CN105712964A - 一种基于香豆酰肼的硫醇荧光探针的制备方法及应用 - Google Patents

一种基于香豆酰肼的硫醇荧光探针的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于香豆酰肼的硫醇荧光探针的制备方法及应用，以香豆酰肼和对叔丁基苯酚二醛为原料合成了一种双席夫碱香豆素类衍生物(化合物Ⅰ)，化合物Ⅰ本身具有较强的荧光，在与铜离子配位后制成了香豆素－铜离子(Ⅱ)配合物,即为硫醇荧光探针Ⅰ?Cu(Ⅱ)。该探针由于Cu2+的顺磁性及光诱导电子转移作用的影响，使化合物Ⅰ的荧光淬灭。而巯基氨基酸及其衍生物如谷胱甘肽等化合物中的硫原子与Cu2+具有更强的配位作用，这种竞争配位作用导致香豆素－铜离子(Ⅱ)配合物中的铜离子被巯基氨基酸及其衍生物夺走，重新生成化合物Ⅰ，从而恢复化合物Ⅰ的荧光。基于此本发明建立了一种快速、简便的检测硫醇化合物的方法。

Description

一种基于香豆酰肼的硫醇荧光探针的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及硫醇检测技术，具体涉及一种基于香豆酰肼的硫醇荧光探针的制备方法及应用。
背景技术
巯基(-SH)在细胞中具有较高的化学活性。谷胱甘肽(L-γ-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸,glutathione)是一种同时具有谷氨酰基和巯基的生物活性三肽化合物。临床上，谷胱甘肽可以迅速提高机体免疫力，在抗氧化、抗辐射、清除自由基、解毒、促进铁质吸收等方面具有良好的效果且无副作用。它在细胞内氧化还原活动，异生物质的代谢，细胞内信号传导和基因调控等许多细胞功能中起到重要作用。谷胱甘肽对于放射线、放射性药物所引起的白细胞减少等症状，有强有力的保护作用。有许多疾病，如早期动脉硬化、肺病、结肠癌、白血病、阿尔海默症和帕金森病患者等发病时，谷胱甘肽水平发生异常。对人体血浆、组织、细胞中谷胱甘肽含量的测定和研究，可以提供关于细胞对氧化应激的保护及反应状态的信息。含硫醇的物质在生物系统中的水平的评估可以有助于某些疾病的早期诊断。
荧光分子成像技术是近年发展迅速的一种新兴的分子成像技术，它利用具有特异性的荧光分子探针标记特定的分子或细胞，从分子和细胞水平上对正常或异常的生物过程进行空间和时间上的视觉描述，是一种非侵入式的成像方式。荧光探针具有高的荧光量子产率、长的分析波长、良好的生物兼容性、稳定性、选择性、灵敏度，以及动态响应范围宽等诸多优点，尤其是荧光法能够实现对活体的灵敏、原位、实时成像，近年来在生物化学、细胞生物学、环境科学、分子生物学等科学领域有广泛的应用，成为目前广泛采用的检测细胞内硫醇类物质的一种重要手段。香豆素类荧光团分子摩尔吸光系数较大，荧光量子产率较高，因此香豆素类染料常被用作为发色基团来合成高效的荧光探针。香豆素分子易于衍生和修饰，而且激发波长在可见区，这些特点使其成为了荧光探针设计和合成中优秀的候选荧光团。
目前测定硫醇化合物含量的方法有多种，如高效毛细管电泳法、电化学法、荧光分析法和近些年发展的高效液相色谱法等。目前对于谷胱甘肽的测定还没建立一个既十分灵敏、特异，又十分快速、稳定、经济的方法。硫醇化合物的各种测定方法各有其优点，有的灵敏度高，有的快速可靠，有的可区分开各种成分；同时避免不了一些问题出现，例如有的制备工艺较为复杂，有的对硫醇化合物中的各种成分的测定区分不开，有的实验条件较为苛刻等。因此，方便廉价、能够定性定量分析生物硫醇，并且可以对生物样品进行实时检测的方法非常重要。如同荧光分析法在检测金属离子获得广泛应用一样，在众多检测生物硫醇的方法中，荧光分析法具有操作简便、直观等优点，适于巯基物质成像分析，因而引起了人们的广泛关注。该方法反应速度快，硫醇化合物和荧光物质通常在室温下即可测定，灵敏度较高，有一定的稳定性，一些荧光加合反应有一定的专一性。因此，设计合成荧光探针以检测谷胱甘肽等小分子生物硫醇具有重要的意义。
目前检测硫醇的探针多为检测硫醇化合物的总量，例如利用硫醇化合物中的巯基的亲核性检测硫醇的荧光探针，利用巯基和二硫键的氧化还原反应检测硫醇的荧光探针，利用巯基与金属离子络合能力检测硫醇的荧光探针，该类硫醇荧光探针设计容易，但是很难把半胱氨酸、同型半胱氨酸和还原型谷胱甘肽进行区分。而利用醛基、氨基和巯基的共同作用检测硫醇化合物，则可以实现对某一种硫醇分子特异性的识别，例如半胱氨酸或同型半胱氨酸的共轭加成环化反应、半胱氨酸或同型半胱氨酸的醛成环反应、半胱氨酸与醛基缩合再与双键加成成环反应、半胱氨酸发生分子内亲核取代反应、亲核取代-加成成环反应等，但这类探针设计较为困难，因此设计合成更多可以针对生物体内不同种类硫醇分子分析检测的特异性荧光分子探针更加重要。
近年来检测巯基物质的光学探针的研究发展极为迅速，所报道的探针在生理条件下大多有着较好的分析性能，且探针信号变化受环境因素(如pH值、温度和极性等)的影响较小，从而为生物样品中巯基物质的测定和细胞成像研究提供了重要的物质基础。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种基于香豆酰肼的硫醇荧光探针的制备方法及应用。
本发明的技术方案是：一种基于香豆酰肼的硫醇荧光探针的制备方法，以香豆酰肼和对叔丁基苯酚二醛为原料合成了一种席夫碱结构的香豆素类衍生物，其在与铜离子络合后制成了席夫碱结构的香豆素类－铜离子(Ⅱ)配合物硫醇荧光探针。
本发明的进一步改进包括：
将0.3028g的香豆酰肼(1.1mmol，Mw＝275.3031)溶于最少量的乙醇中，加入0.1031g的对叔丁基苯酚二醛(0.5mmol，Mw＝206.2378)；氮气保护下，加热回流12小时，点板监测反应，冷却后有沉淀析出，所得沉淀抽滤，并用乙醇洗涤数次，即得对叔丁基苯酚二醛香豆酰肼，即化合物Ⅰ。
将5.1374g的对叔丁基苯酚(34.2mmol，Mw＝150.2176)和9.6028g的六次甲基四胺(68.5mmol，Mw＝140.1863)溶于60mL的三氟乙酸溶液中，氮气保护下回流24h，冷却到室温，倒入4mol/L的HCl溶液中，搅拌30min，用100mL CH2Cl2萃取2次，有机相加水调pH至中性，再用100mL CH2Cl2萃取2次，用200mL水洗涤；无水Na2SO4干燥，旋蒸得到黄色油状液体，粗产品用硅胶色谱柱提纯，得浅黄色固体即对叔丁基苯酚二醛。
7.7297g的4-二乙基氨基水杨醛(0.04mol，Mw＝193.2423)，12.8134g的丙二酸二乙酯(0.08mol，Mw＝160.1678)和4mL哌啶在120mL无水乙醇中混和，混合液在搅拌条件下回流6小时，冷却到室温，旋蒸至乙醇溶剂不再蒸出，得到少量油状液体即为7-N,N-二甲基氨基-2-氧-2H-3-香豆酸酯。将4.3399g的7-N,N-二甲基氨基-2-氧-2H-3-香豆酸酯(15mmol，Mw＝289.3264)溶于40毫升乙醇中，加入3.64mL的80％水合肼(60mmol)，室温搅拌12分钟后，冰水中冷却15分钟。所得沉淀抽滤，粗产品用硅胶色谱柱提纯，即得产物香豆酰肼。
本发明的另一目的在于提供了一种基于香豆酰肼的硫醇荧光探针，按照上述的方法制得。
本发明还提供了一种基于香豆酰肼的硫醇荧光探针在谷胱甘肽检测中的应用。
本发明进一步提供了一种基于香豆酰肼的硫醇荧光探针在硫醇化合物检测中的应用。
化合物Ⅰ本身具有较强荧光，而探针Ⅰ-Cu(Ⅱ)为弱荧光化合物，随着硫醇化合物的加入，硫醇基团的脱金属作用使探针Ⅰ-Cu(Ⅱ)释放出化合物Ⅰ，这样就与探针Ⅰ-Cu(Ⅱ)产生了很大的荧光变化，从而达到检测硫醇化合物的目的。
本发明以香豆酰肼和对叔丁基苯酚二醛为原料合成了一种双席夫碱香豆素类衍生物(化合物Ⅰ)，化合物Ⅰ本身具有较强的荧光，在与铜离子配位后制成了席夫碱结构的香豆素类－铜离子(Ⅱ)配合物,即为硫醇荧光探针Ⅰ-Cu(Ⅱ)。该探针由于Cu2+的顺磁性及光诱导电子转移作用的影响，使化合物Ⅰ的荧光淬灭。而巯基氨基酸及其衍生物如谷胱甘肽等化合物中的硫原子与Cu2+具有更强的配位作用，这种竞争配位作用导致香豆素－铜离子(Ⅱ)配合物中的铜离子被巯基氨基酸及其衍生物夺走，重新生成化合物Ⅰ，从而恢复化合物Ⅰ的荧光。基于此本发明建立了一种快速、简便的检测硫醇化合物的方法。
探针Ⅰ-Cu(Ⅱ)在CH3CN:H2O(3:2,v/v)溶液中对含有巯基的氨基酸具有良好的选择性，其他非巯基氨基酸对探针Ⅰ-Cu(Ⅱ)的荧光影响很小，共存时也不会干扰谷胱甘肽对探针Ⅰ-Cu(Ⅱ)的增强响应，并成功用于人子宫颈鳞癌细胞SiHa细胞中进行了检测谷胱甘肽的细胞成像实验。
巯基氨基酸对铜离子(Cu2+)的高亲和能力促使配合物脱铜可能是其实现荧光增强识别的机制，从而实现了该探针对含巯基氨基酸及其衍生物如谷胱甘肽的检测，是一种选择性好、抗干扰能力强的硫醇荧光探针。此外，探针具有细胞膜渗透性和低细胞毒性，还具有良好的光化学稳定性。因此，该探针适用于检测在活细胞中硫醇化合物的水平，有望用于生物体内硫醇化合物的检测。
附图说明
图1是化合物Ⅰ(10μmol/L)对各种金属离子的的紫外-可见吸收光谱。
图2是化合物Ⅰ(10μmol/L)对铜离子的紫外-可见滴定光谱。
图3是化合物Ⅰ(10μmol/L)对各种金属离子的的荧光光谱响应。
图4是化合物Ⅰ(10μmol/L)对铜离子的荧光滴定光谱。
图5是化合物Ⅰ-Cu(Ⅱ)(10μmol/L)对GSH的的荧光滴定光谱。
图6是化合物Ⅰ-Cu(Ⅱ)(10μmol/L)对不同氨基酸的荧光强度。
图7a是化合物Ⅰ标记的SiHa细胞在蓝光激发下的荧光图像。
图7b是探针Ⅰ-Cu(Ⅱ)标记的SiHa细胞在蓝光激发下的荧光图像。
图7c是探针Ⅰ-Cu(Ⅱ)+GSH标记的SiHa细胞在蓝光激发下的荧光图像。
图7d是化合物Ⅰ标记的SiHa细胞所对应的明场。
图7e是探针Ⅰ-Cu(Ⅱ)标记的SiHa细胞所对应的明场。
图7f是探针Ⅰ-Cu(Ⅱ)+GSH标记的SiHa细胞所对应的明场。
图8是化合物Ⅰ的氢谱图。
图9是化合物Ⅰ的碳谱图。
图10是化合物Ⅰ的高分辨质谱图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做详细说明。
本发明所用仪器和试剂在无特别说明时均为商业途径获得。
1实验部分
1.1材料与试剂
对叔丁基苯酚，三氟乙酸，4-二乙基氨基水杨醛，哌啶，无水乙醇，丙二酸二乙酯，二氯甲烷，乙酸乙酯，乙腈，水合肼，六次甲基四胺，NaOH，HCl，无水Na2SO4，L-半胱氨酸、N-乙酰-半胱氨酸、L-高半胱氨酸、谷胱甘肽、L-色氨酸、L-甘氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，上述试剂均为分析纯。胎牛血清，青霉素，DMEM培养基。
1.2主要仪器
三用紫外分析仪，紫外-可见分光光度计，荧光分光光度计，高效液相色谱/高分辨质谱联用仪，核磁共振波谱仪，荧光倒置显微镜，高速台式冷冻离心机，CO2细胞培养箱，恒温水浴振荡器，-80℃超低温冰箱，超净工作台，循环水式真空泵，旋转蒸发仪，超声波清洗器，真空干燥箱，电热恒温鼓风干燥箱，集热式恒温加热磁力搅拌器。
1.3方法
1.3.1对叔丁基苯酚二醛的制备
合成路线
将5.1374g的对叔丁基苯酚(34.2mmol，Mw＝150.2176)和9.6028g的六次甲基四胺(68.5mmol，Mw＝140.1863)溶于60mL的三氟乙酸溶液中，氮气保护下回流24h，冷却到室温，倒入4mol/L的HCl溶液中，搅拌30min，用100mL CH2Cl2萃取2次，有机相加水调pH至中性，再用100mL CH2Cl2萃取2次，用200mL水洗涤；无水Na2SO4干燥，旋蒸得到黄色油状液体，粗产品用硅胶色谱柱提纯，得浅黄色固体即对叔丁基苯酚二醛。
1.3.2化合物Ⅰ(对叔丁基苯酚二醛香豆酰肼)的制备
合成路线
7.7297g的4-二乙基氨基水杨醛(0.04mol，Mw＝193.2423)，12.8134g的丙二酸二乙酯(0.08mol，Mw＝160.1678)和4mL哌啶在120mL无水乙醇中混和，混合液在搅拌条件下回流6小时，冷却到室温，旋蒸至乙醇溶剂不再蒸出，得到少量油状液体即为A(7-N,N-二甲基氨基-2-氧-2H-3-香豆酸酯)。将4.3399g的A(15mmol，Mw＝289.3264)溶于40毫升乙醇中，加入3.64mL的80％水合肼(60mmol)，室温搅拌12分钟后，冰水中冷却15分钟。所得沉淀抽滤，粗产品用硅胶色谱柱提纯(流动相乙酸乙酯)，即得产物B(香豆酰肼)。
将0.3028g的香豆酰肼(1.1mmol，Mw＝275.3031)溶于最少量的乙醇中，加入0.1031g的对叔丁基苯酚二醛(0.5mmol，Mw＝206.2378)。氮气保护下，加热回流12小时。点板监测反应。冷却后有沉淀析出，所得沉淀抽滤，并用乙醇洗涤数次，即得化合物Ⅰ，化合物Ⅰ的结构表征：1H NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)11.920(s,2H),8.857(s,2H),8.599(s,2H),7.768(s,2H),7.514(d,2H,J＝9.2Hz),6.728(d,2H,J＝8.8Hz),6.576(s,2H),5.358(s,1H),3.524-3.472(q,8H,J＝6.8Hz),1.368(s,9H),1.295-1.260(t,12H,J＝6.8Hz).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ(ppm)162.734,159.559,157.815,155.680,152.884,149.100,142.128,131.492,110.373,108.967,108.719,96.755,45.311,34.290,31.428,12.440.ESI-MS:m/z:721.3317,[L+H]+；m/z:743.3145,[L+Na]+.
1.3.3细胞培养
培养：SiHa细胞在DMEM培养基中进行培养，并加入10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素。细胞5％CO2，37℃的环境下进行孵育，当细胞饱和度超过70％后进行细胞传代。
接种：加含10％FBS的DMEM完全培养基于12孔板，于37℃，5％CO2孵箱中常规培养12h。
计数和照相：通过倒置生物显微镜观察12孔板细胞数量和状态。
2结果与讨论
2.1检测机理
通过对加入硫醇化合物前后的荧光光谱分析，可能的检测机理：化合物Ⅰ本身具有较强荧光，而探针Ⅰ-Cu(Ⅱ)为弱荧光化合物，随着硫醇化合物的加入，硫醇基团的脱金属作用使探针Ⅰ-Cu(Ⅱ)释放出化合物Ⅰ，这样就与探针Ⅰ-Cu(Ⅱ)产生了很大的荧光变化，从而达到检测硫醇化合物的目的。
2.2化合物Ⅰ(10μmol/L)对Cu2+的紫外吸收和荧光光谱响应
在CH3CN:H2O(3:2，v/v)溶液中，化合物Ⅰ(10μmol/L)的紫外吸收光谱如图2所示，最大紫外吸收在445nm处。随着Cu(ClO4)2·6H2O的加入，化合物Ⅰ的紫外吸收逐渐减弱，当加入2倍量的Cu2+后，化合物Ⅰ的紫外滴定达到平衡。在CH3CN:H2O(3:2，v/v)溶液中，化合物Ⅰ(10μmol/L)对各种金属离子的紫外吸收光谱如图1所示。除了Cu2+，某些金属离子如Co2+出现类似的响应，而其他金属离子几乎无干扰。
在CH3CN:H2O(3:2，v/v)溶液中，随着Cu2+的加入，化合物Ⅰ(10μmol/L)的荧光滴定光谱如图4所示。以445nm激发，化合物Ⅰ在485nm处显示出很强的荧光发射峰。随着Cu2+的加入,荧光强度逐渐减弱，当加入2倍量Cu2+后，趋于平衡。化合物Ⅰ-Cu(Ⅱ)的低荧光强度有可能是铜离子通过PET机制或顺磁性猝灭机制淬灭效应的结果。化合物Ⅰ对各种金属离子的荧光响应如图3所示。然而，某些金属离子如Co2+、Fe2+、Zn2+，表现出相似的淬灭响应。
2.3探针Ⅰ-Cu(Ⅱ)对硫醇的荧光光谱响应
随着硫醇如谷胱甘肽的加入，由于硫醇的脱金属作用，硫醇探针Ⅰ-Cu(Ⅱ)释放化合物Ⅰ，荧光逐渐恢复。如图5所示。在CH3CN:H2O(3:2，v/v)溶液中，随着谷胱甘肽的加入，化合物Ⅰ-Cu(Ⅱ)的荧光强度逐渐增加，当加入1.7倍量GSH后，趋于平衡。因此化合物Ⅰ-Cu(Ⅱ)在荧光响应上，可用于检测硫醇。
为了进一步探索化合物Ⅰ-Cu(Ⅱ)对硫醇具有高选择性，进行了化合物Ⅰ-Cu(Ⅱ)(10μmol/L,CH3CN:H2O＝3:2，v/v)与其它可能影响荧光强度的氨基酸的荧光光谱实验。如图6所示。第一栏代表加入不同氨基酸后的荧光强度；第二栏代表同时加入GSH和非巯基氨基酸后的荧光强度。硫醇探针Ⅰ-Cu(Ⅱ)自身的荧光强度很弱，当分别加入2倍量的巯基氨基酸，如L-半胱氨酸、N-乙酰-半胱氨酸、L-高半胱氨酸和GSH，荧光强度明显增强。作为对照，当分别加入2倍量的L-色氨酸、L-甘氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等非巯基氨基酸时，荧光强度没有明显变化。然而，在加入非巯基氨基酸后，继续加入同等倍数的GSH，荧光强度明显增强。表明化合物Ⅰ-Cu(Ⅱ)对硫醇在光谱上有特殊的响应，而且硫醇的这种特殊响应不受其它竞争氨基酸的干扰。以上实验证明化合物Ⅰ-Cu(Ⅱ)对巯基氨基酸具有很好的选择性。
2.4细胞成像
荧光探针通过活细胞成像对细胞进行检测非常重要。在宫颈癌细胞中实现了化合物Ⅰ-Cu(Ⅱ)对GSH的荧光成像实验。在荧光显微成像前，将SiHa细胞于12孔培养板中培养12小时。然后，将化合物Ⅰ(2μM)与细胞在37℃孵育60分钟，用PBS(磷酸盐缓冲溶液)淋洗两次。在Nikon Eclipse TE2000-S倒置荧光显微镜下观察(蓝光激发)，化合物Ⅰ在SiHa细胞显示出明显的细胞内绿色荧光(图7a)，这表明，化合物Ⅰ有细胞渗透性。当化合物Ⅰ中加入3倍量Cu2+后，荧光淬灭(图7b)。然而，再加入6倍量GSH后，细胞内荧光强度显著增强(图7c)。图7d、7e、7f分别为化合物Ⅰ、化合物Ⅰ-Cu(Ⅱ)、化合物Ⅰ-Cu(Ⅱ)+GSH所对应的明场。在整个实验过程(约1～2小时)中，细胞具有可视化，没有明显的毒性和副作用。荧光成像实验表明硫醇荧光探针Ⅰ-Cu(Ⅱ)可用于活细胞中GSH的检测。
本发明以香豆酰肼和对叔丁基苯酚二醛为原料合成了一种席夫碱结构的香豆素类衍生物，其在与铜离子络合后制成了席夫碱结构的香豆素类－铜离子(Ⅱ)配合物硫醇荧光探针。通过紫外—可见吸收光谱和荧光光谱研究表明，该探针在CH3CN:H2O(3:2,v/v)溶液中对含巯基氨基酸和谷胱甘肽具有良好的选择性，其他非巯基氨基酸对配合物探针的荧光影响很小，共存时也不会干扰探针对硫醇化合物的增强响应。此外，探针具有细胞膜渗透性和低细胞毒性。因此，该探针适用于检测在活细胞中含硫醇化合物的水平，可用于生物体内硫醇化合物的检测。
本发明以香豆酰肼和对叔丁基苯酚二醛为原料合成了一种双席夫碱香豆素类衍生物(化合物Ⅰ)，化合物Ⅰ本身具有较强的荧光，在与铜离子配位后制成了席夫碱结构的香豆素类－铜离子(Ⅱ)配合物,即为硫醇荧光探针Ⅰ-Cu(Ⅱ)。该探针由于Cu2+的顺磁性及光诱导电子转移作用，使化合物1荧光淬灭。而巯基氨基酸与Cu2+具有更强的配位作用，特别是谷胱甘肽，这种竞争配位作用导致化合物Ⅰ的荧光恢复。基于此本发明建立了一种快速、简便的检测硫醇化合物的方法。
探针Ⅰ-Cu(Ⅱ)在CH3CN:H2O(3:2，v/v)溶液中对含有巯基的氨基酸具有良好的选择性，其他非巯基氨基酸对探针Ⅰ-Cu(Ⅱ)的荧光影响很小，共存时也不会干扰谷胱甘肽对探针Ⅰ-Cu(Ⅱ)的增强响应，并成功用于人宫颈鳞癌SiHa细胞中，进行了检测谷胱甘肽的生物成像实验。
巯基氨基酸对铜离子(Cu2+)的高亲和能力促使配合物脱铜可能是其实现荧光增强识别的机制，从而实现了该探针对含巯基氨基酸和谷胱甘肽的检测，是一种选择性好、抗干扰能力强的硫醇荧光探针。此外，探针具有细胞膜渗透性和低细胞毒性，还具有良好的光化学稳定性。因此，该探针适用于检测在活细胞中硫醇化合物的水平，有望用于生物体内硫醇化合物的检测。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (8)

1.一种基于香豆酰肼的硫醇荧光探针的制备方法，其特征在于，以香豆酰肼和对叔丁基苯酚二醛为原料合成了一种席夫碱结构的香豆素类衍生物，其在与铜离子络合后制成了席夫碱结构的香豆素类－铜离子(Ⅱ)配合物硫醇荧光探针。
2.根据权利要求1所述的一种基于香豆酰肼的硫醇荧光探针的制备方法，其特征在于，将0.3028g的香豆酰肼(1.1mmol，Mw＝275.3031)溶于最少量的乙醇中，加入0.1031g的对叔丁基苯酚二醛(0.5mmol，Mw＝206.2378)；氮气保护下，加热回流12小时，点板监测反应，冷却后有沉淀析出，所的沉淀抽滤，并用乙醇洗涤数次，即得对叔丁基苯酚二醛香豆酰肼，即化合物Ⅰ。
3.根据权利要求2所述的一种基于香豆酰肼的硫醇荧光探针的制备方法，其特征在于，将5.1374g的对叔丁基苯酚(34.2mmol，Mw＝150.2176)和9.6028g的六次甲基四胺(68.5mmol，Mw＝140.1863)溶于60mL的三氟乙酸溶液中，氮气保护下回流24h，冷却到室温，倒入4mol/L的HCl溶液中，搅拌30min，用100mL CH2Cl2萃取2次，有机相加水调pH至中性，再用100mL CH2Cl2萃取2次，用200mL水洗涤；无水Na2SO4干燥，旋蒸得到黄色油状液体，粗产品用硅胶色谱柱提纯，得浅黄色固体即对叔丁基苯酚二醛。
4.根据权利要求1所述的一种基于香豆酰肼的硫醇荧光探针的制备方法，其特征在于，7.7297g的4-二乙基氨基水杨醛(0.04mol，Mw＝193.2423)，12.8134g的丙二酸二乙酯(0.08mol，Mw＝160.1678)和4mL哌啶在120mL无水乙醇中混和，混合液在搅拌条件下回流6小时，冷却到室温，旋蒸至乙醇溶剂不再蒸出，得到少量油状液体即为7-N,N-二甲基氨基-2-氧-2H-3-香豆酸酯。将4.3399g的7-N,N-二甲基氨基-2-氧-2H-3-香豆酸酯(15mmol，Mw＝289.3264)溶于40毫升乙醇中，加入3.64mL的80％水合肼(60mmol)，室温搅拌12分钟后，冰水中冷却15分钟。所得沉淀抽滤，粗产品用硅胶色谱柱提纯，即得产物香豆酰肼。
5.一种基于香豆酰肼的硫醇荧光探针，其特征在于，按照权利要求1-4任一项所述的方法制得。
6.一种基于香豆酰肼的硫醇荧光探针在谷胱甘肽检测中的应用。
7.一种基于香豆酰肼的硫醇荧光探针在硫醇化合物检测中的应用。
8.根据权利要求所述的一种基于香豆酰肼的硫醇荧光探针在硫醇化合物检测中的应用，其特征在于，化合物Ⅰ本身具有较强荧光，而探针Ⅰ-Cu(Ⅱ)为弱荧光化合物，随着硫醇化合物的加入，硫醇基团的脱金属作用使探针Ⅰ-Cu(Ⅱ)释放出化合物Ⅰ，这样就与探针Ⅰ-Cu(Ⅱ)产生了很大的荧光变化，从而达到检测硫醇化合物的目的。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107382814A (zh) * 2017-09-06 2017-11-24 广东工业大学 一种基于苝的小分子荧光探针及其制备方法和应用
CN107417681A (zh) * 2017-06-15 2017-12-01 安徽大学 一种含有香豆素‑噻二唑基席夫碱荧光探针化合物及其制备方法和用途
CN108299414A (zh) * 2018-01-25 2018-07-20 南京工业大学 一种选择性检测生物硫醇的铁（ⅲ）配合物的双光子荧光探针
CN109770853A (zh) * 2019-01-30 2019-05-21 上海师范大学 一种斑马鱼伤口检测方法
CN110128388A (zh) * 2019-05-29 2019-08-16 温州医科大学 一种以cs为荧光团的小分子荧光探针及其制备方法与应用
CN111157505A (zh) * 2020-01-17 2020-05-15 天津师范大学 一种检测溶液中含硫污染物巯基乙酸的方法
CN113548981A (zh) * 2021-08-05 2021-10-26 齐鲁工业大学 三苯胺酚类化合物及其制备方法与其检测色氨酸的应用
CN113817010A (zh) * 2021-08-19 2021-12-21 西北农林科技大学 一种水溶性多功能糖基荧光探针及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GUANGJIE HE等: "A New copper(II) selective fluorescence probe based on naphthalimide:Synthesis,mechanism and application in living cells", 《INORGANIC CHEMISTRY COMMUNICATIONS》 *
JING-CAN QIN等: "FRET-based rhodamine-coumarin conjugate as a Fe3+ selective ratiometric fluorescent sensor in aqueous media", 《TETRAHEDRON》 *
恩达等: "香豆素-铜离子（II）配合物硫醇荧光探针的合成及荧光性质", 《精细化工》 *
赵秀文等: "基于香豆酰肼的高选择性的铜离子荧光探针", 《发光学报》 *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107417681A (zh) * 2017-06-15 2017-12-01 安徽大学 一种含有香豆素‑噻二唑基席夫碱荧光探针化合物及其制备方法和用途
CN107417681B (zh) * 2017-06-15 2020-01-17 安徽大学 一种含有香豆素-噻二唑基席夫碱荧光探针化合物及其制备方法和用途
CN107382814A (zh) * 2017-09-06 2017-11-24 广东工业大学 一种基于苝的小分子荧光探针及其制备方法和应用
CN107382814B (zh) * 2017-09-06 2018-10-09 广东工业大学 一种基于苝的小分子荧光探针及其制备方法和应用
CN108299414B (zh) * 2018-01-25 2019-12-06 南京工业大学 一种选择性检测生物硫醇的铁(ⅲ)配合物的双光子荧光探针
CN108299414A (zh) * 2018-01-25 2018-07-20 南京工业大学 一种选择性检测生物硫醇的铁（ⅲ）配合物的双光子荧光探针
CN109770853A (zh) * 2019-01-30 2019-05-21 上海师范大学 一种斑马鱼伤口检测方法
CN109770853B (zh) * 2019-01-30 2022-01-14 上海师范大学 一种斑马鱼伤口检测方法
CN110128388A (zh) * 2019-05-29 2019-08-16 温州医科大学 一种以cs为荧光团的小分子荧光探针及其制备方法与应用
CN111157505A (zh) * 2020-01-17 2020-05-15 天津师范大学 一种检测溶液中含硫污染物巯基乙酸的方法
CN113548981A (zh) * 2021-08-05 2021-10-26 齐鲁工业大学 三苯胺酚类化合物及其制备方法与其检测色氨酸的应用
CN113548981B (zh) * 2021-08-05 2023-04-28 齐鲁工业大学 三苯胺酚类化合物及其制备方法与其检测色氨酸的应用
CN113817010A (zh) * 2021-08-19 2021-12-21 西北农林科技大学 一种水溶性多功能糖基荧光探针及其应用
CN113817010B (zh) * 2021-08-19 2023-03-14 西北农林科技大学 一种水溶性多功能糖基荧光探针及其应用

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