CN111689877B - 一种高选择性检测汞离子荧光探针及其合成方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高选择性检测重金属汞离子荧光探针及其合成方法和应用，属于化学分析检测技术领域。本发明探针具有萘环芳烃类拟二肽异腈结构，结构式如下：

此探针的荧光团为萘环大π体系，对汞离子的响应基团为异腈基。该探针分子对汞离子有高的选择性和灵敏度，检测范围为0–1.8μmol·L^‑1，检测限为0.1μmol·L^‑1。该探针可用于水体、土壤以及生物体系中汞离子的定性或定量检测。

Description

一种高选择性检测汞离子荧光探针及其合成方法与应用

技术领域

本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及一种高选择性检测汞离子的荧光探针及其合方法和在检测汞离子方面的应用。

背景技术

汞在自然界中分布量极小却又分布广泛，是一种比较常见的江河、土壤污染金属离子，汞污染是当今世界的研究热点。汞不能在环境中自然降解，环境中的无机汞转化为有机汞被生物体吸收后，又会通过食物链富集在较高阶层的动物体内，最终进入人体，继而对人体健康造成严重的危害。过量积累的汞可能诱发强烈的中枢神经系统损伤，导致各种认知和运动障碍。鉴于汞在环境监测和临床诊断中的重要意义，因此开发高灵敏、高选择检测汞离子的方法是非常必要的。

与传统的检测方法相比，荧光法具有高灵敏度，高选择性，低检测限以及响应灵敏等特点，而且最重要的一点是荧光探针可以实现生物体内的非破坏性实时在线检测，近年来得到人们的广泛关注。经过多年的发展，已经报道了很多性能优异的荧光探针，但是其中很多探针，特别是检测汞离子荧光探针依旧受到选择性差，响应时间长，水溶性低等影响，限制了它的实际应用。

目前根据汞离子与探针分子的作用类型，已开发配位型荧光探针和反应型荧光探针两大类。配位型汞离子探针主要是将含有孤对电子的杂原子引入到识别基团中，通过分子间的配位作用，从而改变探针分子荧光团的光谱或颜色性质，达到识别汞离子的目标。但是这种络合作用力对汞离子的专一选择性不高。而反应型汞离子探针基于与探针分子之间的化学反应，生成新的反应产物，进而引起体系的荧光或紫外吸收光谱发生改变，其化学反应的专一选择性强，因此这种类型的探针具备更高的灵敏度和良好的抗阳离子干扰能力。

另外，由于汞离子对π电子具备亲和性，因此对不饱和的双键或三键具备很高的亲和性,目前文献报道在汞离子的催化作用下，炔烯烃类水解反应成为设计汞离子探针的一个类型(Lee D.N.,Kim G.J.,Kim H.J.Tetrahedron Lett.,2009,50,4766；Cho Y.S.,HanK.Tetrahedron Lett.,2010,51,3852；Ming D.,Ya W.W.,Yu P.Org.Lett.,2010,12,5310)。考虑到腈和炔成键的类似性和差异性，其在汞离子催化下产生的反应型产物的不同，可以将其用于汞离子荧光探针分子，目前未见报道。因此开发具有高选择性的新型异腈团荧光分子探针，有利于克服复杂样品的背景干扰，从而有利于复杂环境样品及生物样品的检测。

发明内容

针对现有技术情况，本发明目的是提供一种易于制备、性能稳定、具有较大斯托克斯位移值的汞离子荧光分子探针，并提供该探针的合成方法，实现高选择性和高灵敏度对汞离子的检测。

为实现本发明目的，本发明以异腈基团为汞离子的响应基团，设计大π共轭推拉体系骨架作为发光团。利用汞离子具有较强的亲核反应特性，能与异腈不饱和三键发生特异性反应，制备汞离子荧光分子探针。

所述检测汞离子的荧光分子探针，结构式如下：

其合成反应流程如下：

(1)拟二肽化合物1的合成

室温下在圆底烧瓶中加入L-缬氨酸苄酯盐酸盐，溶剂四氢呋喃，有机碱三乙胺，然后再加入1-羟基苯并三唑，6-氨基-2-萘甲酸，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)肽缩合剂，搅拌反应，反应结束后经洗涤、干燥，萃取得到有机相，再经干燥，过滤，柱层析提纯后得到化合物1；

(2)拟二肽甲酰胺化合物2的合成

在溶解有化合物1的圆底烧瓶中加入过量甲酸，在室温下搅拌反应，经TCL跟踪反应显示原料反应完全时，加入水使反应淬灭；萃取分液，有机相干燥，经旋蒸浓缩，柱层析法得到拟二肽甲酰胺化合物2；

(3)荧光探针分子1的合成

将步骤(2)中所制备的化合物2加入干燥的烧瓶中，抽真空充惰性气体，再加入三乙胺，无水二氯甲烷，在冰浴条件下搅拌进行降温；将含有固体光气的二氯甲烷溶液逐滴加入到反应体系中，待体系温度达到室温时，继续搅拌反应；反应结束后对反应进行淬灭，萃取分液，经洗涤得到有机层，经干燥，旋蒸浓缩后，粗产物经柱层析法得到荧光探针分子1；

利用该分子探针对汞离子进行定性和定量测定，用于水体、土壤或生物体系中汞离子的检测。

采用比色法或荧光法检测时，将该分子探针溶解于水与二甲基亚砜的混合缓冲溶液中，对汞离子进行测试。当加入汞离子后，汞离子能催化水解进攻异腈，并进一步通过脱除反应，生成亚硝基化合物，从而产生强烈的分子内电荷转移(ICT)效应，使探针溶液的吸收光谱发生红移至450nm，并伴随产生强的荧光发射特性。

采用荧光法检测时，所述荧光分子探针对汞离子的检测浓度为0–1.8μmol·L^-1，检测限为0.1μmol·L^-1。

本发明荧光探针分子具有如下特点和优点：

此探针具有萘环芳烃类拟二肽异腈结构，荧光团为萘环大π体系，对汞离子的响应基团为异腈基。萘环的大π体系具有很好的荧光发射性能，且通过对位酰胺基团改变原荧光分子的推拉电子体系特性从而改变其荧光性质。该荧光探针分子具有良好的稳定性和光学性质，反应前无荧光发射，随着汞离子的加入，探针分子在～450nm处有强的荧光发射性质。

本发明所述的探针分子原料易得，总合成产率较高，每步达80％以上，光学性能稳定(探针母液能在室内稳定存放三个月以上，其光谱性质保持不变)，高选择性和高灵敏度，对汞离子识别能力强，响应速度较快，响应范围为0–1.8μmol·L^-1，检测限低(0.1μmol·L^-1)，因此，该类型探针可用于水体、土壤以及生物体系中汞离子的定性或定量检测。

附图说明

图1为本发明合成的分子探针的核磁共振氢谱；

图2为本发明1μmol·L^-1分子探针在加入不同浓度汞离子后荧光发射光谱图，从a至u，汞离子浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.6、1.8、2、3、4、5μmol·L^-1，溶液体系磷酸缓冲水溶液(10mM，pH 7.4)，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图3为汞离子的浓度标准曲线图，即1μmol·L^-1本发明分子探针，反应前后在450nm处荧光发射强度和汞离子浓度的线性关系；横坐标为汞离子的浓度，纵坐标为荧光强度。

图4为本发明分子探针对汞离子选择性；即1μM本发明分子探针，加入5μmol·L^-1不同离子(空白探针、Hg²⁺、Al³⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Cr³⁺、Cu²⁺、Fe³⁺、K⁺、Li⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Na⁺、Ni²⁺、Pb^{2 +}、Sr²⁺、Zn²⁺)后，在450nm处荧光发射强度的变化；横坐标为测试的干扰离子，纵坐标为荧光强度。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：拟二肽化合物1的合成

在250mL圆底烧瓶中加入L-缬氨酸苄酯盐酸盐(1.3g,6mmol)，40mL四氢呋喃，三乙胺(2.6mL)，在室温下搅拌0.5h，然后加入6-氨基-2-萘甲酸(1.3g,6mmol)，1-羟基苯并三唑(HOBt,0.9g)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI,1.5g)。搅拌反应24小时，反应结束后经洗涤、干燥，萃取得到有机相，粗产物经柱层析提纯后得到化合物1粉红色固体1.9g，产率83％。反应式如下：

m.p.＝131.1–131.6℃,

＝+51.13(c 0.20,in CHCl₃)；¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.18-8.17(d,J＝1.2Hz,1H),7.75-7.74(t,2H),7.62-7.61(d,J＝8.6Hz,1H),7.39–7.26(q,4H),7.00–6.98(d,2H),5.27-5.17(dd,J＝27.1,12.2Hz,2H),4.91-4.88(dd,J＝8.7,4.7Hz,2H),4.01(s,2H),2.36-2.28(qd,J＝11.7,6.8Hz,2H),1.02-0.96(dd,J＝17.7,6.9Hz,6H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ172.3,167.5,146.1,136.8,135.4,130.5,128.6,128.5,128.4,127.7,126.1,124.2,118.9,107.9,67.2,57.4,33.9,31.8,19.1,17.9.

实施例2：拟二肽甲酰胺化合物2的合成

向100mL圆底烧瓶中加入甲酸(14.12mL,10.2mmol)，室温下搅拌下将称取化合物1(1.8g,4.79mmol)加入其中反应约48h。当TLC跟踪反应显示原料反应完全时，加入20mL水淬灭反应，用乙酸乙酯萃取分液，取有机层用无水硫酸钠干燥，粗产物经柱层析去除杂质，得到化合物2淡黄色固体1.6g，产率82％。反应式如下：

m.p.＝147.5–148.1℃,

＝+49.91(c 0.20,in CHCl₃)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ10.53(s,1H),8.77-8.75(d,J＝7.7Hz,1H),8.43-8.37(q,J＝14.3,12.7Hz,2H),8.01–7.99(d,J＝8.9Hz,1H),7.66(s,1H)7.41-7.32(m,4H),5.22-5.13(q,J＝12.5Hz,2H),4.40-4.36(t,J＝7.6Hz,1H).4.04-4.02(d,1H),1.02-0.95(q,4H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ172.2,159.1,135.5,131.2,130.1,128.7,128.6,128.5,128.3,127.4,125.0,124.4,120.4,119.4,116.6,114.4,67.3,57.6,31.8,19.1,17.9.

实施例3：荧光探针分子1的合成

称取化合物2(0.85g,2.1mmol)，三乙胺(0.75mL,5.5mmol,2.0eq.)，25mL无水二氯甲烷，加入干燥的烧瓶中，抽真空充氮气，置于冰浴下搅拌半个小时降温。将固体光气(BTC,443mg,1.5mmol)溶解于10mL干燥的二氯甲烷中，用注射器逐滴加入到反应体系中，升至室温后，继续搅拌3h，加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，萃取分液，盐水洗涤后，有机层用无水硫酸钠干燥。旋转蒸发除去多余溶剂，得到的粗产品用快速柱层析法进行分离，得到荧光探针分子1，黄色固体0.61g，产率81％。反应式如下：

m.p.＝128.1–128.5℃,

＝+47.48(c 0.20,in CHCl₃)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.32(s,1H),7.98-7.93(m,3H),7.52-7.50(t,1H),7.51-7.48(m,4H)6.80-6.77(d,1H),5.29-5.19(q,4H),4.92-4.88(q,1H),2.39-2.31(m,1H),1.04-0.97(dd,5H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ172.1,166.7,135.2,134.2,133.2,132.1,130.8,128.8,128.7,128.6,128.5,128.3,127.5,125.6,125.4,124.4,67.4,57.6,31.8,19.1,17.9.

实施例4：探针分子1对汞离子的荧光检测

将上述制得分子探针溶解于水与二甲基亚砜的磷酸缓冲溶液(H₂O/DMSO＝1/1,v/v,10mM,pH 7.4)，配制成1μmol·L^-1的探针溶液。在3mL的比色皿中加入2mL配制的1μmol·L^-1的本发明探针溶液，然后分别加入不同浓度的汞离子均匀混合，测试其荧光光谱，结果如图2所示。以溶液在450nm处荧光发射强度对汞离子的浓度作图，汞离子浓度在0–1.8μmol·L^-1范围内时，两者之间呈现良好的线性关系(图3)，能实现该浓度范围内汞离子的定量检测。并且此探针不受其它一些常见阳离子的影响，如Al³⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Cr³⁺、Cu²⁺、Fe³⁺、K⁺、Li⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Na⁺、Ni²⁺、Pb²⁺、Sr²⁺、Zn²⁺。在上述干扰物存在的条件下，探针对含汞离子仍具有良好的选择性和灵敏度(图4)。

可以看出，本发明能实现对汞离子的定性、定量检测，灵敏度高，检测限达0.1μmol·L^-1，且抗干扰能力极强。

Claims (4)

1.一种检测汞离子的荧光分子探针，其特征在于，结构式如下：

2.一种如权利要求1所述的检测汞离子的荧光分子探针的合成方法，其特征在于，通过如下方法实现：

(1)拟二肽化合物1的合成

室温下在圆底烧瓶中加入L-缬氨酸苄酯盐酸盐，溶剂四氢呋喃，有机碱三乙胺，然后再加入1-羟基苯并三唑，6-氨基-2-萘甲酸，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)肽缩合剂，搅拌反应，反应结束后经洗涤、干燥，萃取得到有机相，再经干燥，过滤，柱层析提纯后得到化合物1；

(2)拟二肽甲酰胺化合物2的合成

在溶解有化合物1的圆底烧瓶中加入过量甲酸，在室温下搅拌反应，经TCL跟踪反应显示原料反应完全时，加入水使反应淬灭；萃取分液，有机相干燥，经旋蒸浓缩，柱层析法得到拟二肽甲酰胺化合物2；

(3)荧光探针分子1的合成

将步骤(2)中所制备的化合物2加入干燥的烧瓶中，抽真空充惰性气体，再加入三乙胺，无水二氯甲烷，在冰浴条件下搅拌进行降温；将含有固体光气的二氯甲烷溶液逐滴加入到反应体系中，待体系温度达到室温时，继续搅拌反应；反应结束后对反应进行淬灭，萃取分液，经洗涤得到有机层，经干燥，旋蒸浓缩后，粗产物经柱层析法得到荧光探针分子1；

。

3.如权利要求1所述的以非疾病诊断或治疗为目的检测汞离子的荧光分子探针的应用，其特征在于，利用该分子探针对水体、土壤或生物体系中汞离子进行定性或定量测定。

4.如权利要求3所述的以非疾病诊断或治疗为目的检测汞离子的荧光分子探针的应用，采用荧光检测时，将所述分子探针溶解于磷酸缓冲溶液中，根据标准曲线对汞离子进行定量检测。

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