CN110642882A - 一种兼具双氧水检测和光动力杀伤癌细胞活性的荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种兼具双氧水检测和光动力杀伤癌细胞活性的荧光探针及其制备方法和应用,属于生化材料技术领域。本发明提供的兼具双氧水检测和光动力杀伤癌细胞活性的荧光探针具有聚集诱导发光特性,与双氧水可特异性响应,产生荧光更强的物质,可应用于检测细胞内双氧水,且能够选择性定位细胞中的亚细胞器脂滴;该荧光探针与双氧水作用的产物具有较大的斯托克斯位移,可避免自吸收,降低背景干扰;该荧光探针及其与双氧水作用的产物均具有强的光稳定性和抗光漂白能力,适用于活细胞或活体中双氧水的长时示踪;同时,该荧光探针与双氧水作用的产物还具有活性氧产生能力,可用于光动力杀伤癌细胞,构建兼具诊断与治疗功能于一身的诊疗试剂。
Description
技术领域
本发明涉及生化材料技术领域,尤其涉及一种兼具双氧水检测和光动力杀伤癌细胞活性的荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
双氧水(H2O2)是活性氧物种家族(Reactive Oxygen Species,ROS)的重要成员之一,在生命体的生理、病理及细胞信号传导过程中起着关键性作用。越来越多的文献报道证实:体内双氧水含量异常与多种疾病密切相关,如中风、糖尿病、关节炎、心血管疾病及肿瘤等。特别的,肿瘤乏氧将诱导肿瘤细胞产生更多的双氧水和脂滴,因此,开发能够快速、灵敏、实时在线对细胞内脂滴中内源性双氧水进行检测的方法对相关疾病特别是癌症的早期诊断具有十分重要的科学意义及应用价值。
荧光探针及荧光成像技术由于具有操作简单、灵敏度高、检测限低、可用于细胞内或活体成像等优点受到了科学家们的广泛关注。目前文献报道的检测双氧水的荧光探针虽然有很多,但是大多数探针所采用的荧光分子在高浓度或进入细胞内极易发生荧光猝灭,即聚集导致荧光猝灭(aggregation caused quenching,ACQ)现象。这种现象迫使研究人员在检测过程中只能使用稀溶液,导致检测信噪比低,光稳定性差,不利于细胞内或活体中长时跟踪检测。
2001年,唐本忠等人(Chem.Commun.2001,1740-1741)发现了一种特殊荧光分子:1-甲基-1,2,3,4,5-五苯基噻咯(1-methyl-1,2,3,4,5-pentaphenylsilole),该分子在溶液状态下呈现无荧光或弱荧光,但是在聚集态呈现强荧光,并将这种特殊的发光现象称为聚集诱导荧光(aggregation-induced emission,AIE)效应。具有AIE效应的荧光分子由于具有高荧光量子产率、强抗漂白性、无需低浓度下检测等优点,为Turn-on型的荧光探针分子的设计提出了新的思路。
目前文献报道了少数用于检测双氧水的AIE分子,但是能够在脂滴中实时检测双氧水的AIE分子少之又少,且现有的检测双氧水的AIE分子不具有光动力杀伤癌细胞活性,应用范围受限。
发明内容
本发明的目的在于提供一种兼具双氧水检测和光动力杀伤癌细胞活性的荧光探针及其制备方法和应用,本发明提供的荧光探针能够应用于检测细胞内脂滴中双氧水;与双氧水作用产生的产物具有较大的斯托克斯位移,能够有效避免自吸收,降低背景干扰,且具有强的光稳定性和抗光漂白能力,可长时示踪;同时,本发明提供的双氧水荧光探针还具有活性氧产生能力,能够在光激发下产生单重态氧,具有光动力杀伤癌细胞活性。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种兼具双氧水检测和光动力杀伤癌细胞活性的荧光探针,具有式Ⅰ所示结构:
其中,R为氢、烷基、烷氧基、N,N-二甲基、N,N-二乙基或N,N-二苯基。
优选的,所述烷基和烷氧基中碳原子个数独立地为1~6中的任一正整数。
优选的,所述荧光探针为式Ⅰ-1~Ⅰ-4中的任意一个化合物:
本发明还提供了上述技术方案所述荧光探针的制备方法,包括以下步骤:
(1)将具有式II所示结构的化合物、4-(溴甲基)苯硼酸和第一有机溶剂混合进行成盐反应,得到具有式III所示结构的化合物;
其中,式II和式III中,R为氢、烷基、烷氧基、N,N-二甲基、N,N-二乙基或N,N-二苯基;
(2)将所述具有式III所示结构的化合物与丙二腈、有机碱和第二有机溶剂混合,在保护气氛下进行Knoevenagel反应,得到具有式I所示结构的荧光探针。
优选的,所述具有式II所示结构的化合物和4-(溴甲基)苯硼酸的摩尔比为1:(1.0~1.5)。
优选的,所述成盐反应在保护气氛中进行,所述成盐反应的温度为80~150℃。
优选的,所述具有式III所示结构的化合物与丙二腈、有机碱的摩尔比为1:(1.0~1.5):(0.3~0.6)。
优选的,所述有机碱为哌啶或醋酸铵。
优选的,所述Knoevenagel反应的温度为60~100℃。
本发明还提供了上述技术方案所述荧光探针在非治疗目的的检测双氧水或在制备光动力杀伤癌细胞的药物或在制备肿瘤的诊疗试剂中的应用。
本发明提供了一种兼具双氧水检测和光动力杀伤癌细胞活性的荧光探针,该荧光探针为螺旋桨结构,具有聚集诱导发光特性,其在分散状态时,螺旋桨结构的双键两端的四个苯环可旋转,在光激发时,能量通过四个苯环的旋转耗散,当在聚集状态时,四个苯环的旋转受到抑制,受到光激发时,能量通过荧光耗散;该荧光探针具有苯硼酸基团,能够与双氧水特异性响应,产生荧光更强的物质,能够应用于检测细胞内双氧水,且由于该荧光探针的分子和脂滴均为两亲性,荧光探针和脂滴可通过静电吸附和疏水作用结合,因此能够选择性的定位细胞中的亚细胞器脂滴,对脂滴中的双氧水进行特异性荧光成像;荧光探针和双氧水的产物具有较大的斯托克斯位移(175nm),能够有效避免自吸收,降低背景干扰,同时该荧光探针及其与双氧水反应的产物均具有强的光稳定性和抗光漂白能力,适用于活细胞或活体中双氧水的长时示踪;此外,本发明提供的荧光探针与双氧水作用的产物还具有活性氧产生能力,能够在光激发下产生单重态氧,可用于光动力杀伤癌细胞,构建兼具诊断与治疗功能于一身的诊疗试剂。
本发明还提供了上述兼具双氧水检测和光动力杀伤癌细胞活性的荧光探针的制备方法,该制备方法步骤简单,易于操作,适合工业化生产。
附图说明
图1为实施例1中TPECNP在不同四氢呋喃体积分数(fT)的四氢呋喃/水混合溶液中的荧光光谱(从低到高对应的体积分数依次为0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%,激发光波长为448nm);
图2为TPECNP在不同四氢呋喃体积分数(fT)的四氢呋喃/水混合溶液中于激发光波长为448nm的光照下在630nm处的实时荧光强度随不同四氢呋喃体积分数的曲线图;
图3为TPECNPB溶液和TPECNP溶液在630nm处的实时荧光强度与初始荧光强度比值随时间的变化曲线;
图4为TPECNPB在不同浓度的双氧水存在条件下在PBS溶液中孵化不同时间后荧光强度的变化图;
图5为在浓度为10μM的TPECNPB溶液中加入双氧水配制得到的不同双氧水浓度的混合溶液孵化后荧光发射光谱的变化图;
图6为TPECNPB溶液在625nm处的荧光强度与双氧水浓度的线性曲线图;
图7为在TPECNPB溶液中分别加入不同竞争分子后的荧光强度变化图;其中,a-空白对照、b-FeCl3、c-MgCl2、d-KCl、e-半胱氨酸、f-谷胱甘肽、g-同型半胱氨酸、h-精氨酸、i-抗坏血酸、j-ClO-、k-NO2 -、l-ROO·、m-·OH、n-O2 ·-、o-过氧化叔丁醇、p-1O2、q-ONOO-、r-双氧水;
图8为TPECNPB在有双氧水(网格柱子)和无双氧水(黑色柱子)条件下,在不同pH值的缓冲溶液中荧光强度的变化图;
图9为TPECNP与单重态氧捕获剂DHPA混合溶液吸收光谱随光照时间的变化情况图;
图10为TPECNP与单重态氧捕获剂DHPA混合溶液在378nm处吸光度值随光照时间的变化情况图;
图11为TPECNPB与用100μM双氧水预处理10min的MCF-7细胞37℃下孵化45min后的激光共聚焦显微成像照片;
图12为TPECNPB与商业化脂滴探针尼罗红的共定位图;
图13为商业化活性氧荧光探针二氯荧光素-双乙酸盐(DCF-DA)对探针TPECNPB在细胞内活性氧产生情况的激光共聚焦图;
图14为用商业化细胞凋亡探针AnnexinV-FITC染色TPECNPB光动力作用导致的细胞凋亡情况的激光共聚焦图;
图15为用商业化活细胞探针Calcein-AM染色TPECNPB光动力作用过程中的活细胞的激光共聚焦图。
具体实施方式
本发明提供了一种兼具双氧水检测和光动力杀伤癌细胞活性的荧光探针,具有式Ⅰ所示结构:
其中,R为氢、烷基、烷氧基、N,N-二甲基、N,N-二乙基或N,N-二苯基。
在本发明中,所述烷基和烷氧基中碳原子个数优选独立地为1~6中的任一正整数。
在本发明中,所述荧光探针优选为式Ⅰ-1~Ⅰ-4中的任意一个化合物:
本发明还提供了上述技术方案所述荧光探针的制备方法,包括以下步骤:
(1)将具有式II所示结构的化合物、4-(溴甲基)苯硼酸和第一有机溶剂混合进行成盐反应,得到具有式III所示结构的化合物;
其中,式II和式III中,R为氢、烷基、烷氧基、N,N-二甲基、N,N-二乙基或N,N-二苯基;
(2)将所述具有式III所示结构的化合物与丙二腈、有机碱和第二有机溶剂混合,在保护气氛下进行Knoevenagel反应,得到具有式I所示结构的荧光探针。
本发明将具有式II所示结构的化合物、4-(溴甲基)苯硼酸和第一有机溶剂混合进行成盐反应,得到具有式III所示结构的化合物;
其中,式II和式III中,R为氢、烷基、烷氧基、N,N-二甲基、N,N-二乙基或N,N-二苯基。
本发明对所述具有式II结构的化合物的来源没有特殊限定,可以采用本领域技术人员公知的方法制备得到,如参考国际发明专利(WO 2018/210334 Al)制备得到。
在本发明中,所述具有式II所示结构的化合物和4-(溴甲基)苯硼酸的摩尔比优选为1:(1.0~1.5),更优选为1:(1.1~1.3),最优选为1:1.2。
本发明对所述第一有机溶剂的种类没有特殊的限定,采用常规的溶剂,能够溶解原料,保证成盐反应顺利进行即可,具体如甲苯。本发明对所述第一有机溶剂的用量没有特殊限定,能够使反应顺利进行即可。
在本发明中,所述成盐反应优选在保护气氛中进行,本发明对所述保护气氛没有特殊限定,在常规的保护气氛中进行即可,如氮气氛围、惰性气体氛围;所述成盐反应的温度优选为80~150℃,更优选为100~130℃,最优选为130℃;所述成盐反应优选在搅拌条件下进行,本发明对于所述搅拌的速率没有特殊的限定,能够搅拌均匀即可;本发明对所述成盐反应的时间没有特殊的限定,优选通过TLC板(即薄层色谱点板)对反应进行监控,反应至具有式II所示结构的化合物完全消失即可。
成盐反应完成后,本发明优选将所述成盐反应的反应液冷却至室温,然后加入无水乙醚进行重结晶,然后抽滤,得到具有式III所示结构的化合物。
在本发明中,所述无水乙醚与所述成盐反应的反应液的体积比优选为1:(2~5);所述重结晶的过程优选为加入无水乙醚后,在室温静置20~40min。
得到具有式III所示结构的化合物后,本发明将所述具有式III所示结构的化合物与丙二腈、有机碱和第二有机溶剂混合,在保护气氛下进行Knoevenagel反应,得到具有式I所示结构的荧光探针。
在本发明中,所述有机碱优选为哌啶或醋酸铵;所述第二有机溶剂优选为乙醇;所述具有式III所示结构的化合物与丙二腈、有机碱的摩尔比优选为1:(1.0~1.5):(0.3~0.6),更优选为1:(1.2~1.3):(0.5~0.6)。
在本发明中,所述Knoevenagel反应的温度优选为60~100℃,更优选为70~90℃,最优选为85℃。本发明对所述Knoevenagel反应的时间没有特殊的限定,优选通过TLC板对反应进行监控,反应至具有式III所示结构的化合物完全消失即可。本发明对所述Knoevenagel反应中的保护气氛没有特殊限定,在常规的保护气氛中进行即可,如氮气氛围、惰性气体氛围。
Knoevenagel反应完成后,本发明优选将所述Knoevenagel反应得到反应液进行后处理,所述后处理优选包括以下步骤:
将所述Knoevenagel反应得到反应液进行萃取后浓缩,得到浓缩物;
将所述浓缩物进行柱层析,得到具有式I所示结构的荧光探针。
在本发明中,所述萃取优选包括如下步骤:将饱和食盐水和二氯甲烷加入至所述Knoevenagel反应得到的反应液中进行萃取,分离出有机相后,再用二氯甲烷对所得水相萃取两次;每次萃取所用二氯甲烷与饱和食盐水的体积比优选为1:1;所述萃取得到的有机相合并后进行柱层析;所述柱层析用洗脱剂优选为二氯甲烷和甲醇的混合液,所述混合液中二氯甲烷和甲醇的体积比优选为10:1。
柱层析完成后,本发明优选将柱层析产物中的溶剂去除,得到具有式I所示结构的荧光探针。本发明对所述溶剂去除的方式没有特殊限定,采用常规的去除溶剂的方式即可,如旋蒸。
本发明还提供了上述技术方案所述荧光探针在非治疗目的的检测双氧水或在制备光动力杀伤癌细胞的药物或在制备肿瘤的诊疗试剂中的应用;所述双氧水优选为肿瘤细胞中的双氧水,所述肿瘤细胞优选为人乳腺癌细胞;所述诊疗试剂是指同时具有诊断和治疗功能的试剂。
如式a所示,以式Ⅰ-1所示的化合物为例对本发明所提供的荧光探针的荧光成像和光动力杀伤癌细胞的机理进行说明:本发明提供的兼具双氧水检测和光动力杀伤癌细胞活性的荧光探针(记为TPECNPB,为具有一定水溶性的两亲性化合物)本身荧光较弱,在与双氧水作用后,会产生强荧光物质(记为TPECNP,为非水溶性化合物),该物质在450nm的激发光照射下能够产生625nm的荧光,且荧光强度和双氧水在一定浓度范围内成线性关系,根据具体的荧光强度值以及线性曲线即可得到双氧水的浓度;所述线性曲线为荧光强度和双氧水浓度的关系曲线,本发明对所述线性曲线的绘制方法没有特殊要求,使用本领域技术人员熟知的方法即可;此外,本发明的荧光探针与双氧水作用后产生物质中存在两个氰基,在光激发时,能够增强单重激发态向三重激发态的系间窜越效率,从而产生活性氧,进而进行光动力杀伤癌细胞,因而兼具双氧水检测和光动力抗癌活性,能够开发为兼具肿瘤诊断与治疗功能于一身的光动力诊疗试剂。
下面结合实施例对本发明提供的一种兼具双氧水检测和光动力杀伤癌细胞活性的荧光探针及其制备方法和应用进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
如下式1所示为本实施例制备兼具双氧水检测和光动力杀伤癌细胞活性的荧光探针的化学反应式:
(1)将化合物1(497.6mg,1.00mmol)、4-(溴甲基)苯硼酸(257.8mg,1.20mmol)和甲苯混合,在氮气的保护下于130℃回流,用TLC板监控反应进程直至化合物1完全消失,完成成盐反应;然后冷却到室温,向所得反应液中加入无水乙醚,静置30min,其中反应液和无水乙醚的体积比为1:3,然后抽滤,得到固体370.5mg,经计算产率为52%;
对所得固体进行核磁表征,结果如下:
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.34(d,J=6.3Hz,2H),8.32(d,J=6.2Hz,2H),8.18(s,2H),7.85(d,J=7.7Hz,2H),7.65(d,J=8.1Hz,2H),7.52(d,J=7.6Hz,2H),7.22–7.09(m,5H),6.97(d,J=7.0Hz,2H),6.88(dd,J=12.3,8.7Hz,4H),6.71(t,J=9.3Hz,4H),5.93(s,2H),3.68(br,6H).HRMS(MALDI-TOF):m/z:[M]+calcd for C41H35BNO5 +:632.2603;found:632.2611.
根据上述表征数据可知,所得固体为化合物2所示结构;
(2)将化合物2(356.2mg,0.5mmol)、丙二腈(33.0mg,0.5mmol)、哌啶(23.3mg,0.27mmol)与乙醇混合,在氮气的保护下85℃回流,用TLC板监控至化合物2消失,将所得反应液与饱和食盐水二氯甲烷混合进行萃取,分离出有机相后,再用二氯甲烷对所得水相萃取两次,将所得有机相合并后,用硅胶柱层析法进行纯化,所用洗脱剂为二氯甲烷和甲醇(二氯甲烷和甲醇的体积比为10:1),然后将所得柱层析产物中的溶剂旋干,得到深橙色固体228.1mg,经计算产率为60%;
对所得深橙色固体进行核磁表征,结果如下:
1H NMR(400MHz,MeOD)δ9.21(d,J=6.4Hz,2H),8.21(d,J=6.3Hz,2H),7.86(s,2H),7.49(d,J=7.6Hz,2H),7.33(d,J=8.5Hz,2H),7.17–7.06(m,5H),7.03–6.96(m,2H),6.90(d,J=8.4Hz,4H),6.66(dd,J=10.4,8.7Hz,4H),5.91(s,2H),3.70(br,6H).13C NMR(100MHz,MeOD)δ171.69,166.05,159.02,158.82,152.79,150.86,145.48,143.45,143.19,137.53,135.25,135.24,134.77,132.41,132.25,131.89,131.04,130.73,129.67,128.88,128.11,127.75,126.42,113.06,112.76,112.33,112.31,85.90,60.18,54.32,54.25.HRMS(MALDI-TOF):m/z:[M]+calcd for C44H35BN3O4 +:680.2715;found:680.2692.
根据上述表征数据可知,所得深橙色固体为TPECNPB,即Ⅰ-1所示的化合物。
性能测试:
(1)荧光探针的AIE性质测定:在不同四氢呋喃体积分数(fT)的四氢呋喃/水混合溶液中分别加入TPECNP的四氢呋喃溶液(1mM),得到浓度为10μM的TPECNP溶液,分别测定不同四氢呋喃烷体积分数的混合溶液中TPECNP的荧光强度。
图1为TPECNP在不同四氢呋喃体积分数(fT)的四氢呋喃/水混合溶液中的荧光光谱(从低到高对应的四氢呋喃的体积分数依次为0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%,激发光波长为448nm)。
图2为TPECNP在不同四氢呋喃体积分数(fT)的四氢呋喃/水混合溶液中于激发光波长为448nm的光照下在630nm处的实时荧光强度随不同四氢呋喃体积分数的曲线图。
从图1和图2可以看出,当fT低于80%时,随着fT的增大,TPECNPB荧光强度变化不明显,当fT大于80%时,荧光强度逐渐增强,说明TPECNPB具有AIE特性。
(2)产物结构的确定:在2mLPBS溶液(pH 7.4,5mM)中加入20μLTPECNPB的二甲基亚砜溶液(1mM),得到浓度为10μM的TPECNPB溶液,然后加入双氧水40μM,所得混合溶液在37℃下孵化50min,所得混合液进行高分辨质谱分析,结果发现反应后探针TPECNPB的分子离子峰(m/z=680.2715)消失,出现了一个m/z=579.2061的新峰,经分析为[TPECNP+H2O2]+(m/z=579.2158)的离子峰,说明TPECNPB与双氧水反应后的产物为TPECNP。
(3)荧光探针的光稳定性测定:在2mLPBS溶液(pH 7.4,5mM)中分别加入20μLTPECNPB或TPECNP的二甲基亚砜溶液(1mM),分别得到浓度为10μM的TPECNPB溶液和浓度为10μM的TPECNP溶液,在448nm光照条件下测定两组溶液在630nm处的实时荧光强度与初始荧光强度的比值随时间的变化曲线。
图3为TPECNPB溶液和TPECNP溶液在630nm处的实时荧光强度与初始荧光强度比值随时间的变化曲线,从图3中可以看出,在60min的光照时间内,TPECNPB及与双氧水反应后的产物TPECNP的荧光强度变化不大,说明TPECNPB和产物TPECNP都具有很好的光稳定性和抗光漂白能力,有利于细胞内或活体小动物内长时示踪双氧水。
(4)荧光探针的响应时间测定:在2mLPBS溶液(pH 7.4,5mM)中加入20μL TPECNPB的二甲基亚砜溶液(1mM),得到浓度为10μM的TPECNPB溶液,然后加入双氧水配制双氧水浓度依次为0μM、20μM、30μM、40μM的混合溶液,所得混合溶液在37℃下孵化不同的时间(0、5、7、10、13、15、20、25、30、35、50min),测定所述混合溶液的荧光强度随孵化时间的变化情况,结果如图4所示。
图4为TPECNPB在不同浓度的双氧水存在条件下在PBS溶液中孵化不同时间后荧光强度的变化图,由图4可知,在37℃下孵化35min后,荧光强度基本达到饱和。
(5)荧光探针的荧光滴定测试:在2mLPBS溶液(pH 7.4,5mM)中加入20μL TPECNPB的二甲基亚砜溶液(1mM),得到浓度为10μM的TPECNPB溶液,然后加入双氧水,配制不同浓度双氧水的混合溶液(双氧水浓度范围为0~120μM),在37℃下孵化35min后,测定不同浓度双氧水的混合溶液的荧光发射光谱(Ex=450nm),并以625nm处的荧光强度为纵坐标、双氧水的浓度为横坐标建立荧光强度和双氧水浓度的线性曲线,结果如图5和图6所示。
图5为在浓度为10μM的TPECNPB溶液中加入双氧水配制得到的不同双氧水浓度的混合溶液孵化后荧光发射光谱的变化图;由图5可以看出,随着双氧水浓度的增大,荧光强度逐渐增强。同时,也可以看出,该双氧水检测体系具有较大的斯托克斯位移(Ex=450nm,Em=625nm,斯托克斯位移为175nm)。
图6为TPECNPB溶液在625nm处的荧光强度与双氧水浓度的线性曲线图,所述线性曲线具体为Y=1042.63X+224.68,荧光强度对于双氧水的浓度的线性响应在0~30μM(R2=99.4%)之间。
(6)探针的选择性测试:在2mLPBS溶液(pH 7.4,5mM)中加入20μLTPECNPB的二甲基亚砜溶液(1mM),得到浓度为10μM的TPECNPB溶液,然后加入不同的竞争分子,配制不同竞争分子的溶液,其中竞争分子为FeCl3、MgCl2、KCl、半胱氨酸、谷胱甘肽、同型半胱氨酸、精氨酸或抗坏血酸的溶液中,竞争分子的浓度为10mM,待测物为ClO-、NO2 -、ROO·、·OH、O2 ·-、过氧化叔丁醇、1O2、ONOO-或双氧水的溶液中竞争分子的浓度为200μM,将所得不同竞争分子的溶液分别在37℃下孵化35min,然后测定荧光发射光谱(Ex=450nm),结果如图7所示。
图7为TPECNPB溶液中分别加入不同竞争分子后的荧光强度变化图;其中,a-空白对照、b-FeCl3、c-MgCl2、d-KCl、e-半胱氨酸、f-谷胱甘肽、g-同型半胱氨酸、h-精氨酸、i-抗坏血酸、j-NaClO、k-NaNO2、l-ROO·、m-·OH、n-O2 ·-、o-过氧化叔丁醇、p-1O2、q-ONOO-、r-双氧水(其中,·OH是通过双氧水(200μM)与Fe2+(2mM)的fenton反应获得的;O2 ·-是通过将KO2(1mM)加入到DMSO中获得的;ROO·是通过将2,2'-偶氮二异丁基脒二盐酸盐(AAPH,100μM)加入到去离子水中搅拌30min得到的,R代表2-甲脒基异丙基;1O2是通过将NaOCl(200μM)加入到双氧水(200μM)中反应获得的;ONOO-通过如下反应过程获得:在250mL的反应瓶中加入50mL冰水,然后加入50mM亚硝酸钠和50mM双氧水,在此溶液中迅速加入1M的盐酸溶液(25mL),并立刻加入1.5M的氢氧化钠溶液(25mL),ONOO-的最终浓度通过紫外吸收光谱法根据摩尔消光系数(ε302=1670L·mol-1·cm-1)标定)。由图7可知,除双氧水外的其它生物分子与TPECNPB反应前后的荧光强度均没有明显增强,说明TPECNPB可以选择性的识别双氧水。
(7)荧光探针的pH效应测试:在2mL不同pH值的缓冲溶液(pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)中分别加入20μLTPECNPB的二甲基亚砜溶液(1mM),得到不同pH值的浓度为10μM的TPECNPB溶液,测定荧光光谱,然后加入双氧水,所得混合溶液中双氧水的浓度为100μM,所得混合溶液在37℃下孵化35min后,测定混合溶液的荧光强度随缓冲溶液pH值的变化情况,结果如图8所示。
图8为TPECNPB在有双氧水和无双氧水(即未加入双氧水时测定的荧光强度)条件下,在不同pH值的缓冲溶液中荧光强度的变化图,由图8可知,TPECNPB本身的荧光强度(黑色柱子)对pH的变化并不敏感,说明探针具有较好的pH稳定性。同时,TPECNPB对双氧水的响应在pH 7.4-10之间最为灵敏。
(8)荧光探针的活性氧产生能力测试:在2mLPBS溶液(pH 7.4,5mM)中加入TPECNP的二甲基亚砜溶液(1mM),使其在450nm处的吸收值为0.2左右,向上述溶液中加入单重态氧捕获剂9,10-二(N-(2,3-二羟丙基)丙酰胺基)蒽(DHPA),测定混合溶液在335~410nm处的吸收光谱,然后用太阳能模拟器搭载400nm滤光片对混合溶液进行光照,测定混合溶液在335~410nm处的吸收光谱随光照时间的变化,结果如图9和图10所示。
图9为混合溶液吸收光谱随光照时间的变化情况,图10为378nm处吸光度值随光照时间的变化情况。从图9和图10可以看出,随着光照时间的延长,单重态氧捕获剂DHPA的吸收值逐渐下降,说明TPECNP具有单重态氧产生能力,是潜在的光动力抗癌光敏剂。
(9)对人乳腺癌细胞(MCF-7)内双氧水荧光成像情况进行测试,具体步骤如下:
将MCF-7细胞经过复苏接种于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中,在37℃、5%CO2、100%饱和湿度的培养箱中培养,然后在18mm盖玻片上培养24h;
将培养得到的MCF-7细胞浸入TPECNPB浓度为5μM的培养基中,在37℃、5%CO2、100%饱和湿度的培养箱中培养45min后,倒出培养基,用新鲜培养基清洗细胞3遍;加入双氧水孵化10min后(加入双氧水后,体系中双氧水的浓度为100μM),倒出培养基,用新鲜培养基清洗细胞3遍;分别在激光共聚焦荧光显微镜下观察,并用405nm作为激发光源,对其进行明场和荧光场下拍照,作为实验组。
按照上述方法,区别在于不进行双氧水处理,将在MCF-7细胞在TPECNPB浓度为5μM的培养基中孵化20min后,用新鲜培养基清洗细胞3遍;然后进行明场和荧光场下拍照,作为对照组。
图11为TPECNPB与MCF-7细胞37℃下孵化45min后的激光共聚焦显微成像照片,其中“探针”为不进行双氧水处理的对照组,“探针+双氧水”为进行了双氧水处理的实验组。由图11可知,TPECNPB在MCF-7细胞中呈现弱的荧光信号,而在双氧水处理后的MCF-7细胞中呈现强的荧光信号,说明TPECNPB可以对细胞内双氧水进行荧光成像。
图12为TPECNPB与商业化脂滴探针尼罗红的共定位图。将按照前述方法培养后的MCF-7细胞浸入TPECNPB浓度为5μM的培养基中在37℃、5%CO2、100%饱和湿度的培养箱中孵化30min后,加入双氧水(所得混合液中双氧水浓度为100μM)孵化20min后,用新鲜培养基清洗细胞3遍;再与商业化指定定位探针尼罗红(浓度为6.25μg/mL)共染15min后,用新鲜培养基清洗细胞3遍后,在激光共聚焦荧光显微镜下观察,拍摄细胞的激光共聚焦图。从图12中可以看出,探针(即TPECNPB)与双氧水孵化后的荧光与尼罗红的荧光具有很好的重叠性,共定位系数为0.89,说明探针能够特异性定位于细胞的脂滴,对脂滴中的双氧水进行实时荧光成像。
(10)TPECNPB对人乳腺癌细胞(MCF-7)的光动力杀伤能力进行测试,具体步骤如下:
MCF-7细胞经过复苏接种于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中,在37℃、5%CO2、100%饱和湿度的培养箱中培养,然后在18mm盖玻片上培养24h;
将培养后的MCF-7细胞浸入含5μM TPECNPB的培养基中,在37℃、5%CO2、100%饱和湿度的培养箱中培养45min后,倒出培养基,用新鲜培养基清洗细胞3遍;加入双氧水孵化20min后(加入双氧水后,体系中双氧水的浓度为50μM),倒出培养基,用新鲜培养基清洗细胞3遍;用太阳能模拟器光照一定时间后,分别加入不同的商业化探针,然后在激光共聚焦荧光显微镜下观察,对其进行明场和荧光场下拍照。
图13为商业化活性氧荧光探针二氯荧光素-双乙酸盐(DCF-DA)对TPECNPB在细胞内活性氧产生情况的激光共聚焦图。从图13可以看出,随着光照时间的延长,TPECNPB在MCF-7细胞内荧光素的荧光逐渐增强,说明TPECNPB与双氧水响应后能够在光照条件下在MCF-7细胞内产生活性氧,并且随着光照时间的延长,活性氧产生的越多。
商业化探针Annexin V-FITC可以特异性的染色凋亡细胞,图14为用Annexin V-FITC染色TPECNPB光动力作用导致的细胞凋亡情况的激光共聚焦图。从图14可以看出,随着光照时间的延长,细胞凋亡指示探针Annexin V-FITC的荧光越来越强,说明TPECNPB产生的活性氧能够引起MCF-7细胞发生细胞凋亡,并且光照时间越长,这种光动力作用越明显,说明TPECNPB具有光动力杀伤癌细胞的作用。
商业化探针Calcein-AM可以特异性的染色活细胞,图15为用Calcein-AM染色TPECNPB光动力作用过程中的活细胞的激光共聚焦图。从图15可以看出,随着光照时间延长,活细胞指示探针Calcein-AM的荧光越来越弱,说明活细胞的数量越来越少,也就是说TPECNPB光动力作用导致的细胞死亡越来越多,说明TPECNPB光动力作用可以杀伤癌细胞,与图13和图14的结果一致。
实施例2
将化合物1替换为如下式Ⅱ-2所示的化合物,其他条件与实施例1相同,
将所得产物进行核磁表征,可知得到的探针为Ⅰ-2所示的化合物。
实施例3
将化合物1替换为如下式Ⅱ-3所示的化合物,其他条件与实施例1相同,
将所得产物进行核磁表征,可知得到的探针为Ⅰ-3所示的化合物。
实施例4
将化合物1替换为如下式Ⅱ-4所示的化合物,其他条件与实施例1相同,
将所得产物进行核磁表征,可知得到的探针为Ⅰ-4所示的化合物。
按照实施例1中性能测试的方法对实施例2~4所得探针进行AIE效应、光稳定性、响应时间、荧光滴定、选择性、pH效应、活性氧产生能力、人乳腺癌细胞内双氧水成像和人乳腺癌细胞光动力杀伤能力进行测试,所得结果和实施例1相似。
综上所述,本发明提供的兼具双氧水检测和光动力杀伤癌细胞活性的荧光探针具有聚集诱导发光特性,能够选择性的定位细胞中的亚细胞器脂滴,对脂滴中的双氧水进行特异性荧光成像;具有较大的斯托克斯位移(175nm),能够有效避免自吸收,降低背景干扰;具有强的光稳定性和抗光漂白能力,适用于活细胞或活体中双氧水的长时示踪;同时,本发明提供的荧光探针还具有活性氧产生能力,能够在光激发下产生单重态氧,可用于光动力杀伤癌细胞,可用于制备兼具诊断与治疗于一身的诊疗试剂。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
2.根据权利要求1所述的荧光探针,其特征在于,所述烷基和烷氧基中碳原子个数独立地为1~6中的任一正整数。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述具有式II所示结构的化合物和4-(溴甲基)苯硼酸的摩尔比为1:(1.0~1.5)。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法,其特征在于,所述成盐反应在保护气氛中进行,所述成盐反应的温度为80~150℃。
7.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述具有式III所示结构的化合物与丙二腈、有机碱的摩尔比为1:(1.0~1.5):(0.3~0.6)。
8.根据权利要求4或7所述的制备方法,其特征在于,所述有机碱为哌啶或醋酸铵。
9.根据权利要求4或7所述的制备方法,其特征在于,所述Knoevenagel反应的温度为60~100℃。
10.权利要求1~3任意一项所述荧光探针在非治疗目的的检测双氧水或在制备光动力杀伤癌细胞的药物或在制备肿瘤的诊疗试剂中的应用。
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