CN105985770A

CN105985770A - 一种硫化氢荧光探针的制备及应用

Info

Publication number: CN105985770A
Application number: CN201510065133.1A
Authority: CN
Inventors: 宋相志; 高丽; 刘兴江
Original assignee: SUZHOU LUOLAN BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SUZHOU LUOLAN BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2015-02-09
Filing date: 2015-02-09
Publication date: 2016-10-05

Abstract

本发明公开了一种可以用于硫化氢荧光识别的新型化合物，具体涉及一种新型荧光探针的制备方法及其应用，属于化学分析检测技术领域。其分子结构式如下：该荧光探针用于环境或生物样品中硫化氢的荧光传感分析，选择性好，抗干扰能力强，可以灵敏快速地检测出样品中的硫化氢，并具有较好的水溶性，在生物医学研究方面具有很好的应用前景。

Description

一种硫化氢荧光探针的制备及应用

技术领域

本发明涉及的是化学分析检测技术领域，具体涉及一种新型的硫化氢荧光探针的制备方法以及该荧光探针在检测硫化氢方面的应用。

背景技术

硫化氢(H₂S)是一种具有臭鸡蛋气味的毒性气体，但生物体内内源性产生的H₂S气体信息分子却可以发挥重要的生理、病理作用。目前的研究已发现其在高血压、缺氧性肺动脉高呀等疾病的发病过程中具有重要作用，因而对生物体内源性H₂S的检测在生物医学研究领域具有重大意义。检测生理浓度的H₂S对分析检测技术提出了很高的要求，与大多数分析检测方法相比，荧光探针是目前更适合在活细胞中实现高灵敏度、高选择性的便捷检测方法。目前已报导的H₂S探针的识别原理大多基于H₂S的还原性：在荧光分子内引入叠氮基团淬灭荧光，然后在H₂S作用下还原成氨基，恢复荧光。荧光探针需要实现在生物细胞内的检测，就要求其具有较好的水溶性，所以提高荧光探针的水溶性也是目前研究领域的一大挑战之一。

发明内容

本发明目的之一是提供一种合成简单、反应条件温和、成本较低的荧光探针合成方法；目的之二是提供一种灵敏度高、选择性好，抗干扰能力强，能够实现荧光法检测硫化氢的荧光探针。

本发明使用荧光法检测硫化氢，以邻苯二甲酰亚胺衍生物为荧光团，以叠氮基为硫化氢的识别基团。

本发明解决问题采取的技术方案为，一种荧光检测硫化氢荧光探针，其分子结构式为，该荧光探针的合成路线如下，

具体制备方法包括以下步骤：1)将3-硝基邻苯二甲酸酐1溶解于乙酸中，缓慢加入正丁胺，室温下搅拌10min后，加热升温，120℃控温回流2.5h。反应结束后，冷却至室温，将反应液倒入冰水中，待固体析出后，抽滤并用冷水洗涤3次，得粗产物为白色固体，无需进一步纯化，直接进行下一步。2)将上一步所得粗产物2溶解于甲醇中，加入催化量的Pd/C，将体系抽真空，通入氢气，加热搅拌，控温65℃，12h后停止反应，抽滤除去固体催化剂。将滤液减压旋干，经层析柱分离得目标产物。3)将上步得到产物3溶解在30％硫酸溶液中，冰水浴下缓慢加入亚硝酸钠溶液，继续搅拌30min后，冰浴下缓慢滴加叠氮化钠水溶液，室温继续搅拌1h后，抽滤得白色固体即为目标产物。在本说明书的实施例中更详细地说明了该探针的合成和检测方法。

本发明的荧光分子探针使用方法如下，将探针分子溶解在含有20％乙腈、pH为7.4的HEPES缓冲溶液中，室温下进行测试。当加入硫离子时，由于2,4-二硝基苯磺酰胺基团可以在硫化氢的诱导下发生的裂解，使荧光得以恢复。探针分子与硫化氢作用原理如下，

本发明的硫化氢荧光探针的具体特征如下：探针分子无明显发射峰，但与硫化氢作用后，探针分子在500nm处出现明显的发射峰，荧光强度增强了150倍以上。

本发明所述的探针分子合成简单，成本较低，对硫化氢的选择性好、抗干扰能力强、响应速度快使得该荧光探针在生物化学，环境科学等领域具有实际的应用价值。

附图说明

图1为本发明荧光探针的选择性，荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在HEPES缓冲溶液(20mM，V_乙腈/V_HEPES＝2/8，pH＝7.4)中，与不同阴离子作用后的荧光光谱，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图2为本发明荧光探针的抗干扰能力，硫离子与其他阴离子共存，与荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在缓冲溶液(V_乙腈/V_HEPES＝2/8，pH＝7.4)中作用后的荧光强度比值(I/I₀)柱状图。

图3为本发明的荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在HEPES缓冲溶液(20mM，V_乙腈/V_HEPES＝2/8，pH＝7.4)中，与不同浓度硫离子作用后的荧光光谱变化，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图4为本发明的荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在HEPES缓冲溶液(20mM，V_乙 _腈/V_HEPES＝2/8，pH＝7.4)中，与硫离子浓度的线性关系，横坐标为硫离子浓度，纵坐标为荧光强度。

图5为本发明的荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在HEPES缓冲溶液(20mM，V_乙 _腈/V_HEPES＝2/8，pH＝7.4)中，与硫离子作用过程中荧光强度随时间的变化，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度。

图6为本发明的荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在不同pH值缓冲溶液中，与硫离子作用前后的荧光强度，横坐标为pH，纵坐标为荧光强度。

具体实施方式

实施例1：化合物2的合成

将化合物1(1.9361g,10mmol)溶于20ml乙酸中，缓慢加入正丁胺(1.0951g,15mmol)，室温下搅拌10min后，加热升温，120℃回流2.5h。反应结束后，冷却至室温，将反应液倒入50ml冷水中，待固体完全析出后，减压抽滤，并用冷水洗涤滤饼三次(9ml×3)，得化合物1，为白色固体。产量：2.1252g。产量：85.7％。化合物1表征如下:¹H NMR(500MHz,DMSO)δ_H：8.27(d,J＝8.1Hz,1H),8.16(d,J＝7.5Hz,1H),8.05(t,J＝7.8Hz,1H),3.57(t,2H),1.63–1.51(m,2H),1.38–1.24(m,2H),0.90(t,3H).¹³C NMR(126MHz,DMSO)δ_C：166.51,163.86,144.63,136.54,134.05,128.62,127.17,123.50,38.13,30.24,19.94,13.94.

实施例2：化合物3的合成

上步所得化合物2(0.4964g,2mmol)溶于15ml甲醇，加入10％w/w Pd/C(0.0496g,5mol％)，将体系抽真空，通入氢气并搅拌，65℃下回流12h。反应停止后，减压抽滤除去固体催化剂，所得滤液减压旋蒸除去溶剂，经层析柱分离得化合物2。产量：0.6240g。产量：71.5％。化合物2表征如下：¹H NMR(500MHz,CDCl3)δ_H：7.42(dd,J＝8.3,7.1Hz,1H),7.16(d,J＝7.6Hz,1H),6.86(d,J＝8.8Hz,1H),5.13(s,1H),3.65(t,J＝7.3Hz,2H),1.63–1.70(m,2H),1.35–1.42(m,2H).0.95(t,J＝7.4Hz,3H).¹³C NMR(126MHz,DMSO)δ_C：170.38,168.77,145.15,135.02,132.86,120.96,112.58,111.38,37.37,30.76,20.09,13.69.

实施例3：探针分子的合成

将上步所得化合物3(100mg,0.45mmol)溶于5ml 30％硫酸中，0℃冰水浴下搅拌，缓慢滴加亚硝酸钠水溶液(41mg，0,6mmol，2mL水)。继续在0℃下搅拌30min后，缓慢滴加叠氮化钠水溶液(58mg,0.9mmol,2ml水)，滴加完毕后撤去冰水浴，室温搅拌1h后结束反应，抽滤出白色固体，干燥后得到探针分子。探针分子表征如下：¹H NMR(500MHz,CDCl3)δ_H：7.73–7.68(m,1H),7.63(d,J＝7.3Hz,1H),7.41(d,J＝8.1Hz,1H),3.69(,2H),1.93–1.52(m,2H),1.49–1.18(m,2H),0.96(t,3H).¹³C NMRδ_C:166.39,166.30,138.08,135.24,134.32,124.94,120.88,119.38,37.87,30.52,20.04,13.62

实施例5：本发明硫化氢荧光探针的应用

将探针溶于缓冲溶液(V_乙腈/V_HEPES＝2/8，pH＝7.4)中配制成5.0×10^-6mol/L的溶液，向溶液中加入F^-,Cl^-,Br^-，I^-，NO₃ ^-，NO₂ ^-，AcO^-，N₃ ^-，SO₄ ^2-，S₂SO₃ ^2-，ClO^-，SCN^-，CN^-，H₂O₂，Cys，Hcy，GSH，PO₄ ^3-，CO₃ ^2-，SO₃ ^2-没有引起荧光的变化，加入S^2-后引起了极为明显的荧光变化，该荧光探针对硫化氢表现出高灵敏度、高选择性的识别。当S^2-分别与干扰物质F^-,Cl^-,Br^-，I^-，NO₃ ^-，NO₂ ^-，AcO^-，N₃ ^-，SO₄ ^2-，S₂SO₃ ^2-，ClO^-，SCN^-，CN^-，H₂O₂，Cys，Hcy，GSH，PO₄ ^3-，CO₃ ^2-，SO₃ ^2-共存时，探针不受干扰因素的影响，表现出来很好的抗干扰能力。探针分子在pH为5至11的范围内都可以对硫化氢选择性识别，表现出了较宽的应用范围。

Claims

1.一种硫化氢荧光探针，其结构为：

。

2.如权利要求1所述的硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于按以下步骤进行制备：

(a)将3-硝基邻苯二甲酸酐溶解于乙酸中，缓慢加入正丁胺，室温下搅拌10min后，加热升温，120℃控温回流2.5h。反应结束后，冷却至室温，将反应液倒入冰水中，待固体析出后，抽滤并用冷水洗涤3次，得粗产物为白色固体，无需进一步纯化，直接进行下一步。

(b)将上一步所得粗产物2溶解于甲醇中，加入催化量的Pd/C，将体系抽真空，通入氢气，加热搅拌，控温65℃，12h后停止反应，抽滤除去固体催化剂。将滤液减压旋干，经层析柱分离得目标产物。

(c)将上步得到产物3溶解在30％硫酸溶液中，冰水浴下缓慢加入亚硝酸钠溶液，继续搅拌30min后，冰浴下缓慢滴加叠氮化钠水溶液，室温继续搅拌1h后，抽滤得白色固体即为探针分子。

3.根据权利要求1所述的硫化氢荧光探针的用途，其特征在于该硫化氢荧光探针用于环境或生物样品中硫化氢的荧光检测和分析。