CN112358867B - 一种基于量子点的线粒体荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种基于量子点的线粒体荧光探针及其制备方法和应用。该基于量子点的线粒体荧光探针具有如下通式：

Description

一种基于量子点的线粒体荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于探针检测技术领域，具体涉及一种基于量子点的线粒体荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
量子点(QDs)作为荧光探针在生物成像方面应用非常广泛。QDs具有独特的光学性质，量子产率高、荧光强度大、性质稳定，在生物医学成像方面发挥着重要的作用。QDs与多肽如细胞核定位信号(NLS)或线粒体定位信号(MLS)结合，可促进细胞核或线粒体的细胞内靶向标记和成像。
聚乙烯亚胺(PEI)是一种常见的水溶性大分子聚合物，结构中含有大量的氨基，分子量从几百到几十万不等。因其结构中大量的氨基而带有强烈的正电荷，和金属离子具有很强的鳌合作用。PEI在作为基因载体方面应用广泛，因其价格低廉，效果好，所以在实际应用中表现突出。
线粒体在细胞中发挥着极其重要的作用，当细胞发生凋亡时，线粒体的许多表征都会发生改变。比如细胞发生凋亡时，线粒体膜电位会出现不同程度的变化，线粒体内的很多蛋白如caspase的水平也会变化。在以线粒体为靶点的阳离子化合物中，三苯基膦阳离子化合物得到了广泛的应用。传统的有机荧光染料易淬灭，稳定性差，将量子点和具有线粒体靶向的(3-羧丙基)三苯基膦(TPP)相连，构建能够靶向线粒体的新型量子点荧光探针，具有很大的发展前景。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种基于量子点的线粒体荧光探针及其制备方法和应用。本发明基于量子点的线粒体荧光探针是具有生物靶向性和特异性高的纳米材料，能实现荧光探针的线粒体靶向作用，为线粒体新的检测手段的发展做出贡献。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于量子点的线粒体荧光探针，其具有如下通式：
Figure BDA0002784146930000011
式中，
QDs指量子点CdSe、CdSe/CdS或CdSe/ZnS。
本发明提供了一种上述基于量子点的线粒体荧光探针的制备方法，其合成路线如下所示：
Figure BDA0002784146930000021
具体包括如下步骤：
1)将聚乙烯亚胺b溶于氯仿中，加入量子点a，用氨水调节pH至9-11，在室温下搅拌过夜，旋转蒸发，乙醇溶解纯化，真空干燥得聚乙烯亚胺修饰的量子点c；
2)将量子点c加入(3-羧丙基)三苯基溴化膦d的PBS溶液中，搅拌过夜，离心，三蒸水溶解纯化，真空干燥即得。
具体的，步骤1)中，量子点a和聚乙烯亚胺b的质量比为1：20。
具体的，步骤2)中，量子点c和(3-羧丙基)三苯基溴化膦d的质量比为1：2。
进一步的，步骤1)中，量子点a为CdSe时，经下述步骤制备获得：
将CdO、硬脂酸和十八烯混合后，在无水无氧条件下加热到180-220℃，并保持此温度至溶液澄清，冷却，加入十八胺和三正辛基氧化膦后在无水无氧条件下加热到270-290℃，加入Se前驱体，保持240-260℃反应20-40min；反应结束后加入正己烷稀释，静置，取上清液和无水甲醇混合，取上层正己烷层用甲醇萃取，再和丙酮混合，离心即得；
量子点a为CdSe/CdS时，经下述步骤制备获得：
将CdO、硬脂酸和十八烯混合后，在无水无氧条件下加热到180-220℃，并保持此温度至溶液澄清，冷却至室温，加入十八胺和三正辛基氧化膦后在无水无氧条件下加热到270-290℃，加入Se前驱体，保持240-260℃反应20-40min；按照CdSe包覆三层CdS壳的要求注入定量的CdO前驱体和S前驱体，反应60min；反应结束后加入正己烷稀释，静置，取上清液和无水甲醇混合，取上层正己烷层用甲醇萃取，再和丙酮混合，离心即得；
量子点a为CdSe/ZnS时，经下述步骤制备获得：
将CdO、硬脂酸和十八烯混合后，在无水无氧条件下加热到180-220℃，并保持此温度至溶液澄清，冷却至室温，加入十八胺和三正辛基氧化膦后在无水无氧条件下加热到270-290℃，加入Se前驱体，保持240-260℃反应20-40min；按照CdSe包覆三层ZnS壳的要求注入定量的ZnO前驱体和S前驱体，反应60min；反应结束后加入正己烷稀释，静置，取上清液和无水甲醇混合，取上层正己烷层用甲醇萃取，再和丙酮混合，离心即得。
进一步的，所述Se前驱体由Se粉溶于三辛基膦中获得，所述CdO前驱体由CdO溶于十八烯和油酸的混合溶液中获得，所述S前驱体由S溶于十八烯中获得；所述ZnO前驱体由ZnO溶于十八烯和油酸的混合溶液中获得，
本发明提供了上述基于量子点的线粒体荧光探针在标识癌细胞线粒体荧光探针上的应用。
本发明提供了上述基于量子点的线粒体荧光探针在标识正常细胞线粒体荧光探针上的应用。
和现有技术相比，本发明的有益效果：
1)本发明把聚乙烯亚胺和(3-羧丙基)三苯基溴化膦结合在一起，可以改善量子点的水溶性和生物性能，制成具有生物靶向性的纳米材料，从而实现荧光探针的靶向作用；
2)本发明通过有效的方法将聚乙烯亚胺-(3-羧丙基)三苯基溴化膦修饰到量子点纳米颗粒表面，使得这些荧光量子点纳米颗粒可以特异性地识别细胞，制成具有生物靶向性和特异性高的纳米材料，实现荧光探针的靶向作用，其标记的细胞则可以通过多种检测方法进行检测；
3)本发明基于量子点的线粒体荧光探针的制备方法简单易行，成本较低。
附图说明
图1为实施例1中量子点CdSe(图中a)及修饰后量子点c(CdSe@PEI)和产品e(CdSe@PEI-TPP，图中c)的透射电镜图谱；
图2为实施例1中量子点CdSe及修饰后量子点c(CdSe@PEI)和产品e(CdSe@PEI-TPP)的紫外吸收图谱；
图3为实施例1中量子点CdSe及修饰后量子点c(CdSe@PEI)和产品e(CdSe@PEI-TPP)的荧光图谱；
图4为实施例1产品e(CdSe@PEI-TPP)在HeLa细胞中的共聚焦图谱；
图5为实施例1产品e(CdSe@PEI-TPP，修饰的量子点荧光探针)与线粒体共定位的共聚焦图谱。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
实验仪器名称与型号：
美国Perkin-Elmer Lambda-850紫外分光光度计；
美国Perkin-Elmer Ls55荧光分光光度计；
日本JEOL JEM-200CX透射电子显微镜；
德国Leica SP5共聚焦荧光显微镜。
实施例1
量子点a为CdSe时，制备基于量子点的线粒体荧光探针时，合成路线如下所示：
Figure BDA0002784146930000041
合成步骤具体如下：
1)制备量子点a：准确称量25.6mg CdO、227.0mg硬脂酸，移液枪吸取2.6mL十八烯(ODE)加入至25mL三颈瓶中，无水无氧条件下加热到200℃，保持此温度反应约10min，观察到溶液澄清后停止加热。冷却至室温后向三颈瓶中加入1.50g十八胺(ODA)和0.50g三正辛基氧化膦(TOPO)，无水无氧条件下加热到280℃，用注射器准确加入2mL、1M的Se前驱体(由Se粉溶于三辛基膦TOP中获得)，保持250℃反应30min后，停止反应。
后处理：加入10mL左右的正己烷稀释反应液，将稀释后获得的混合液转入试管中静置，取上清液进行下一步纯化，沉淀物丢弃。上清液和无水甲醇按照2:1的体积比混合，上层的正己烷层用甲醇反复萃取三次以上。正己烷层加入适量丙酮，离心得纯净的量子点a(CdSe)，量子点a用氯仿重新分散后4℃冰箱避光保存；
2)制备化合物c：100mL圆底烧瓶中，将0.20g聚乙烯亚胺b(PEI，1.8kDa)加入到10mL氯仿中，借助超声仪器完全溶解。在烧瓶中加入量子点a(CdSe，10.0mg)。将0.2mL 28％的氨水加入到氯仿溶解的量子点a和聚乙烯亚胺b的混合物中，使溶液pH在10左右，得到的溶液在室温下搅拌过夜。旋蒸除去氯仿，用乙醇重新溶解并离心进一步纯化，重复此操作三次后，真空干燥得聚乙烯亚胺修饰的量子点c(CdSe@PEI)；
3)制备化合物e：取(3-丙羧基)三苯基溴化膦d(TPP)10.0mg溶于3mL PBS(磷酸盐缓冲液)中，加入5mg步骤2)制备所得聚乙烯亚胺修饰的量子点c，搅拌过夜，利用静电吸附的作用使具有负电的d吸附在具有正电荷的c上，将混合液收集并离心，产物用三蒸水重新溶解并离心进一步纯化，重复此操作三次后，真空干燥得产物e(CdSe@PEI-TPP，即基于量子点的线粒体荧光探针)。
利用透射电镜对量子点a(CdSe)及修饰后的量子点c(CdSe@PEI)和产品e(CdSe@PEI-TPP)的大小、分散程度进行表征，结果见图1。图1可以看出：修饰后的量子点c和产品e在水中均分散均匀，呈球形。
利用紫外光谱和荧光光谱对量子点a(CdSe)及及修饰后的量子点c(CdSe@PEI)和产品e(CdSe@PEI-TPP)进行表征，结果见图2和3。图2可以看出：聚乙烯亚胺以及(3-羧丙基)三苯基膦修饰后产品e仍然具有量子点典型的吸收峰，改性后的量子点吸收峰相对于原来的量子点发生不同程度的红移，说明聚乙烯亚胺以及(3-羧丙基)三苯基膦已经成功负载到量子点上。图3可以看出：吸附了(3-羧丙基)三苯基膦后，荧光强度有所下降，发射光谱出现稍微的蓝移，同原来的量子点相比，产品e发射光谱带更宽，量子点之间荧光的差异是聚乙烯亚胺以及(3-羧丙基)三苯基膦在其表面的复合引起的。
利用激光共聚焦荧光显微镜对产品e进行表征，结果见图4。图4可以看出：此探针在细胞内发射红光且随样品浓度的增加荧光增强。
利用激光共聚焦荧光显微镜对产品e与线粒体共定位情况进行表征，结果见图5。图5可以看出：此荧光探针可以很好的与线粒体共定位。
实施例2
量子点a为CdSe/CdS时，制备基于量子点的线粒体荧光探针时的合成步骤如下：
1)制备量子点a：准确称量25.6mg CdO、227.0mg硬脂酸，移液枪吸取2.6mL十八烯(ODE)加入至25mL三颈瓶中，无水无氧条件下加热到200℃，保持此温度反应约10min，观察到溶液澄清后停止加热。冷却至室温后向三颈瓶中加入1.50g十八胺(ODA)和0.50g三正辛基氧化膦(TOPO)，无水无氧条件下加热到280℃，用注射器准确加入2mL、1M的Se前驱体(由Se粉溶于三辛基膦TOP中获得)，保持250℃反应30min；
然后按照CdSe包覆三层CdS壳的要求，注入定量的0.04M CdO前驱体(由CdO溶于ODE和油酸OA的混合溶液中获得)和0.04M S前驱体(由S溶于ODE中获得)。第一层，两种前驱体各0.49mL。第二层：两种前驱体各0.65mL。第三层：两种前驱体各0.85mL。每加入一层均反应20分钟。反应液冷却至室温后再进行进一步的后处理。加入适量正己烷稀释反应液，将稀释后获得的混合液转入试管中静置，取上清液进行下一步纯化，沉淀物丢弃。上清液和无水甲醇按照2:1的体积比混合，上层的正己烷层用甲醇反复浓缩萃取三次以上。正己烷层加入适量丙酮，离心得纯净的量子点a(CdSe/CdS)，量子点a可用氯仿重新分散后4℃冰箱避光保存；
2)制备化合物c：同实施例1；
3)制备化合物e：同实施例1。
实施例3
量子点a为CdSe/ZnS时，制备基于量子点的线粒体荧光探针时的合成步骤如下：
1)制备化合物a：准确称量25.6mg CdO、227.0mg硬脂酸，移液枪吸取2.6mL十八烯(ODE)加入至25mL三颈瓶中，无水无氧条件下加热到200℃，保持此温度反应约10min，观察到溶液澄清后停止加热。冷却至室温后向三颈瓶中加入1.50g十八胺(ODA)和0.50g三正辛基氧化膦(TOPO)，无水无氧条件下加热到280℃，用注射器准确加入2mL、1M的Se前驱体(由Se粉溶于三辛基膦TOP中获得)，保持250℃反应30min；
然后按照CdSe包覆三层ZnS壳的要求，注入定量的0.04M ZnO前驱体(由ZnO溶于OA和ODE的混合溶液中获得)和0.04M S前驱体(由S溶于ODE中获得)。第一层，两种前驱体各0.49mL。第二层：两种前驱体各0.65mL。第三层：两种前驱体各0.85mL。每加入一层均反应20分钟。反应液冷却至室温后再进行进一步的后处理，加入适量正己烷稀释反应液，将稀释后获得的混合液转入试管中静置，取上清液进行下一步纯化，沉淀物丢弃。上清液和无水甲醇按照2:1的体积比混合，上层的正己烷层用甲醇反复浓缩萃取三次以上。正己烷层加入适量丙酮，离心得纯净的量子点a(CdSe/ZnS)，量子点a可用氯仿重新分散后4℃冰箱避光保存；
2)制备化合物c：同实施例1；
3)制备化合物e：同实施例1。
活性实验
细胞培养：HeLa(宫颈癌细胞)和A549(腺癌人类肺泡基底上皮细胞)，细胞用含10％(v/v)胎牛血清且含1％(v/v)青链霉素混合液的1640培养基于培养瓶中培养。培养瓶置于37℃、含5％CO2且湿度为90％的培养箱中进行培养。
细胞毒性测试：实施例1至3制备得到的修饰的量子点e在HeLa和A549细胞中的细胞毒性采用MTT法测定：细胞传代培养3、4次后，当细胞生长到对数期时，将细胞用0.25％胰蛋白酶消化成单细胞悬液，采用血球计数板进行活细胞计数，调整活细胞浓度为5×104/mL接种于96孔培养板中，每孔100μL，于37℃、含5％CO2且湿度为90％的培养箱中培养24h后，吸出旧培养基，再分别加入用培养基稀释的不同浓度(10-500μg/mL)的实施例1至3制备得到的产物e样品。加入样品后的96孔板置于37℃、含5％CO2的培养箱中孵育48h，然后加入MTT 20μL/孔(2.5mg/mL)，4h后弃上清液，加入DMSO 100μL/孔，振荡10min左右，用M200酶标仪测定OD值，波长设置为570nm和690nm双波长。没有加入样品的孔的细胞存活率作为对照，设为100％，计算细胞存活率，评价样品的细胞毒性。结果见下表1。
表1实施例1至3制备得到的产物e的细胞毒性
Figure BDA0002784146930000071
表1测试了实施例1至3制备得到的聚乙烯亚胺-(3-羧丙基)三苯基溴化膦修饰的量子点纳米颗粒e对HeLa和A549细胞的体外生长抑制活性。IC50值为能使正常分裂生长的细胞数抑制到50％水平时的样品浓度值(μg/ml)，IC50值越大表明样品的细胞毒性越弱。实验结果表明：本发明基于量子点的线粒体荧光探针，即聚乙烯亚胺-(3-羧丙基)三苯基溴化膦修饰的量子点e对细胞的毒性比较小。
综上说明：本发明聚乙烯亚胺-(3-羧丙基)三苯基溴化膦修饰的量子点e可以作为靶向性线粒体荧光探针使用。

Claims (8)

1.一种基于量子点的线粒体荧光探针，其特征在于，具有如下通式：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
式中，
QDs指量子点CdSe、CdSe/CdS或CdSe/ZnS。
2.权利要求1所述基于量子点的线粒体荧光探针的制备方法，其特征在于，合成路线如下所示：
Figure 202114DEST_PATH_IMAGE002
；
具体包括如下步骤：
1）将聚乙烯亚胺b溶于氯仿中，加入量子点a，用氨水调节pH至9-11，在室温下搅拌过夜，旋转蒸发，乙醇溶解纯化，真空干燥得聚乙烯亚胺修饰的量子点c；
2）将量子点c加入(3-羧丙基)三苯基溴化膦d的PBS溶液中，搅拌过夜，离心，三蒸水溶解纯化，真空干燥即得。
3.如权利要求2所述基于量子点的线粒体荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤1）中，量子点a和聚乙烯亚胺b的质量比为1：20。
4.如权利要求2所述基于量子点的线粒体荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤2）中，量子点c和(3-羧丙基)三苯基溴化膦d的质量比为1：2。
5.如权利要求2所述基于量子点的线粒体荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤1）中，量子点a为CdSe时，经下述步骤制备获得：
将CdO、硬脂酸和十八烯混合后，在无水无氧条件下加热到180-220℃，并保持此温度至溶液澄清，冷却，加入十八胺和三正辛基氧化膦后在无水无氧条件下加热到270-290℃，加入Se前驱体，保持240-260℃反应20-40min；反应结束后加入正己烷稀释，静置，取上清液和无水甲醇混合，取上层正己烷层用甲醇萃取，再和丙酮混合，离心即得；
量子点a为CdSe/CdS时，经下述步骤制备获得：
将CdO、硬脂酸和十八烯混合后，在无水无氧条件下加热到180-220℃，并保持此温度至溶液澄清，冷却至室温，加入十八胺和三正辛基氧化膦后在无水无氧条件下加热到270-290℃，加入Se前驱体，保持240-260℃反应20-40 min；按照CdSe包覆三层CdS壳的要求注入定量的CdO前驱体和S前驱体，反应60 min；反应结束后加入正己烷稀释，静置，取上清液和无水甲醇混合，取上层正己烷层用甲醇萃取，再和丙酮混合，离心即得；
量子点a为CdSe/ZnS时，经下述步骤制备获得：
将CdO、硬脂酸和十八烯混合后，在无水无氧条件下加热到180-220℃，并保持此温度至溶液澄清，冷却至室温，加入十八胺和三正辛基氧化膦后在无水无氧条件下加热到270-290℃，加入Se前驱体，保持240-260℃反应20-40 min；按照CdSe包覆三层ZnS壳的要求注入定量的ZnO前驱体和S前驱体，反应60 min；反应结束后加入正己烷稀释，静置，取上清液和无水甲醇混合，取上层正己烷层用甲醇萃取，再和丙酮混合，离心即得。
6.如权利要求5所述基于量子点的线粒体荧光探针的制备方法，其特征在于，所述Se前驱体由Se粉溶于三辛基膦中获得，所述CdO前驱体由CdO溶于十八烯和油酸的混合溶液中获得，所述S前驱体由S溶于十八烯中获得；所述ZnO前驱体由ZnO溶于十八烯和油酸的混合溶液中获得。
7.权利要求1所述基于量子点的线粒体荧光探针在标识癌细胞线粒体荧光探针上的应用。
8.权利要求1所述基于量子点的线粒体荧光探针在标识正常细胞线粒体荧光探针上的应用。
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