CN110229203A - 一种氨基己糖酶荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种氨基己糖酶荧光探针及其制备方法和应用，涉及生物化学材料领域。本发明提供的氨基己糖酶荧光探针具有式I所示结构，该氨基己糖酶荧光探针合成步骤少，分离纯化操作简单，稳定性好，具有聚集诱导发光特性，抗光漂白能力强，避免了传统荧光染料不宜在高浓度下检测或进入细胞后因聚集产生荧光猝灭导致不能长时跟踪的缺点，并且能够应用于检测癌细胞内过表达的氨基己糖酶。

Description

一种氨基己糖酶荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物化学材料技术领域，特别涉及一种氨基己糖酶荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
氨基己糖酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase,NAG，EC3.2.1.52)是一类二聚的溶酶体酶，主要包括三种同功酶，Hex A，Hex B和Hex S，能够催化水解GM2神经节苷脂中的N-乙酰氨基己糖糖苷键。研究表明，氨基己糖酶在结肠癌、乳腺癌等多种癌细胞和癌组织中都有过表达现象，并且是检测肾损伤，特别是肾小管缺血、坏死的敏感指标。氨基己糖酶A缺乏会导致GM2神经节苷脂在神经细胞中累积，导致氨基己糖酶A缺乏症，如Tay-Sachs病、Sandhoff症等。鉴于氨基己糖酶的重要生理意义，发展用于生物体系中对氨基己糖酶有高灵敏、高选择性的检测技术和方法，具有重要的生物学意义。
目前，科学家已经利用比色法开发了检测氨基己糖酶的商业化试剂盒。然而在实际应用中，这种检测试剂盒往往存在灵敏度低、背景干扰大、测试过程操作复杂等缺点。因此，发展一种能够实时检测复杂生物体系中氨基己糖酶的有效方法具有重要的应用价值。荧光法由于具有操作简单、灵敏度高、检测限低、可用于细胞内或活体成像等优点受到了科学家们的广泛关注。目前文献报道的检测氨基己糖酶的探针非常少，相关文献如Chem.Commun.,2019,55,1955-1958；Bioconjugate Chem.2016,27,973-981；CellChemical Biology 2018,25,1255-1267和ACS Sens.2019，45，1222-1229。并且，这些已有的氨基己糖酶荧光探针所采用的荧光分子在高浓度或进入细胞内极易发生荧光猝灭，即聚集导致荧光猝灭(aggregation caused quenching，ACQ)现象。这种现象迫使研究人员在检测过程中只能使用稀溶液，导致检测信噪比低，光稳定性差，不利于细胞内或活体中长时跟踪检测，限制了这些氨基己糖酶荧光探针的实际应用。
2001年，唐本忠等人(Chem.Commun.2001,1740-1741.)发现了一种在溶液状态下呈现无荧光或弱荧光，但是在聚集态呈现强荧光的特殊荧光分子，并将这种特殊的发光现象称为聚集诱导荧光(aggregation-induced emission,AIE)效应。具有AIE效应的荧光分子由于具有高荧光量子产率、强抗漂白性、无需低浓度下检测等优点，为Turn-on型的荧光探针分子的设计提出了新的思路。目前，具有聚集诱导发光特性的氨基己糖酶荧光探针未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种氨基己糖酶荧光探针及其制备方法和应用。本发明提供的氨基己糖酶荧光探针具有聚集诱导发光特性，能够有效避免传统荧光染料不宜在高浓度下检测的缺点，并具有稳定性好、选择性强、灵敏度高、抗漂白能力强等优点，可以应用于检测细胞内氨基己糖酶。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种氨基己糖酶荧光探针，具有式I所示结构：
式I中，R为氢、烷基、烷氧基、N,N-二甲基、N,N-二乙基或N,N-二苯基。
优选的，所述烷基和烷氧基中碳原子的个数独立的为1～6。
优选的，所述氨基己糖酶荧光探针包括：
本发明提供了上述技术方案所述氨基己糖酶荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)将具有式II所示结构的化合物和具有式III所示结构的化合物进行成盐反应，得到具有式IV所示结构的化合物；
式III和式IV中，R为氢、烷基、烷氧基、N,N-二甲基、N,N-二乙基或N,N-二苯基；
(2)将所述具有式IV所示结构的化合物进行水解反应，得到具有式I所示结构的氨基己糖酶荧光探针。
优选的，所述步骤(1)中具有式II所示结构的化合物与具有式III所示结构的化合物的摩尔比为(1.1～1.5)：1。
优选的，所述步骤(1)中的成盐反应在保护气氛和有机溶剂存在条件下进行。
优选的，所述步骤(1)中成盐反应的温度为80～150℃。
优选的，所述步骤(2)中水解反应在保护气氛、碱和有机溶剂存在条件下进行。
优选的，所述具有式IV所示结构的化合物与碱的摩尔比为1：(3.5～5.0)。
本发明提供了上述技术方案所述的氨基己糖酶荧光探针非治疗目的的在检测氨基己糖酶中的应用。
本发明提供了一种氨基己糖酶荧光探针，具有式I所示结构：
式I中，R为氢、烷基、烷氧基、N,N-二甲基、N,N-二乙基或N,N-二苯基。
本发明提供的氨基己糖酶荧光探针本身荧光较弱，在与氨基己糖酶作用后，会产生在612nm处具有强荧光的物质，且612nm处实时荧光强度与初始荧光强度的比值和氨基己糖酶在一定浓度范围内成线性关系，因此能够用于对氨基己糖酶的检测。具体的反应式如下：
此外，本发明提供的氨基己糖酶荧光探针是具有聚集诱导发光特性的化合物，可以有效避免传统荧光分子在高浓度下荧光猝灭的缺点。实施例的结果表明，本发明提供的氨基己糖酶荧光探针能够高灵敏度、高选择性的对溶液中的氨基己糖酶进行响应，并且具有聚集诱导发光特性，可以避免传统荧光分子在高浓度下或进入细胞后因聚集导致荧光猝灭，无法长时跟踪检测的缺点；同时，本发明提供的氨基己糖酶荧光探针在37℃下响应时间为60min，且稳定性好，对细胞内氨基己糖酶成像具有特异性，能够在活细胞中检测氨基己糖酶。
本发明还提供了所述氨基己糖酶荧光探针的制备方法，本发明提供的制备方法步骤简单，分离纯化过程容易操作。
附图说明
图1为10μM的TPE-NAG在0.5U/mL的氨基己糖酶存在条件下在PBS中孵化不同时间后的荧光光谱变化情况；
图2为TPE-NAG在612nm处的实时荧光强度与初始荧光强度的比值变化图；
图3为在10μM的TPE-NAG溶液中加入不同浓度氨基己糖酶孵化后荧光发射光谱的变化图；
图4为612nm处实时荧光强度与初始荧光强度的比值与氨基己糖酶浓度的关系；图4中插图为612nm处实时荧光强度与初始荧光强度的比值与氨基己糖酶的线性关系图；
图5为10μM的TPE-NAG溶液中分别加入不同竞争分子后612nm处荧光强度比值变化图；
图6为10μM的TPE-NAG溶液在612nm处的荧光强度比值随孵化时间的变化情况图；
图7探针TPE-NAG在不同正己烷体积分数(fH)的正己烷/四氢呋喃混合溶液中的荧光光谱；
图8为探针TPE-NAG在不同正己烷体积分数的正己烷/四氢呋喃混合溶液中612nm处的实时荧光强度与初始荧光强度的比值随不同正己烷体积分数变化的曲线图；
图9为TPE-NAG与HCT116细胞37℃下孵化1h后的激光共聚焦显微成像照片。
具体实施方式
本发明提供了一种氨基己糖酶荧光探针，具有式I所示结构：
式I中，R为氢、烷基、烷氧基、N,N-二甲基、N,N-二乙基或N,N-二苯基。
在本发明中，所述烷基和烷氧基中碳原子的个数独立的优选为1～6，更优选为1～3。在本发明中，所述氨基己糖酶荧光探针优选包括：
本发明提供了上述技术方案所述氨基己糖酶荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)将具有式II所示结构的化合物和具有式III所示结构的化合物进行成盐反应，得到具有式IV所示结构的化合物；
式III和式IV中，R为氢、烷基、烷氧基、N,N-二甲基、N,N-二乙基或N,N-二苯基；
(2)将所述具有式IV所示结构的化合物进行水解反应，得到具有式I所示结构的氨基己糖酶荧光探针。
本发明将具有式II所示结构的化合物和具有式III所示结构的化合物进行成盐反应，得到具有式IV所示结构的化合物；
式III和式IV中，R为氢、烷基、烷氧基、N,N-二甲基、N,N-二乙基或N,N-二苯基。
在本发明中，所述具有式II所示结构的化合物和具有式III所示结构的化合物均采用本领域技术人员公知的方法制备得到，具体的，具有式II所示结构的化合物可参考“Nat.Protoc.,2014,9,27；Synthesis,2010,13,2201”制备得到，具有式III所示结构的化合物可参考“Chem.–Asian J.,2013,8,2362；Anal.Chem.,2017,89,3162”制备得到。在本发明中，所述具有式II所示结构的化合物与具有式III所示结构的化合物的摩尔比优选为(1.1～1.5)：1，更优选为1.25：1。
在本发明中，所述成盐反应优选在保护气氛和有机溶剂存在条件下进行。本发明对所述有机溶剂的种类没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的适用于进行成盐反应的有机溶剂即可，具体如甲苯等。本发明对所述有机溶剂的用量没有特殊要求，能够将反应物完全溶解即可。
本发明优选将所述具有式II所示结构的化合物、具有式III所示结构的化合物和有机溶剂混合，得到成盐反应料液。本发明对所述混合的方式没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的混合方式即可。
得到成盐反应料液后，本发明将所述成盐反应料液进行成盐反应，得到具有式IV所示结构的化合物。在本发明中，所述成盐反应的温度优选为80～150℃，更优选为100～120℃，进一步优选为110℃。本发明对于所述成盐反应的时间没有特殊的限定，优选通过本领域公知的TLC板对反应进行监控，反应至具有式III所示结构的化合物完全消失即可。在本发明中，所述成盐反应优选在保护气氛、搅拌及回流条件下进行。本发明对保护气氛采用的保护气体没有特殊要求，采用成盐反应常用的保护气体即可。本发明对于所述搅拌的速率没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的搅拌速率即可。
成盐反应后，本发明优选还包括对成盐产物体系进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：
将成盐产物体系进行固液分离，得到液态混合物；
将所述液态混合物浓缩，得到浓缩物；
将所述浓缩物进行重结晶，得到具有式IV所示结构的化合物。
本发明对所述固液分离的具体方法没有特殊要求，抽滤即可；在本发明中，优选将所述固液分离后所得液态混合物进行浓缩；本发明对于所述浓缩没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的浓缩方法即可；在本发明的实施例中，优选通过旋转蒸发将所得液态混合物浓缩至固体。在本发明中，所述重结晶用溶剂优选为石油醚和三氯甲烷混合溶剂，所述混合溶剂中石油醚和三氯甲烷的体积比优选为2:1～1:2。经上述后处理后，得到的固体具有式IV所示结构。
得到具有式IV所示结构的化合物后，本发明将所述具有式IV所示结构的化合物进行水解反应，得到具有式I所示结构的氨基己糖酶荧光探针。
在本发明中，所述水解反应优选在保护气氛、碱和有机溶剂存在条件下进行。在本发明中，所述碱优选为碳酸钾；所述有机溶剂优选为甲醇。在本发明中，所述具有式IV所示结构的化合物与碱的摩尔比为优选为1：(3.5～5.0)，更优选为1：(3.5～4.5)。本发明对所述有机溶剂的用量没有特殊要求，能很好的将具有式IV所示结构的化合物溶解即可。
本发明优选将所述具有式IV所示结构的化合物、碱和有机溶剂混合，进行水解反应，得到具有式I所示结构的氨基己糖酶荧光探针。
本发明对所述混合的方式没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的混合方式即可。在本发明中，所述水解反应的温度优选为室温。本发明对于所述水解反应的时间没有特殊的限定，优选通过TLC板对反应进行监控，反应至具有式IV所示结构的化合物完全消失即可。在本发明中，所述水解反应优选在保护气氛下进行。本发明对于提供所述保护气氛的保护气体种类没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的保护气体即可，具体如氮气。
水解反应后，本发明优选还包括对水解反应产物体系依次进行萃取、干燥、浓缩和重结晶，得到具有式I所示结构的氨基己糖酶荧光探针。在本发明中，所述萃取所采用的萃取试剂优选为三氯甲烷-饱和食盐水，所述三氯甲烷和饱和食盐水的体积比优选为1:1；所述萃取的次数优选为3次；在本发明中，所述干燥的具体步骤优选为加入无水硫酸钠或无水硫酸镁等干燥剂静置干燥30min；所述浓缩的具体步骤优选为用旋转蒸发仪进行浓缩；所述重结晶用溶剂优选为乙酸乙酯和二氯甲烷的混合液，所述混合液中乙酸乙酯和二氯甲烷的体积比优选为1:1～1:3。重结晶完成后，本发明优选将重结晶产物干燥，得到纯净的式I所示结构的氨基己糖酶荧光探针。
本发明还提供了上述技术方案所述氨基己糖酶荧光探针或上述技术方案所述方法制备得到的氨基己糖酶荧光探针非治疗目的的在检测氨基己糖酶中的应用。在本发明中，所述氨基己糖酶优选为细胞内的氨基己糖酶；本发明对所述细胞的种类没有特殊要求，本领域熟知的需检测氨基己糖酶的细胞均可，具体的如人结肠癌细胞。
本发明提供的氨基己糖酶荧光探针本身荧光较弱，在与氨基己糖酶作用后，会产生在612nm处具有强荧光的物质，且612nm处实时荧光强度与初始荧光强度的比值和氨基己糖酶在一定浓度范围内成线性关系，根据具体的荧光强度比值以及线性曲线即可得到氨基己糖酶的浓度；所述线性曲线为荧光强度比值和氨基己糖酶浓度的关系曲线，本发明对所述线性曲线的绘制方法没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的方法即可；此外，本发明的荧光探针还具有聚集诱导发光特性，能够有效避免传统荧光分子在高浓度溶液中荧光猝灭的现象。
本发明对所述氨基己糖酶荧光探针的具体应用方法没有特殊限定，使用本领域技术人员熟知的方法进行应用即可。
下面结合实施例对本发明提供的氨基己糖酶荧光探针及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
按以下反应流程制备氨基己糖酶荧光探针：
(1)将化合物1(200mg，0.388mmol)、化合物2(146mg，0.310mmol)和甲苯混合，在氮气的保护下110℃回流，用TLC板监控反应进程直至化合物2完全消失；将反应混合液抽滤除掉不溶性杂质，所得产物用旋转蒸发浓缩至固体后，用三氯甲烷和石油醚重结晶，所用石油醚和三氯甲烷的体积比优选为1:1，得到黄色粉末状固体229mg。
经计算产率为75％；
对所得黄色粉末状固体进行表征，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.42(d,J＝6.4Hz,2H),8.04(d,J＝6.3Hz,2H),7.68–7.41(m,5H),7.25–7.10(m,5H),7.10–6.83(m,8H),6.79–6.52(m,4H),6.03(q,J＝13.7Hz,2H),5.62(d,J＝8.3Hz,1H),5.49(t,J＝10.0Hz,1H),5.16(t,J＝9.7Hz,1H),4.39–4.24(m,2H),4.10(d,J＝12.3Hz,1H),3.97(d,J＝9.8Hz,1H),3.76(s,3H),3.74(s,3H),2.11–1.95(m,12H).
根据上述表征数据可知，所得黄色粉末状固体为化合物3所示结构。
(2)将化合物3(150mg，0.152mmol)、碳酸钾(84mg，0.609mmol)与5mL甲醇混合，在氮气的保护下室温反应，用TLC板监控至化合物3消失，向反应混合物中加入饱和食盐水，用三氯甲烷萃取三次，所得有机相用无水硫酸钠干燥，旋转蒸发浓缩后，重结晶(溶剂为乙酸乙酯和二氯甲烷，体积比为1:2)，得到桔红色固体120mg。
经计算产率为92％；
对所得桔红色固体进行表征，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.91(d,J＝6.7Hz,2H),8.33(d,J＝7.0Hz,2H),7.79(d,J＝8.5Hz,2H),7.49(d,J＝8.7Hz,2H),7.26(d,J＝8.5Hz,2H),7.17–7.11(m,5H),7.04(d,J＝2.5Hz,1H),7.02(d,J＝1.7Hz,1H),6.98(d,J＝8.7Hz,2H),6.94(d,J＝8.8Hz,2H),6.69(t,J＝8.7Hz,4H),5.73(s,2H),5.14(d,J＝8.4Hz,1H),4.59(s,1H),3.97–3.86(m,2H),3.74(s,3H),3.73(s,3H),3.70(d,J＝5.7Hz,1H),3.62(dd,J＝10.4,8.5Hz,1H),3.49–3.38(m,2H),1.98(s,3H).
13C NMR(100MHz,MeOD)δ172.45,158.90,158.75,158.70,156.19,149.43,143.92,143.55,142.67,137.79,135.61,135.53,132.52,132.33,132.21,131.03,130.91,130.35,127.64,127.17,127.01,126.27,124.23,117.24,112.99,112.77,98.96,76.94,74.23,70.55,62.84,61.21,55.99,54.22,21.55.
根据上述表征数据可知，所得桔红色固体为TPE-NAG。
实施例2
对实施例1制备的氨基己糖酶探针进行性能测试，具体步骤如下：
(1)氨基己糖酶探针的响应时间测定：在2mL PBS溶液(5mM，pH值为7.4)中加入20μL TPE-NAG的DMSO溶液(1mM)，得到10μM的TPE-NAG溶液，然后加入0.5U/mL的氨基己糖酶溶液，所得混合溶液在37℃下孵化不同的时间(0、5、15、25、35、45、60min)，测定所述混合溶液的荧光光谱随孵化时间的变化情况。
图1为TPE-NAG在0.5U/mL的氨基己糖酶存在条件下在PBS中孵化不同时间后的荧光光谱变化情况；图2为TPE-NAG在612nm处的实时荧光强度与初始荧光强度的比值变化图，由图1和图2可知，在37℃下孵化60min后，荧光强度基本达到饱和。
(2)氨基己糖酶探针的荧光滴定测试：在2mLPBS溶液(5mM，pH值为7.4)中加入20μLTPE-NAG的DMSO溶液(1mM)，得到10μM的TPE-NAG溶液，然后分别加入不同浓度的氨基己糖酶溶液(分别为0、0.01、0.1、0.15、0.2、0.5、1U/mL，在37℃下孵60min后，测定加入不同浓度氨基己糖酶后所得溶液的荧光发射光谱(Ex＝360nm)，并以612nm处实时荧光强度与初始荧光强度的比值为纵坐标、氨基己糖酶的浓度为横坐标建立TPE-NAG对氨基己糖酶检测的线性曲线。
图3为在10μM的TPE-NAG溶液中加入不同浓度氨基己糖酶孵化后荧光发射光谱的变化图；图4为612nm处实时荧光强度与初始荧光强度的比值与氨基己糖酶浓度的关系；插图为612nm处实时荧光强度与初始荧光强度的比值与氨基己糖酶的线性关系图；所述线性曲线具体为Y＝19.20X+0.8291，荧光强度对于氨基己糖酶的浓度的线性响应在0～0.20U/mL(R2＝99.8％)之间。根据图3和图4可以看出，随着氨基己糖酶浓度的增大，612nm处荧光强度逐渐增强，荧光探针TPE-NAG可以在一定浓度范围内对溶液中的氨基己糖酶实现线性响应。
(3)氨基己糖酶探针的选择性测试：在2mL PBS溶液(5mM，pH值为7.4)中加入20μLTPE-NAG的DMSO溶液(1mM)，得到10μM的TPE-NAG溶液，分别加入a:0.5U/mL氨基己糖酶、b:100μL DMSO、c:2.5mM KCl、d:2.5mM NaCl、e:2.5mM CaCl2、f:2.5mM Na2SO4、g:2.5mM谷胱甘肽(GSH)、h:10mM葡萄糖、i:1mM天冬氨酸(Asp)、j:1mM赖氨酸(Lys)、k:1mM甲硫氨酸(Met)、l:1mM丝氨酸(Ser)、m:1mM亮氨酸(Leu)、n:1mM组氨酸(His)、o:1mM脯氨酸(Pro)、p:1mM双氧水(H2O2)、q:1mM溶菌素酶、r:0.5U/mLβ-半乳糖苷酶、s:0.5U/mL碱性磷酸酶、t:0.5U/mL纤维素酶、u:0.5U/mL羧酸酯酶，所得混合溶液分别在37℃下孵化60min，然后测定混合溶液612nm处荧光强度比值的变化。
图5为TPE-NAG溶液中分别加入不同竞争分子后612nm处荧光强度比值变化图。由图5可知，除氨基己糖酶外的其它生物分子与TPE-NAG反应前后的荧光强度比值均没有明显变化，说明TPE-NAG可以选择性的识别氨基己糖酶。
(4)氨基己糖酶探针的稳定性测试：在2mL PBS溶液(5mM，pH值为7.4)中加入20μLTPE-NAG的DMSO溶液(1mM)，得到10μM的TPE-NAG溶液，将该溶液在37℃下分别孵化不同时间(1min、2min、5min、10min、20min、30min、40min、50min和60min)，然后测定混合溶液612nm处实时荧光强度与初始荧光强度比值的变化。
图6为TPE-NAG溶液在612nm处的荧光强度比值随孵化时间的变化情况图，从图6可以看出，探针TPE-NAG的荧光强度随孵化时间的延长基本保持不变，说明探针TPE-NAG具有较好的稳定性。
(5)氨基己糖酶探针的AIE性质测试：在不同正己烷体积分数(fH)的正己烷/四氢呋喃混合溶液中分别加入20μL TPE-NAG的四氢呋喃溶液(1mM)，得到10μM的TPE-NAG溶液。分别测定不酮正己烷体积分数的混合溶液中TPE-NAG的荧光强度。
图7为探针TPE-NAG在不同正己烷体积分数(fH)的正己烷/四氢呋喃混合溶液中的荧光光谱(从低到高对应的体积分数依次为0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％)；图8为探针TPE-NAG在不同正己烷体积分数的正己烷/四氢呋喃混合溶液中612nm处的实时荧光强度与初始荧光强度的比值随不同正己烷体积分数的曲线图，从图7和图8可以看出，当fH低于30％时，随着fH的增大，探针TPE-NAG荧光强度开始变化不明显，当fH大于30％时，荧光强度逐渐增强，说明探针TPE-NAG具有AIE特性。
实施例3
对人结肠癌细胞(HCT116)内氨基己糖酶荧光成像情况进行测试，具体步骤如下：
HCT116细胞经过复苏接种于含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中，在37℃、5％CO2、100％饱和湿度的培养箱中培养，然后在18mm盖玻片上培养24h，待用。
将培养后的HCT116细胞分别浸入含20μM和50μM TPE-NAG的培养基中，在37℃、5％CO2、100％饱和湿度的培养箱中培养1h后，倒出培养基，用新鲜培养基清洗细胞3遍；加入2mL PBS溶液，在激光共聚焦荧光显微镜下观察，并用405nm作为激发光源，对其进行明场和暗场下拍照。
图9为TPE-NAG与HCT116细胞37℃下孵化1h后的激光共聚焦显微成像照片。由图9可知，探针TPE-NAG可对HCT116细胞中过表达的氨基己糖酶进行荧光成像，并且，当探针浓度由20μM增加到50μM时，荧光强度明显增强，说明TPE-NAG对HCT116细胞内氨基己糖酶的成像呈现浓度依赖关系。
实施例4
条件和实施例1相同，仅将化合物2替换为
对所得产物进行表征，可知得到的氨基己糖酶荧光探针为
实施例5
其他条件和实施例1相同，仅将化合物2替换为
对所得产物进行表征，可知得到的氨基己糖酶荧光探针为
实施例6
其他条件和实施例1相同，仅将化合物2替换为
对所得产物进行表征，可知得到的氨基己糖酶荧光探针为
按照实施例2～3的方法对实施例4～6所得氨基己糖酶荧光探针进行响应时间、荧光滴定、选择性、稳定性、AIE特性和人结肠癌细胞内成像情况进行测试，所得结果和实施例2～3相似。
由以上实施例可知，本发明提供的氨基己糖酶荧光探针具有聚集诱导发光特性特性，且稳定性好，能够应用于检测细胞内氨基己糖酶，可有效避免高浓度检测时荧光猝灭及进入细胞后因聚集导致的荧光猝灭现象，有利于细胞内或活体中长时跟踪检测，获得更高的成像分辨率，具有广阔的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种氨基己糖酶荧光探针，具有式I所示结构：
式I中，R为氢、烷基、烷氧基、N,N-二甲基、N,N-二乙基或N,N-二苯基。
2.根据权利要求1所述的氨基己糖酶荧光探针，其特征在于，所述烷基和烷氧基中碳原子的个数独立的为1～6。
3.根据权利要求1所述的氨基己糖酶荧光探针，其特征在于，所述氨基己糖酶荧光探针包括：
4.权利要求1～3任一项所述氨基己糖酶荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)将具有式II所示结构的化合物和具有式III所示结构的化合物进行成盐反应，得到具有式IV所示结构的化合物；
式III和式IV中，R为氢、烷基、烷氧基、N,N-二甲基、N,N-二乙基或N,N-二苯基；
(2)将所述具有式IV所示结构的化合物进行水解反应，得到具有式I所示结构的氨基己糖酶荧光探针。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中具有式II所示结构的化合物与具有式III所示结构的化合物的摩尔比为(1.1～1.5)：1。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的成盐反应在保护气氛和有机溶剂存在条件下进行。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中成盐反应的温度为80～150℃。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中水解反应在保护气氛、碱和有机溶剂存在条件下进行。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述具有式IV所示结构的化合物与碱的摩尔比为1：(3.5～5.0)。
10.权利要求1～3任一项所述的氨基己糖酶荧光探针非治疗目的的在检测氨基己糖酶中的应用。
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