CN113817010A - 一种水溶性多功能糖基荧光探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水溶性多功能糖基荧光探针，该水溶性多功能糖基荧光探针的化学式如下式所示：

Description

一种水溶性多功能糖基荧光探针及其应用

技术领域

本发明属于化学分析检测技术领域，涉及一种水溶性多功能糖基荧光探针，以及采用该水溶性多功能糖基荧光探针在硫化氢检测、谷胱甘肽检测、肿瘤细胞成像和循环肿瘤细胞检测中的应用。

背景技术

硫化氢(H₂S)极易溶于水，形成硫负离子(S^2-)，具有较强的毒性，即使在低浓度下也被认为是有毒的常见阴离子之一。若在水中浓度过高，不仅会对水生生物造成严重影响，还可能使人粘膜受到刺激、昏迷甚至呼吸麻痹。在我国,硫化氢的含量是饮用水及地表水检测的常用指标之一。因此，有必要通过有效的手段，来检测水性介质中的S^2-。

还原型谷胱甘肽(GSH)是哺乳动物细胞内广泛存在的一种抗氧化剂，可保护细胞免受有害重金属、过氧化物和自由基引起的损害。多种疾病，如肝损伤、癌症、骨质疏松症、心血管疾病、阿尔兹海默症等，都与GSH稳态失调相关。肿瘤组织内部处于乏氧状态，造成了肿瘤组织ROS水平升高。为维持细胞氧化还原平衡，肿瘤细胞会上调GSH，导致肿瘤细胞内GSH浓度比正常细胞高出百倍。因此，有必要通过有效的手段，来对GSH进行检测。

与传统的检测手段相比荧光探针具有操作方便、原位检测、时空分辨率高、灵敏度高和选择性强等优点，已被广泛的应用于化学分析、生物分析以及生物动态过程实时、非侵入性监测。

近年来，虽已开发出多种用于检测S^2-和GSH的荧光探针，但具有同时用于水中S^2-快速检测、GSH快速检测和以GSH为响应因素的肿瘤细胞成像和循环肿瘤细胞检测的多功能荧光探针还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种水溶性好、灵敏度高、响应速度快、荧光寿命长、特异性强的水溶性多功能糖基荧光探针，并将该水溶性多功能糖基荧光探针制备成检测用品，应用于硫化氢检测、谷胱甘肽检测、肿瘤细胞成像和循环肿瘤细胞检测中。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种水溶性多功能糖基荧光探针，其特征在于，该水溶性多功能糖基荧光探针的化学式如下I式所示：

式中，R₁为糖基配体，选择葡萄糖、氨基葡萄糖、半乳糖、氨基半乳糖、乳糖、甘露糖、岩藻糖或其它糖类化合物；R₂为阴离子，选择可溶性铜盐的阴离子；n为0-100的整数。

本发明的水溶性多功能糖基探针的荧光性质稳定，制备成检测用品后也具有稳定的性质，可用于复杂环境中H₂S的检测、GSH的检测、肿瘤细胞成像和循环肿瘤细胞检测。

以葡萄糖为靶向基团、高氯酸铜六水合物为络合基团、n＝3为例，上述水溶性多功能糖基荧光探针的制备方法包括如下步骤：

第一步：将化合物1、化合物2、无水碳酸钾溶于N，N-二甲基甲酰胺溶液中，回流反应18小时，反应停止后，用乙酸乙酯进行萃取，收集有机相，旋干溶剂，经柱层析纯化得到化合物3。

第二步：向化合物3和化合物4的水与四氢呋喃的混合液中加入五水合硫酸铜和抗坏血酸钠的水溶液，室温反应18小时，反应结束后旋干，经柱层析纯化得到化合物5。

第三步：将化合物5和化合物6溶于甲醇中，室温条件下反应4小时。反应结束后旋干溶剂，经柱层析纯化得到化合物GluC。

第四步：将六水合高氯酸铜和GluC溶于甲醇中，回流反应2小时，反应结束后旋干溶剂，得到葡萄糖基荧光探针GluCC。

将上述水溶性多功能糖基荧光探针，添加至对待检物检测时可接受的载体，可制备为检测用品，所述的检测用品具体为检测试纸、检测试剂或检测试剂盒。其制备方法如下：

将剪裁好的滤纸浸泡于上述水溶性多功能糖基荧光探针的水溶液中30分钟后自然晾干，制备硫化氢检测试纸。

将上述水溶性多功能糖基荧光探针溶于水或细胞完全培养基中，制备硫化氢或谷胱甘肽检测试剂或硫化氢或谷胱甘肽检测试剂盒。

上述检测用品包括检测试纸、检测试剂或检测试剂盒可应用于H₂S的检测，即：

将S^2-溶液滴加到上述检测试纸上，静置1分钟，于365nm紫外下观察检测试纸颜色变化，用识色软件对颜色进行识别，并建立S^2-浓度与RGB色彩模式中绿色数值(G)的标准曲线，从而可以快速、简便的检测环境中的H₂S。

将S^2-溶液加入上述检测试剂中，于荧光分光光度计中检测荧光强度，并建立S^2-浓度与荧光强度的标准曲线，通过对照标准曲线从而可以定量检测待检测物中S^2-浓度。

上述检测用品包括检测试剂或检测试剂盒可用于谷胱甘肽检测、肿瘤细胞成像和循环肿瘤细胞检测，即：

将谷胱甘肽溶液加入用水制备的检测试剂中，于荧光分光光度计中检测荧光强度，并建立谷胱甘肽浓度与荧光强度的标准曲线，通过对照标准曲线从而可以定量检测待检测物中谷胱甘肽浓度。

将用细胞完全培养基制备的检测试剂或检测试剂盒加入至含有肿瘤细胞的激光共聚焦培养皿中，在37℃，5％CO₂条件下培养30分钟，于激光共聚焦显微镜下观察肿瘤细胞成像效果。

将用细胞完全培养基制备的检测试剂或检测试剂盒加入至肝素钠抗凝的去除红细胞的人外周血样品中，在37℃，5％CO₂条件下培养30分钟，转移至激光共聚焦培养皿，于激光共聚焦显微镜下检测肿瘤细胞。

本发明的水溶性多功能糖基荧光探针，带来的技术创新在于：

1、本发明的水溶性多功能糖基荧光探针的制备方法简便，合成步骤简单、易操作。

2、本发明的水溶性多功能糖基荧光探针的抗干扰能力强、响应速度快、灵敏度高，可定性或定量检测复杂环境中的H₂S或GSH。

3、糖类化合物在自然界中大量存在，无毒无害，不会对环境造成二次污染。糖类化合物含有多个羟基，为荧光探针提供了很好的水溶性，提高了在水介质中H₂S和GSH检测的灵敏度和响应速度。

4、借助糖类分子的黏度，对载体材料的吸附能力强，可制备为H₂S检测试纸，使用更便捷。

5、糖类分子提供了很好的肿瘤靶向效果，可实现肿瘤细胞选择性成像，能够应用于循环肿瘤细胞检测。

附图说明

图1为本发明的水溶性多功能糖基荧光探针GluCC(10.0μM)和其前体GluC(10.0μM)在不同pH水溶液中494nm处的荧光强度。横坐标为pH，纵坐标为荧光强度。

图2为本发明的水溶性多功能糖基荧光探针GluCC(10.0μM)在水中与不同浓度S^2-作用后的荧光光谱变化。横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图3为本发明的水溶性多功能糖基荧光探针GluCC(10.0μM)在水中与不同浓度S^2-作用后494nm处荧光强度随S^2-浓度变化的线性关系。横坐标为浓度，纵坐标为荧光强度。

图4为本发明的水溶性多功能糖基荧光探针GluCC(10.0μM)在水中与Na₂S作用过程中494nm处荧光强度随时间的变化。横坐标为时间，纵坐标为荧光强度。

图5为本发明的水溶性多功能糖基荧光探针GluCC(10.0μM)在其它阴离子存在下的荧光强度及对S^2-的识别情况。横坐标为各种阴离子(CH₃COO^-、

F^-、

Cl^-、

Br^-、I^-、

)，纵坐标为荧光强度比值(F/F₀)。

图6为本发明的水溶性多功能糖基荧光探针GluCC所制备的H₂S检测试纸(用100μMGluCC浸泡30分钟后自然晾干)在自然光下的照片，后与不同浓度S^2-作用后，在365nm紫外光下试纸颜色变化照片并用识色软件识别出的颜色照片，以及RGB色彩模式中的绿色数值(G)与S^2-浓度的线性关系图，其中横坐标是S^2-浓度，纵坐标为G值。

图7为本发明的水溶性多功能糖基荧光探针GluCC(10.0μM)在水中与不同浓度GSH作用后的荧光光谱变化。横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图8为本发明的水溶性多功能糖基荧光探针GluCC(10.0μM)在水中与不同浓GSH作用后494nm处荧光强度随GSH浓度变化的线性关系。横坐标为浓度，纵坐标为荧光强度。

图9为本发明的水溶性多功能糖基荧光探针GluCC(10.0μM)在水中与GSH作用过程中494nm处荧光强度随时间的变化。横坐标为时间，纵坐标为荧光强度。

图10为本发明的水溶性多功能糖基荧光探针GluCC(10.0μM)在水中与GSH和其他分析物作用后的荧光强度。横坐标为其他分析物(Ala、Leu、Pro、Val、Gly、Ccp、Met、Phe、Tyr、Trp、Hcy、Lys和Cys-Cys)，纵坐标为荧光强度比值(F/F₀)。

图11为本发明的水溶性多功能糖基荧光探针GluCC，其不同浓度与HepG2细胞共孵育24和48小时后细胞存活率。横坐标为GluCC浓度，纵坐标为细胞相对存活率。

图12为本发明的水溶性多功能糖基荧光探针GluCC对HepG2细胞的靶向成像效果。其中，a图至c图为GluCC(10.0μM)与HepG2细胞共孵育30分钟的激光共聚焦图片。d图至f图为HepG2细胞与D-葡萄糖(55mM)和GluCC(10.0μM)共孵育30分钟的激光共聚焦图片。g图至i图为GluCC(10.0μM)与HL7702细胞共孵育30分钟的激光共聚焦图片。

图13为本发明的水溶性多功能糖基荧光探针GluCC响应HepG2细胞内GSH的激光共聚焦成像。a-c图为GluCC(10.0μM)与HepG2细胞共孵育30分钟的激光共聚焦图片。d-f图为HepG2细胞先与N-乙基马来酰亚胺(1mM)孵育30分钟，随后加入GluCC(10.0μM)孵育30分钟的激光共聚焦图片。g-i图为HepG2细胞先与N-乙基马来酰亚胺(1mM)孵育30分钟，再与GSH(2mM)孵育30分钟，最后加入GluCC(10.0μM)孵育30分钟的激光共聚焦图片。

图14为本发明的不同浓度水溶性多功能糖基荧光探针GluCC对HepG2细胞的成像效果。其中柱状图为激光共聚焦图片的量化图，横坐标为GluCC浓度，纵坐标为平均荧光强度。

图15为本发明的水溶性多功能糖基荧光探针GluCC(10.0μM)对HepG2细胞1小时内的成像效果。其中柱状图为激光共聚焦图片的量化图，横坐标为时间，纵坐标为平均荧光强度。

图16为本发明的水溶性多功能糖基荧光探针GluCC(10.0μM)对不同人癌细胞(HepG2、Hela、KM-12、SKOV-3、Jurkat和K562细胞)和人正常细胞(HL7702和THP-1细胞)的激光共聚焦图片。

图17为本发明的水溶性多功能糖基荧光探针GluCC(10.0μM)对掺有不同数量Jurkat或K562细胞的人外周血(去除红细胞)成像效果的激光共聚焦图片。

图18为本发明的水溶性多功能糖基荧光探针LacCC(10.0μM)在水中与不同浓度S^2-作用后的荧光光谱变化。横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图19为本发明的水溶性多功能糖基荧光探针LacCC(10.0μM)在水中与不同浓度S^2-作用后493nm处荧光强度随S^2-浓度变化的线性关系。横坐标为浓度，纵坐标为荧光强度。

图20为本发明的水溶性多功能糖基荧光探针LacCC所制备的H₂S检测试纸(用100μM的GluCC浸泡30分钟后自然晾干)在自然光下的照片，后与不同浓度S^2-作用后，在365nm紫外光下试纸颜色变化照片并用识色软件识别出的颜色照片，以及RGB色彩模式中的绿色数值(G)与S^2-浓度的线性关系图，其中横坐标是S^2-浓度，纵坐标为G值。

图21为本发明的水溶性多功能糖基荧光探针LacCC(10.0μM)在水中与不同浓度GSH作用后的荧光光谱变化。横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图22为本发明的水溶性多功能糖基荧光探针LacCC(10.0μM)在水中与不同浓GSH作用后493nm处荧光强度随GSH浓度变化的线性关系。横坐标为浓度，纵坐标为荧光强度。

图23为本发明的水溶性多功能糖基荧光探针LacCC(10.0μM)对掺有不同数量HepG2细胞的人外周血(去除红细胞)成像效果的激光共聚焦图片。

下面将结合附图和实施例对本发明作进一步地详细描述。

具体实施方式

申请人在研究中注意到，糖类化合物作为细胞最重要的能源物质，在细胞多种生理过程中也起着重要作用，例如酶的转运、细胞迁移、肿瘤转移和免疫反应。肿瘤细胞相比正常细胞对糖类分子有着很高的亲和性，因快速增殖需要消耗大量葡萄糖，肿瘤细胞常常伴随着葡萄糖转运体(GLUT)的高表达以获取更多的葡萄糖；另外肿瘤细胞表面异常的糖基化致使凝集素样受体过表达，使其对甘露糖、半乳糖、乳糖或岩藻糖等有着很高的亲和力。

针对这些高表达的糖转运体和糖受体，可以设计出以糖类为靶向配体的新型水溶性多功能糖基荧光探针，糖基配体不仅可以起到特异性靶向肿瘤细胞的作用，同时还可以赋予荧光探针良好的水溶性，改善其生物相容性。因此，对于研发一种能用于可视化定量检测水体中S^2-含量的荧光探针，特别是研发一种以GSH为肿瘤检测响应因素的水溶性荧光探针用于谷胱甘肽检测、肿瘤细胞成像和循环肿瘤细胞检测对于癌症的诊断和预后有重大意义。如果将两者有效结合，设计构建一种可同时检测H₂S和GSH的水溶性多功能荧光探针将非常重要且有意义。

申请人的研发思路是，以糖基配体为靶向基团与荧光探针连接，制备水溶性良好的多功能糖基荧光探针，以实现高选择性、高灵敏度、快速的水中S^2-和GSH检测以及肿瘤细胞特异性成像和循环肿瘤细胞的检测。

本实施例给出一种水溶性多功能糖基荧光探针，该水溶性多功能糖基荧光探针的化学式如下I式所示：

式中，R₁为糖基配体，选择葡萄糖、氨基葡萄糖、半乳糖、氨基半乳糖、乳糖、甘露糖、岩藻糖或其它糖类化合物；R₂为阴离子，选择可溶性铜盐的阴离子；n为0-100的整数。

本实施例的水溶性多功能糖基荧光探针，以香豆素衍生物为荧光母核，以络合Cu²⁺为响应基团，络合Cu²⁺后使荧光淬灭，其淬灭机理为典型的光致电子转移(PhotoinducedElectron Transfer，PET)。Cu²⁺可对S^2-和GSH特异性识别，其中与S^2-可形成硫化铜沉淀，GSH可将Cu²⁺还原为Cu⁺，两者皆破坏荧光探针的络合结构，PET效应消失，从而实现荧光的恢复。通过醚链将糖分子修饰到荧光母核上，为荧光探针提供了良好的水溶性。另外糖分子可特异性靶向肿瘤细胞。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，以下是申请人给出具体实施例。需要说明的是，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域公知的技术手段进行操作。未特别说明的化合物都是可商购或可参照文献制备的物质。

实施例1：水溶性多功能糖基荧光探针的制备

本实施例以葡萄糖为靶向基团、高氯酸铜六水合物为络合基团、n＝3为例，制备方法如下：

(1)化合物1(423mg，4.4mmol)、将化合物2(1.55g，4mmol)、无水碳酸钾(829mg，6mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺溶液(20mL)中，回流反应18小时。反应停止后，加入蒸馏水进行稀释，用乙酸乙酯进行萃取，收集有机相，旋干溶剂，经柱层析纯化得到717mg化合物3，产率为58％。¹H NMR(400MHz，Chloroform-d)δ9.80(s，1H)，7.36(s，1H)，7.27(s，1H)，4.61(t，J＝5.0Hz，2H)，4.20(d，J＝2.5Hz，2H)，3.78(t，J＝5.0Hz，2H)，3.69(d，J＝3.6Hz，4H)，3.63(d，J＝3.7Hz，4H)，3.58(s，4H)，2.45(s，1H)ppm。¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ182.17，142.96，131.40，127.94，79.60，74.61，70.59，70.54，70.51，70.44，70.39，70.05，69.08，58.38，47.47ppm。MS(ESI)C₁₅H₂₂N₂O₅ calc.for[M+H]⁺：311.1602，found：311.1591；for[M+H+CH₃OH]⁺：343.1864，found：343.1855。

反应过程如下：

(2)向化合物3(239mg，1.16mmol)和化合物4(593mg，1.91mmol)的水与四氢呋喃的混合液中加入五水合硫酸铜(52mg，0.21mmol)和抗坏血酸钠(208mg，0.7mmol)的水(4mL)溶液，室温反应18小时，反应结束后旋干溶剂，经柱层析纯化得到243mg化合物5，产率46％。¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ9.69(s，1H)，8.29(s，1H)，7.67(s，1H)，7.31(s，1H)，5.52(d，J＝9.2Hz，1H)，5.42(d，J＝5.8Hz，1H)，5.33(d，J＝4.7Hz，1H)，5.20(d，J＝5.3Hz，1H)，4.67(t，J＝5.5Hz，1H)，4.52(s，4H)，3.82–3.63(m，4H)，3.60–3.51(m，4H)，3.45(q，J＝9.0，7.4Hz，11H)，3.23(dt，J＝13.8，6.9Hz，1H)ppm。¹³C NMR(101MHz，DMSO-d₆)δ182.38，144.30，131.45，129.04，123.64，87.92，80.39，77.39，72.52，70.23，70.15，70.09，70.05，69.99，69.70，69.55，63.87，61.19，55.40，49.07，47.05ppm。MS(ESI)C₂₁H₃₃N₅O₁₀ calc.for[M+H]⁺：516.2300，found：516.2291；for[M+Na]⁺：538.2119，found：538.2098；for[M+H+CH₃OH]⁺：548.2562，found：548.2539。

反应过程如下：

(3)将化合物5(243mg，0.47mmol)和化合物6(136mg，0.5mmol)溶于甲醇(8mL)，室温条件下反应4小时。反应结束后旋干溶剂，经柱层析纯化得到327mg化合物GluC，产率为90％。¹H NMR(400MHz，Chloroform-d)δ14.90(s，1H)，8.72(s，1H)，8.07(s，1H)，7.67(s，1H)，7.42(s，1H)，7.29(s，1H)，7.09(s，1H)，6.58(d，J＝9.2Hz，1H)，6.39(s，1H)，5.70(s，1H)，4.52(s，2H)，4.25(s，2H)，4.08(s，2H)，3.95–3.26(m，26H)，1.19(t，J＝7.0Hz，6H)ppm。¹³C NMR(101MHz，DMSO-d₆)δ161.22，159.39，157.47，152.85，148.55，143.86，140.02，131.88，129.21，128.58，123.23，122.73，110.40，108.50，107.86，96.00，87.50，79.98，76.98，72.11，69.82，69.75，69.71，69.67，69.56，69.50，69.11，63.44，60.76，46.58，44.49，44.44，12.38ppm。MS(ESI)C₃₅H₄₈N₈O₁₂ calc.for[M+H]⁺：773.3470，found：773.3452；for[M+Na]⁺：795.3284，found：795.3274。

反应过程如下：

(4)称取六水合高氯酸铜(37mg，0.1mmol)和前体化合物GluC(77mg，0.1mmol)溶于甲醇溶液(15mL)中，回流反应2小时，反应结束后旋干溶剂，得到100mg化合物GluCC，产率96％。MS(ESI)C₃₅H₄₇N₈O₁₂Cu²⁺calc.for[M]：834.2604；found：834.2608。

反应过程如下：

实施例2：不同pH对水溶性多功能葡萄糖基荧光探针GluCC与化合物GluC荧光强度的影响测试

制备pH 2-12的GluCC和GluC的水溶液(10μM)，通过荧光分光光度计检测其荧光强度，如图1所示。图中可见，在pH6-11范围内，GluCC和GluC荧光强度基本稳定，可实现该pH范围内的H₂S和GSH检测。

实施例3：上述水溶性多功能葡萄糖基荧光探针GluCC对H₂S检测性能测试

(1)GluCC对S^2-的荧光滴定测试

制备GluCC的水溶液(10μM)，依次加入不同浓度的S^2-水溶液，通过荧光分光光度计测试荧光发射光谱，设置激发波长为450nm，如图2所示。

随着S^2-浓度增加，荧光强度逐渐增强，说明GluCC可以响应S^2-。建立荧光强度与S^2-浓度的标准曲线，如图3所示。该标准曲线线性关系较好，说明GluCC可用于S^2-定量检测，最低测限为49.6nM。

(2)GluCC对S^2-的响应速度测试

制备GluCC的水溶液(10μM)，加入30μM的S^2-水溶液，通过荧光分光光度计每间隔20秒检测荧光强度，如图4所示。图中可见，加入S^2-后，GluCC在20秒内即可完全恢复荧光，说明其在水中对S^2-响应迅速。

(3)GluCC对S^2-的选择性测试

制备GluCC水溶液(10μM)，分别加入30μM的各种阴离子(CH₃COO^-、

F^-、

Cl^-、

Br^-、I^-、

)水溶液，通过荧光分光光度计检测荧光强度。后再向每组加入30μM的S^2-水溶液，通过荧光分光光度计检测荧光强度，如图5所示。图中可见，加入不同阴离子不会使GluCC荧光恢复，而加入S^2-后荧光都实现了恢复，且其它阴离子的存在不会影响荧光恢复，说明GluCC对S^2-检测有很好的选择性和抗干扰能力，能够应用于复杂环境中H₂S的检测。

实施例4：水溶性多功能葡萄糖基荧光探针GluCC制备的检测试纸对H₂S的检测性能测试

将滤纸剪裁为0.7cm×4cm，浸泡于100μM GluCC水溶液30分钟，自然晾干得到H₂S检测试纸。依次滴加10μL不同浓度的S^2-水溶液，静置1分钟，于365nm紫外下观察颜色变化，并用识色软件进行识别，建立RGB色彩模式中绿色数值(G)与S^2-浓度的标准曲线，如图6所示。该检测试纸制备方法和使用方法简单、环保，响应速度快，性质稳定，易于保存。图中可见，其颜色变化明显，G值与S^2-浓度的线性关系较好，可快速、低成本的应用于现场的实时检测。

实施例5：水溶性多功能葡萄糖基荧光探针GluCC对GSH检测性能测试

(1)GluCC对GSH的荧光滴定测试

制备GluCC的水溶液(10μM)，依次加入不同浓度的GSH水溶液，通过荧光分光光度计测试荧光发射光谱，设置激发波长为450nm，如图7所示。图中可见，随着GSH浓度增加，荧光强度逐渐增强，说明GluCC可以响应GSH。建立荧光强度与GSH浓度的标准曲线，如图8所示。

该标准曲线线性关系较好，说明GluCC可用于GSH定量检测，最低测限为50.8nM。

(2)GluCC对GSH的响应速度测试

制备GluCC的水溶液(10μM)，加入100μM的GSH水溶液，通过荧光分光光度计每间隔20秒检测荧光强度，如图9所示。图中可见，加入GSH后，GluCC在20秒内即可完全恢复荧光，说明其在水中对GSH响应迅速。

(3)GluCC对GSH的选择性测试

制备GluCC的水溶液(10μM)，分别加入100μM的不同分析物(Ala、Leu、Pro、Val、Gly、Ccp、Met、Phe、Tyr、Trp、Hcy、Lys和Cys-Cys)水溶液，通过荧光分光光度计检测荧光强度，如图10所示。图中可见，GSH使GluCC荧光完全恢复，其它分析物不会使荧光完全恢复，说明GluCC对GSH检测有较好的选择性。

实施例6：水溶性多功能葡萄糖基荧光探针GluCC的细胞毒性测试

将HepG2细胞在含有10％FBS(胎牛血清)、1％青霉素/链霉素的1640培养基中培养，按每孔5x10³个细胞的密度接种在96孔板中。在37℃，5％CO₂条件下培养36小时，移除旧培养基，随后每孔加入100μL含不同浓度GluCC的培养基在37℃，5％CO₂条件下共培养24小时和48小时。随后移除培养基，每孔加入含有MTT的新鲜培养基培养4小时。培养完成后，移除含MTT的培养基，向各孔中加入100μL DMSO，溶解形成的甲瓒结晶，用摇床轻轻摇动10分钟，用酶标仪测定490nm处的吸光度，如图11所示。图中可见，GluCC对细胞几乎没有毒性，说明其有很好的生物相容性。

实施例7：水溶性多功能葡萄糖基荧光探针GluCC对肿瘤细胞靶向性测试

将HepG2和HL7702细胞在含有10％FBS、1％青霉素/链霉素的1640培养基中培养，按每皿1x10⁵个细胞的密度接种在激光共聚焦皿中。在37℃，5％CO₂条件下培养36小时，然后用新鲜培养基替换旧的培养基。分为三组，第一组HepG细胞加入GluCC(10μM)培养30分钟，第二组HepG2细胞加入D-葡萄糖(55mM)和GluCC(10μM)培养30分钟，第三组HL7702细胞用GluCC(10μM)培养30分钟，之后于激光共聚焦显微镜下观察，如图12所示。图中可见，相比于第二组和第三组，第一组细胞有明显的绿色荧光，说明GluCC可通过其葡萄糖配体特异性靶向肿瘤细胞，对肿瘤细胞进行选择性成像。

实施例8：水溶性多功能葡萄糖荧光探针GluCC对肿瘤细胞内GSH响应性测试

将HepG2细胞在含有10％FBS、1％青霉素/链霉素的1640培养基中培养，按每皿1x10⁵个细胞的密度接种在激光共聚焦皿中。在37℃，5％CO₂条件下培养36小时，用新鲜培养基替换旧的培养基。分为三组，第一组加入GluCC(10μM)培养30分钟，第二组用N-乙基马来酰亚胺(NEM，1mM)预培养30分钟后加入GluCC(10μM)培养30分钟，第三组用NEM(1mM)预培养30分钟，再加入GSH(2mM)培养30分钟后加入GluCC(10μM)培养30分钟，于激光共聚焦显微镜下观察，如图13所示。图中可见，第二组加入NEM清除细胞内GSH后，GluCC荧光在细胞内不能恢复，而加入GSH后，荧光又恢复，说明GluCC可响应肿瘤细胞内高浓度GSH使荧光恢复，从而实现对肿瘤细胞的选择性成像。

实施例9：水溶性多功能葡萄糖荧光探针GluCC，其不同浓度对肿瘤细胞的成像效果测试

将HepG2细胞在含有10％FBS、1％青霉素/链霉素的1640培养基中培养，按每皿1x10⁵个细胞的密度接种在激光共聚焦皿中。在37℃，5％CO₂条件下培养36小时，用新鲜培养基替换旧的培养基。加入不同浓度的GluCC培养30分钟，利用激光共聚焦显微镜进行观察，如图14所示。图中可见，随着GluCC浓度增加，细胞的平均荧光强度增强，但变化越来越小，最终选用10μM GluCC用于检测。

实施例10：水溶性多功能葡萄糖荧光探针GluCC，其在1小时内对肿瘤细胞的成像效果测试

将HepG2细胞在含有10％FBS、1％青霉素/链霉素的1640培养基中培养，按每皿1x10⁵个细胞的密度接种在激光共聚焦皿中。在37℃，5％CO₂条件下培养36小时，用新鲜培养基替换旧的培养基。加入GluCC(10μM)，于激光共聚焦显微镜下选择固定区域，每隔4分钟拍摄照片，共记录60分钟，如图15所示。图中可见，该区域的平均荧光强度基本没有变化，说明GluCC进入细胞后很短时间可恢复荧光，且成像面积和平均荧光强度基本不发生变化，说明GluCC具有快速成像能力且荧光寿命较长。

实施例11：水溶性多功能葡萄糖荧光探针GluCC对不同肿瘤细胞和正常细胞的成像效果测试

将HepG2、Hela、KM-12、SKOV-3、Jurkat、K562、HL7702和THP-1细胞在含有10％FBS、1％青霉素/链霉素的1640或DMEM培养基中培养，按每皿1x 10⁵个细胞的密度接种在激光共聚焦皿中。在37℃，5％CO₂条件下培养36小时，用新鲜培养基替换旧的培养基。加入GluCC(10μM)培养30分钟，利用激光共聚焦显微镜观察各细胞成像情况，如图16所示。图中可见，肿瘤细胞中有明亮的绿色荧光，而正常细胞没有荧光，说明GluCC可以实现广谱肿瘤细胞选择性成像。

实施例12：水溶性多功能葡萄糖荧光探针GluCC对循环肿瘤细胞的检测效果测试。

将不同数量(10、10²、10³、10⁴个)的Jurkat或K562细胞加入肝素抗凝的新鲜人外周血，用红细胞裂解液裂解红细胞，1500r/min离心5分钟，弃上清，加入含有GluCC(10μM)、10％FBS、1％青霉素/链霉素的1640培养基轻轻吹打均匀转移至激光共聚焦培养皿中，在37℃，5％CO₂条件下培养30分钟。对照组不加入肿瘤细胞，用红细胞裂解液裂解红细胞，1500r/min离心5分钟，弃上清，其中一组加入含有GluCC(10μM)、10％FBS、1％青霉素/链霉素的1640培养基轻轻吹打均匀转移至激光共聚焦培养皿中，另一组加入10％FBS、1％青霉素/链霉素的1640培养基轻轻吹打均匀转移至激光共聚焦培养皿中，培养30分钟，利用激光共聚焦显微镜观察，如图17所示。图中可见，没有加入肿瘤细胞的组别无论是否加入GluCC都没有绿色荧光，而加入了肿瘤细胞，尽管只有10个肿瘤细胞也可以检测出，说明GluCC对肿瘤细胞检测有较强的特异性和灵敏性，可应用于广谱循环肿瘤细胞检测中。

利用上述水溶性多功能葡萄糖荧光探针GluCC相同制备方法制备出以乳为靶向基团、高氯酸铜六水合物为络合基团、n＝3的水溶性多功能乳糖基荧光探针LacCC，其结构如下所示：

其性质与GluCC基本相同，区别在于LacCC可通过乳糖配体特异性靶向半乳糖凝集素过表达的肿瘤细胞，例如HepG2细胞。

实施例13：水溶性多功能乳糖基荧光探针LacCC对S^2-的荧光滴定测试

制备LacCC的水溶液(10μM)，依次加入不同浓度的S^2-水溶液，通过荧光分光光度计测试荧光发射光谱，设置激发波长为450nm，如图18所示。图中可见，随着S^2-浓度增加，荧光强度逐渐增强，说明LacCC可以响应S^2-。建立荧光强度与S^2-浓度的标准曲线，如图19所示。图中可见，该标准曲线线性关系较好，说明LacCC可用于S^2-定量检测，最低测限为5.28nM，相比于GluCC有更低的检测限。

实施例14：水溶性多功能乳糖基荧光探针LacCC制备的检测试纸对H₂S的检测性能测试

将滤纸剪裁为0.7cm×4cm，浸泡于100μM的LacCC水溶液30分钟，自然晾干得到H₂S检测试纸。依次滴加10μL不同浓度的S^2-水溶液，静置1分钟，于365nm紫外下观察颜色变化，并用识色软件进行识别，建立RGB色彩模式中绿色数值(G)与S^2-浓度的标准曲线，如图20所示。图中可见，该检测试纸制备方法和使用方法简单、环保，响应速度快，性质稳定，易于保存。其颜色变化明显，G值与S^2-浓度的线性关系较好，可快速、低成本的应用于现场的实时检测。

实施例15：水溶性多功能乳糖基荧光探针LacCC对GSH的荧光滴定测试

制备LacCC的水溶液(10μM)，依次加入不同浓度的GSH水溶液，通过荧光分光光度计测试荧光发射光谱，设置激发波长为450nm，如图21所示。随着GSH浓度增加，荧光强度逐渐增强，说明LacCC可以响应GSH。建立荧光强度与GSH浓度的标准曲线，如图22所示。图中可见，该标准曲线线性关系较好，说明LacCC可用于GSH定量检测，最低测限为5.50nM，相比于GluCC有更低的检测限。

实施例16：水溶性多功能乳糖基荧光探针LacCC对循环HepG2细胞的检测效果测试

将不同数量(10、10²、10³、10⁴个)的HepG2细胞加入肝素抗凝的新鲜人外周血，用红细胞裂解液裂解红细胞，1500r/min离心5分钟，弃上清，加入含有LacCC(10μM)、10％FBS、1％青霉素/链霉素的1640培养基轻轻吹打均匀转移至激光共聚焦培养皿中，在37℃，5％CO₂条件下培养30分钟。对照组不加入HepG2细胞，用红细胞裂解液裂解红细胞，1500r/min离心5分钟，弃上清，其中一组加入含有LacCC(10μM)、10％FBS、1％青霉素/链霉素的1640培养基轻轻吹打均匀转移至激光共聚焦培养皿中，另一组加入10％FBS、1％青霉素/链霉素的1640培养基轻轻吹打均匀转移至激光共聚焦培养皿中，培养30分钟，利用激光共聚焦显微镜观察，如图23所示。图中可见，没有加入HepG2细胞的组别无论是否加入LacCC都没有绿色荧光，而加入了HepG2细胞，尽管只有10个HepG2细胞也可以检测出，说明LacCC对HepG2细胞检测有较强的特异性和灵敏性，可适用于半乳糖凝集素过表达的循环肿瘤细胞检测中。

需要说明的是，以上给出的实施例是本发明较佳的例子，但本发明并不限于上述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明技术方案的前提下，还可作出种种等同的变型或替换，这些等同变型或替换均应包含在本申请技术方案的限定范围。

Claims (6)

1.一种水溶性多功能糖基荧光探针，其特征在于，该水溶性多功能糖基荧光探针的化学式如下I式所示：

式中，R₁为糖基配体，为葡萄糖、氨基葡萄糖、半乳糖、氨基半乳糖、乳糖、甘露糖、岩藻糖或其它糖类化合物；R₂为阴离子，选择可溶性铜盐的阴离子；n为0-100的整数。

2.权利要求1所述的水溶性多功能糖基荧光探针的制备方法，其特征在于，以糖分子为靶向基团、高氯酸铜六水合物为络合基团，其中的糖分子选择葡萄糖，n＝3；制备方法包括如下步骤：

第一步：将化合物1、化合物2、无水碳酸钾溶于N，N-二甲基甲酰胺溶液中，回流反应18小时，反应停止后，用乙酸乙酯进行萃取，收集有机相，旋干溶剂，经柱层析纯化得到化合物3；

第二步：向化合物3和化合物4的水与四氢呋喃的混合液中加入五水合硫酸铜和抗坏血酸钠的水溶液，室温反应18小时，反应结束后旋干，经柱层析纯化得到化合物5；

第三步： 将化合物5和化合物6溶于甲醇中，室温条件下反应4小时，反应结束后旋干溶剂，经柱层析纯化得到化合物GluC；

第四步：将六水合高氯酸铜和GluC溶于甲醇中，回流反应2小时，反应结束后旋干溶剂，得到葡萄糖基荧光探针GluCC。

3.权利要求1所述的水溶性多功能糖基荧光探针用于制备硫化氢检测用品或谷胱甘肽检测用品的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，将水溶性多功能糖基荧光探针添加至对待检物检测时可接受的载体，制备为检测用品，所述检测用品为检测试纸、检测试剂或检测试剂盒。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测试纸、检测试剂或检测试剂盒制备方法如下：

将剪裁好的滤纸浸泡于上述水溶性多功能糖基荧光探针的水溶液中30分钟后自然晾干，制备硫化氢检测试纸；

将上述水溶性多功能糖基荧光探针溶于水或细胞完全培养基中，制备硫化氢或谷胱甘肽检测试剂和硫化氢或谷胱甘肽检测试剂盒；

其中，应用于硫化氢的检测方法是：

将S^2-溶液滴加到上述检测试纸上，静置1分钟，于365nm紫外下观察检测试纸颜色变化，用识色软件对颜色进行识别，并建立S^2-浓度与RGB色彩模式中绿色数值(G)的标准曲线，从而快速、简便的检测环境中的硫化氢；

将S^2-溶液加入上述检测试剂中，于荧光分光光度计中检测荧光强度，并建立S^2-浓度与荧光强度的标准曲线，通过对照标准曲线定量检测待检测物中S^2-浓度。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测用品为检测试剂或检测试剂盒，用于谷胱甘肽检测、肿瘤细胞成像和循环肿瘤细胞检测，即：

将谷胱甘肽溶液加入用水制备的检测试剂中，于荧光分光光度计中检测荧光强度，并建立谷胱甘肽浓度与荧光强度的标准曲线，通过对照标准曲线从而可以定量检测待检测物中谷胱甘肽浓度；

将用细胞完全培养基制备的检测试剂或检测试剂盒加入至含有肿瘤细胞的激光共聚焦培养皿中，在37℃，5％CO₂条件下培养30分钟，于激光共聚焦显微镜下观察肿瘤细胞成像效果；

将用细胞完全培养基制备的检测试剂或检测试剂盒加入至肝素钠抗凝的去除红细胞的人外周血样品中，在37℃，5％CO₂条件下培养30分钟，转移至激光共聚焦培养皿，于激光共聚焦显微镜下检测肿瘤细胞。

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