10-5 | 5×10-5 | 7×10-5 | 9×10-5 |
| 检测含量 | 1.96×10-5 | 3.98×10-5 | 5.02×10-5 | 6.98×10-5 | 8.96×10-5 |
由表四所示的结果可知，采用浓度为10μg/mL的C-dots-TPP探针，本发明方法对ONOO-含量的实际检测值与制作试样时加入的含量值，即理论含量基本相同，具有较小的误差范围。
由表一至表四所示的结果可知，尽管使用了不同浓度的探针C-dots-TPP，采用本发明对ONOO-含量的检测方法，当探针C-dots-TPP浓度0.2-10μg/mL都可以得到较为准确的检测结果，并且具有较小的误差。
实施例8
为了进一步验证探针C-dots-TPP在检测线粒体中ONOO-的应用，采用人体乳腺癌细胞(MCF-7)进行了细胞成像实验。首先，取2mL密度为4×104cell/mL细胞接种在盖玻片上，在37℃，5％CO2的恒温箱中培养24h；其次，将溶解在DMEM介质中的浓度为25μg/mL的探针与MCF-7细胞共培养6h,然后用PBS溶液冲洗掉多余的探针材料；再次，IFN-γ,1μg/mL和LPS,100ng/mL加入到细胞中再次共培养6h，静置；最后，利用共聚焦显微镜进行细胞成像(图11)。
综合试验数据表明，本发明使用碳量子点C-dots-TPP对ONOO-进行定量检测方法的有益效果是采用成本较低的设备对线粒体中的ONOO-含量进行检测，测量速度快，操作简单、方便，测量结果准确、可靠、重复性好。
Claims (3)
1.一种碳量子点靶向检测线粒体中ONOO-的方法，其特征在于：具体步骤如下：
步骤一、用pH＝7.4的PBS缓冲液将碳量子点配置成已知浓度的碳量子点分散液；
步骤二、将上述分散液转移到石英比色皿中，配置500μM浓度的ONOO-储备液，每次加入储备液并进行荧光强度测试，保证每次加入后能够形成0.2μM、0.4μM、0.6μM、0.8μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM的浓度梯度，所述加入的储备液总体积不大于石英比色皿中分散液总体积的5％；
步骤三、根据步骤二中不同浓度的ONOO-对探针荧光发射光谱影响，确定荧光发射光谱575nm处荧光强度与ONOO-浓度的对应关系，在ONOO-含量为0.2-1μM区间内，拟合出一条定量检测ONOO-的标准方程y＝a+bx，其中y为所测的含ONOO-的探针在最大发射峰575nm位置处对应的荧光强度，x为样品中含有的ONOO-的含量(单位：μM)a＝0.95279，b＝-0.14706；
步骤四、将含有ONOO-的待测液样品加入到已知碳量子点探针浓度的pH＝7.4的PBS缓冲液中，测定荧光光谱，将所测得样品在575nm位置处对应的荧光强度数值带入步骤三中所得的ONOO-定量标准方程中，可以定量确定样品中ONOO-的含量。
2.如权利要求1所述的一种碳量子点靶向检测线粒体中ONOO-的方法，其特征在于：步骤一所述的碳量子点的合成方法为：
(3-羧丙基)三苯基溴化磷溶于甲醇中，加入摩尔比为1:1的1-羟基苯并三氮和二环己基碳二亚胺，室温搅拌1h，然后再加入C-dots室温条件下，反应18h，得到初始产物；初始产物用二氯甲烷进行萃取，用无水硫酸镁/无水硫酸钠进一步除水，然后通过减压旋蒸的方法除去溶剂，得到粗产物；将粗产物通过硅胶柱色谱法，利用二氯甲烷和甲醇作为洗脱液(v/v,50:1)，得到黄绿色产物，再减压浓缩、减压真空干燥最终得到产物黄色粉末碳量子点。
3.如权利要求1或2所述的一种碳量子点靶向检测线粒体中ONOO-的方法，其特征在于：所述碳量子点的化学结构式如下：
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