CN114539183B - 一种癌细胞组织诊断的脂滴靶向和生物硫醇敏感的荧光探针及制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种癌细胞组织诊断的脂滴靶向和生物硫醇敏感的荧光探针及制备和应用，该荧光探针的具体结构式如下：该荧光探针对生物硫醇荧光信号具有超快的响应时间(Cys/Hcy/GSH为60s，Na2S为240s)，同时展现出显著的LDs靶向能力，已应用于活细胞LDs内的生物硫醇选择性成像；更重要的是，该探针可用于区分癌细胞/组织与正常细胞/组织，还可用于癌症患者手术标本的诊断。

Description

一种癌细胞组织诊断的脂滴靶向和生物硫醇敏感的荧光探针 及制备和应用
技术领域
本发明属于有机荧光探针领域，具体涉及一种癌细胞组织诊断的脂滴靶向和生物硫醇敏感的荧光探针及制备和应用。
背景技术
癌症作为一种绝症，已成为最紧迫的公共卫生问题之一。尽管每天新增癌症病例和死亡人数的统计数字令人生畏，但如果在早期得到及时诊断和治疗，大约30％的癌症患者是可以挽救的。目前基于基因组学和蛋白质组学的研究，已经发现了许多肿瘤标记物，它们确实大大提高了诊断水平。然而，由于癌细胞的遗传或表型异质性，通常不可能使用现有的标记物来诊断大范围的癌症。因此，迫切需要开发良好的肿瘤标记物来有效地区分各种癌细胞与正常细胞。
脂滴(Lipid droplets,LDs)是一种以中性脂肪为核心，由单层磷脂膜及外周蛋白包被的细胞器，存在于细菌到人类几乎所有的细胞中。LDs在许多重要的生理过程中发挥作用，如维持细胞能量稳态、防止脂肪毒性和细胞凋亡。LDs功能障碍和相关机制通常与多种疾病有关，包括代谢性疾病(如肥胖、糖尿病和动脉粥样硬化)和心脑血管疾病等。最近的研究表明，LDs的特殊结构或微环境变化与癌症的发生密切相关。例如，癌细胞中的LDs数量高于正常细胞，因为癌细胞需要LDs积累所提供的过量的能量。此外，有研究发现，与正常细胞中的LDs相比，由于癌细胞内的特异性脂质代谢变化，癌细胞中存在的LDs极性较低。因此，大量低极性LDs的存在已被报道为癌症诊断和治疗的潜在标志物。而且，越来越多的研究表明，一些肿瘤特异性的微环境，包括细胞外pH的降低，细胞内(尤其是线粒体内)谷胱甘肽(GSH)、活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)和粘度水平的升高，可被视为有效的肿瘤标志物，而与肿瘤类型无关。然而，最近报道的LDs靶向探针大多集中于监测LDs的动态运动或极性变化，而仅有有限的研究涉及LDs中的活性硫物质的检测，如二氧化硫(SO2)衍生物、硫化氢(H2S)和半胱氨酸(Cys)。更重要的是，LDs中生物硫醇水平(即，半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)、谷胱甘肽(GSH)和硫化氢(H2S))和肿瘤的联系尚未见报道。因此，开发一种LDs靶向和生物硫醇敏感型的探针，用于癌细胞/组织的诊断成为一大难题。
发明内容
本发明首次构建了一种LDs靶向和生物硫醇敏感的荧光探针BDTA-RSS，该荧光探针含有一个苯并噻唑基衍生物作为荧光团，以及一个2,4-二硝基苯磺酰基(DNBS)作为生物硫醇的敏感基团，其对生物硫醇荧光信号具有超快的响应时间(Cys/Hcy/GSH为60s，Na2S为240s)，同时展现出显著的LDs靶向能力，已应用于活细胞LDs内的生物硫醇选择性成像；更重要的是，该探针可用于区分癌细胞/组织与正常细胞/组织，还可用于癌症患者手术标本的诊断。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种癌细胞组织诊断的脂滴靶向和生物硫醇敏感的荧光探针，该荧光探针的具体结构式如下：
作为本发明的优选，该荧光探针对Cys、Hcy、GSH、Na2S均具有较高的选择性。
本发明还提供上述的癌细胞组织诊断的脂滴靶向和生物硫醇敏感的荧光探针的制备方法，该方法合成途径简洁，操作简单，具体包括以下步骤：
步骤S1、以4-(二乙氨基)水杨醛和2,4-二硝基苯磺酰氯为反应原料在常温常压下反应；其中，4-(二乙氨基)水杨醛与2,4-二硝基苯磺酰氯的物质的量之比为1～2：1.1～50；
步骤S2、将步骤S1得到的中间产物与苯并噻唑-2-乙腈进行反应，制备BTDA-RSS。
作为本发明的优选，步骤S1和步骤S2的反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂为二氯甲烷、乙醇、乙腈、甲醇、正丁醇、无水甲苯中的任意一种，反应温度为0-110℃，反应时间为10h～36h；步骤S1和步骤S2反应得到的产物均需通过硅胶色谱纯化，硅胶色谱纯化所用的溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇或丙酮与石油醚的混合物。
作为本发明的进一步优选，步骤S1的具体步骤为：在0℃下将4-(二乙氨基)水杨醛溶解在二氯甲烷中，加入2,4-二硝基苯磺酰氯，然后加入Et3N，将所得溶液在室温下搅拌过夜，然后真空浓缩溶剂，使用硅胶层析纯化残余物，硅胶层析所用的溶剂为PE/EtOAc,体积比为5:1；
步骤S2的具体步骤为：将步骤S1得到的中间产物、苯并噻唑-2-乙腈和乙酸铵在EtOH中的混合物在室温下搅拌过夜，然后真空浓缩溶剂，使用硅胶层析纯化残余物，硅胶层析所用的溶剂为PE/EtOAc,体积比为5:1。
另外，本发明使用BTDA-RSS可视化癌细胞，发现癌细胞中的荧光信号明显强于正常细胞，这一观察结果是癌细胞和正常细胞之间LDs中生物硫醇水平不同的结果；因此，BTDA-RSS可用作区分癌细胞与正常细胞的有效探针。本发明还使用BTDA-RSS可视化动物癌组织，发现肿瘤组织表现出明显明亮的荧光信号，而在正常组织中可以检测到非常微弱的荧光，表明肿瘤组织中的生物硫醇水平升高，该探针BTDA-RSS是癌症特异性的。本发明还使用BTDA-RSS可视化人类癌症组织，发现恶性组织都显示出比良性组织显著增强的荧光信号，进一步证实了BTDA-RSS对人类癌症的临床诊断潜力；因此，荧光探针BTDA-RSS可以在制备用于癌症诊断的检测试剂和/或试剂盒中应用。
作为本发明的优选，所述癌症包括宫颈癌、肺癌、乳腺癌、甲状腺癌。
本发明为了研究BTDA-RSS的细胞内位置，使用商业LDs染料(尼罗红)、商业溶酶体染料(LysoBrite NIR，LB-NIR)和商业线粒体染料(MitoTracker Deep Red，MTDR)进行了共染色实验分别在活的HeLa细胞中，结果BTDA-RSS和尼罗红的皮尔逊系数(PC)高达0.98，具有优越的LDs靶向能力。因此，荧光探针BTDA-RSS可以在制备用于特异性标记细胞内的脂滴的检测试剂和/或试剂盒中的应用。
本发明还提供一种癌细胞或癌组织的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤S1、采集患者的手术标本，切片；或，取活细胞；
步骤S2、将切片或活细胞与权利要求1所述的荧光探针BTDA-RSS一起孵育，并使用成像方法对切片或活细胞进行成像，当切片组织或活细胞表现出明显明亮的荧光信号，则证明是癌组织或癌细胞；成像时荧光最大激发波长为488nm，荧光最大发射波长为500-600nm。
本发明的优点和有益效果：
(1)本发明首次构建了一种LDs靶向和生物硫醇敏感的荧光探针BDTA-RSS，该荧光探针BDTA-RSS具有优越的LDs靶向能力，且对Cys、Hcy、GSH、Na2S均具有较高的选择性，检测限低(Cys的检测限为78.8nM，Hcy检测限为90.5nM，GSH检测限为86.4nM，Na2S检出限为0.16μM)，响应时间超快(Cys/Hcy/GSH为60s，Na2S为240s)。
(2)本发明提供的BTDA-RSS的荧光强度在pH 3.0到pH 10.0保持稳定，可以在较宽的pH范围内工作，适合用于生理pH值的成像；另外，该探针的合成途径简洁，操作简单。
(3)本发明提供的荧光探针BDTA-RSS可用于区分癌细胞/组织与正常细胞/组织，还可用于癌症患者手术标本的诊断，其可以在制备用于癌症诊断的检测试剂和/或试剂盒中应用；另外，由于其具有优越的LDs靶向能力；因此，该探针还可以在制备用于特异性标记细胞内的脂滴的检测试剂和/或试剂盒中的应用。
附图说明
图1是BTDA-RSS与生物硫醇的敏感机制和LDs生物硫醇在癌细胞中的可视化图。
图2是BTDA-RSS和BTDA的合成路线图。
图3中的(a)是在PBS/DMSO(1/1,v/v,pH 7.4)中加入Cys(0-20μM)后，BTDA-RSS(2.5μM)的荧光发射光谱，在458nm处激发；插图：紫外光下有无生物硫醇情况下BTDA-RSS溶液的荧光颜色；(b)是荧光强度(F528nm)与Cys曲线浓度的关系；插图：在0-4.5μM之间，与Cys浓度的线性关系；(c)是BTDA-RSS(2.5μM)分别与20μM的Hcy、GSH、Cys和Na2S在600s内的荧光动力学分析；(d)是BTDA-RSS(2.5μM)在PBS/DMSO(1/1,v/v,pH 7.4)中对各个分析物的荧光响应，在458nm处激发。
图4是PBS/DMSO中20μM的Hcy、GSH、Cys和Na2S对BTDA-RSS(2.5μM)的紫外光谱变化(1/1,v/v,pH 7.4)；插图：在自然光下有无生物硫醇的BTDA-RSS溶液的颜色。
图5是在PBS/DMSO(1/1,v/v,pH 7.4)中加入Hcy(0-20μM)(a)，GSH(0-20μM)(d)和Na2S(0-30μM)(g)后，BTDA-RSS(2.5μM)的荧光发射光谱，在458nm处激发；荧光强度(F528nm)与Hcy(b)、GSH(e)，和Na2S(h)浓度的关系曲线；Hcy在0-4.5μM(c)，GSH在0-5μM(f)、Na2S在0-8μM(i)浓度的线性关系。
图6是在不同pH条件下加入Cys(20μM)、Hcy(20μM)、GSH(20μM)、Na2S(30μM)后的荧光发射光谱。
图7是BTDA-RSS、BTDA、BTDA-RSS+Cys、BTDA-RSS+GSH、BTDA-RSS+Hcy、BTDA-RSS+Na2S及相应副产物的HRMS分析。
图8是5μM BTDA-RSS(a,e和i)与0.3μM Nilered(b)、1μM LB-NIR(f)或1μM MTDR(j)在活的HeLa细胞中共孵育的荧光图像；(d,h和l)BTDA-RSS分别与尼罗河红强度(PC＝0.98)、LB-NIR强度(PC＝0.38)和MTDR强度(PC＝0.20)的Pearson共定位相关性；BTDA-RSS：λex＝488nm，λem＝500-600nm；尼罗河红：λex＝561nm，λem＝600-650nm；LB-NIR或MTDR：λex＝633nm，λem＝650-750nm，比例尺：20μm。
图9是用不同浓度的BTDA-RSS(0、0.5、1、2.5、5、7.5和10μM)处理后的HeLa细胞的细胞活力。
图10是在活的HeLa细胞中，生物硫醇和Na2S的荧光图像。(a)是HeLa细胞与BTDA-RSS(5μM)孵育；(b)是NEM(1.0mM)预处理后，用BTDA-RSS(5μM)孵育的HeLa细胞；(c-f)是NEM预处理(1.0mM)HeLa细胞分别与Cys、GSH、Hcy和Na2S(100μM)孵育，然后与BTDA-RSS(5μM)孵育；(g-l)是a-f的明亮场；(m-r)是a-f与g-l的合并图像；(s)a-f的平均荧光强度(±SD,n＝3)；BTDA-RSS：λex＝488nm，λem＝500-600nm，比例尺：20μm。
图11中的(a-f)是BTDA-RSS(5μM)孵育的正常细胞和癌细胞的荧光图像；(g-l)是a-f的明亮场；(m)是a-f的平均荧光强度(±SD,n＝3)；BTDA-RSS：λex＝488nm，λem＝500-600nm，比例尺：20μm。
图12中的(a-f)是荷瘤小鼠正常组织和肿瘤组织中BTDA-RSS(20μM)的荧光图像；(g-l)是a-f的明亮场；(m)是a-f的平均荧光强度(±SD,n＝3)；BTDA-RSS：λex＝488nm，λem＝500-600nm，比例尺：50μm。
图13中的(a-d)是从患者的手术标本中提取的恶性组织和良性组织中的BTDA-RSS(20μM)的荧光图像；(e-h)是a-d的亮场；(i)是归一化荧光强度(±SD,n＝3)；BTDA-RSS：λex＝488nm，λem＝500-600nm，比例尺：50μm。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例来进一步说明本发明，但本发明的实施方式不限于此。对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1癌细胞组织诊断的脂滴靶向和生物硫醇敏感的荧光探针的制备
一种癌细胞组织诊断的脂滴靶向和生物硫醇敏感的荧光探针的制备方法，合成路线如图2所示，具体合成步骤为：
步骤S1、在0℃下将化合物1(20mg,0.10mmol)溶解在DCM(1mL)中，加入化合物2(40mg,0.15mmol)，然后加入Et3N(24μL,0.16mmol)；将所得溶液在室温下搅拌过夜；然后真空浓缩溶剂，使用硅胶层析纯化残余物(PE/EtOAc,5:1,v/v)，得到化合物3，红色固体(25mg,60％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.71(s,1H),8.66(d,J＝2.4Hz,1H),8.54(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),8.36(d,J＝8.8Hz,1H),7.68(d,J＝9.2Hz,1H),6.63(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),6.52(d,J＝2.8Hz,1H),3.43(q,J＝7.2Hz,4H),1.22(t,J＝7.2Hz,6H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ185.5,153.2,151.8,151.0,149.0,134.0,133.8,132.6,126.7,120.4,116.3,110.3,105.0,45.2,12.4.HRMS(ESI-TOF):calcd.for C17H18N3O8S[M+H]+424.0809；found 424.0819.
步骤S2、将化合物3(100mg,0.24mmol)、苯并噻唑-2-乙腈(47mg,0.27mmol)和乙酸铵(21mg,0.27mmol)在EtOH(5mL)中的混合物在室温下搅拌过夜；然后真空浓缩溶剂，使用硅胶层析纯化残余物(PE/EtOAc,5:1,v/v)，得到化合物BTDA-RSS，红色固体(22mg,30％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.33(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),8.20(d,J＝9.2Hz,1H),8.16(d,J＝2.0Hz,1H),8.08(d,J＝8.4Hz,1H),8.04(s,1H),7.92(d,J＝8.0Hz,1H),7.86(d,J＝8.0Hz,1H),7.56(t,J＝8.0Hz,1H),7.44(t,J＝8.0Hz,1H),6.72(dd,J＝9.2,2.0Hz,1H),6.68(d,J＝2.4Hz,1H),3.49(q,J＝7.2Hz,4H),1.28(t,J＝7.2Hz,6H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ162.9,153.4,152.0,151.1,150.6,149.0,139.4,134.7,133.7,133.6,130.5,127.4,126.7,126.1,123.0,122.0,120.9,117.2,111.9,111.3,106.8,100.0,45.3,12.6.HRMS(ESI-TOF):calcd.for C26H22N5O7S2[M+H]+580.0955；found 580.0950.
实施例2 BTDA-RSS对生物硫醇的光谱响应
(1)Cys测试BTDA-RSS在PBS/DMSO(1/1,v/v,pH 7.4)中的光谱响应：
如图4所示，添加Cys后，BTDA-RSS呈现出非常微弱的红移，溶液颜色从无色变为黄色。图3a描绘了458nm激发波长下BTDA-RSS对Cys的荧光光谱。BTDA-RSS本身几乎没有荧光信号；然而，在添加20μM Cys后，在528nm附近观察到显著的荧光增强，荧光颜色从无色变为绿色。BTDA-RSS的荧光强度(F528 nm)在0-4.5μM(F528 nm＝444343.83CCys+7263.99,R2＝0.992)范围内也显示出与Cys良好的线性关系(图3b)，检测限低至78.8nM；最重要的是，发射强度仅在60s内达到饱和(图3c)，这比之前的大多数报告都要快。
(2)Hcy、GSH和Na2S测试BTDA-RSS在PBS/DMSO(1/1,v/v,pH 7.4)中的光谱响应：
在同一测试系统中，如图5所示，在用Hcy、GSH和Na2S处理后，观察到明显的荧光增强(超过180倍)，响应时间超快(Hcy/GSH为60s，Na2S为240s)(图3c)，与Cys相似，表明BTDA-RSS在实时监测生物系统中的生物硫醇方面具有巨大潜力。BTDA-RSS与Hcy(0-4.5μM)、GSH(0-5μM)和Na2S(0-8μM)呈线性关系，相应的检出限计算为90.5nM、86.4nM和0.16μM。
(3)其他氨基酸和常见离子测试BTDA-RSS在PBS/DMSO(1/1,v/v,pH 7.4)中的光谱响应：
如图3d所示，加入Cys/Hcy/GSH和Na2S后，BTDA-RSS的荧光强度迅速增强100倍以上；相比之下，其他测试的分析物引发的光谱变化可忽略不计，证实了BTDA-RSS对生物硫醇的高选择性。
(4)有无生物硫醇条件下BTDA-RSS的pH效应评估：
如图6所示，BTDA-RSS的荧光强度从pH 3.0到pH 10.0保持稳定；在生物硫醇和Na2S处理后，BTDA-RSS在pH高于5时表现出显着的荧光开启响应，并在pH 7.4左右达到最大值，表明BTDA-RSS可以在较宽的pH范围内工作，适合用于生理pH值的成像。
实施例3 BTDA-RSS响应生物硫醇的机制
为了探索BTDA-RSS对生物硫醇的响应机制，BTDA-RSS与Cys/Hcy/GSH和Na2S之间的相互作用分别通过质谱分析进行(图7)。在与Cys/Hcy/GSH和Na2S反应后，不再观察到游离BTDA-RSS在m/z＝580.0950峰处的质量峰([BTDA-RSS+H]+,BTDA-RSS的计算值：579.0882)，而m/z＝350.1322[BTDA-RSS+Cys]+、350.1318[BTDA-RSS+Hcy]+、350.1321[BTDA-RSS+GSH]+和350.1323[BTDA-RSS+Na2S]+对应BTDA的新峰([BTDA+H]+，计算为BTDA：349.1249)。同时，m/z＝287.15(计算值：287.0212)、301.14(计算值：302.1441)、473.34(计算值：474.1096)和168.02(计算值：168.0199)的其他峰分别被证明是相应的副产物。基于这些观察，我们可以提出BTDA-RSS与生物硫醇和Na2S的荧光反应可能通过图1中所示的路线进行：生物硫醇和Na2S的强亲核取代促进DNBS基团裂解生成酚盐中间体，通过快速环化释放荧光苯并噻唑基亚氨基香豆素BTDA，从而显著增强生物硫醇依赖性荧光。
实施例4 BTDA-RSS在活细胞中的脂滴靶向和生物硫醇敏感性能力
在进行生物成像测定之前，进行CCK-8测定以评估BTDA-RSS对HeLa细胞的细胞毒性。如图9所示，当BTDA-RSS的浓度在培养24小时后从0μM增加到10μM时，超过85％的细胞存活，表明BTDA-RSS对活细胞的毒性较低。
为了研究BTDA-RSS的细胞内位置，使用商业LDs染料(尼罗红)、商业溶酶体染料(LysoBrite NIR，LB-NIR)和商业线粒体染料(MitoTracker Deep Red，MTDR)进行了共染色实验分别在活的HeLa细胞中(HeLa细胞分别与BTDA-RSS(5μM)和尼罗红(0.3μM)、LB-NIR或MTDR(1μM)共孵育30分钟，使用CLSM捕获荧光图像；BTDA-RSS:λex＝488nm,λem＝500-600nm；Nile Red:λex＝561nm,λem＝600-650nm；LB-NIR:λex＝633nm,λem＝650-750nm；MTDR:λex＝633nm,λem＝650-750nm.)；如图8a所示，BTDA-RSS显示出典型的点状形态，BTDA-RSS和尼罗红的皮尔逊系数(PC)高达0.98。相比之下，BTDA-RSS分别与LB-NIR(PC为0.38)和MTDR(PC为0.20)(图8)显示低重叠，表明BTDA-RSS具有优越的LDs靶向能力。
为了合理解释BTDA-RSS的高特异性，使用ChemBioDraw 14.0软件计算了BTDA-RSS的logP(正辛醇/水分配系数)。正如预期的那样，计算的logP值为5.177，确认了合适的亲脂性用于特定LDs目标的BTDA-RSS。
凭借其靶向LDs的内在能力和优异的生物硫醇敏感特性，BTDA-RSS对Cys/Hcy/GSH和Na2S的荧光响应得到了证实，使用共聚焦荧光图像进行了研究。如图10a所示，HeLa细胞与BTDA-RSS(5μM)一起孵育30分钟后可观察到清晰的荧光信号，表明活细胞中存在内源性生物硫醇。然而，在用1mM N-乙基马来酰亚胺(NEM，一种可以去除内源性硫醇的捕获试剂)预处理HeLa细胞(孵育30分钟)后，荧光信号明显下降(图10b)。然后，分别将Cys(100μM)、Hcy(100μM)、GSH(100μM)和Na2S(100μM)添加到NEM预处理的细胞中，然后孵育BTDA-RSS，再次观察到约5倍以上的荧光增强(图10c-f和s)。这些结果表明，BTDA-RSS以对活细胞中的生物硫醇和Na2S变化表现出敏感的反应。
实施例5活细胞/组织中的荧光成像
(1)使用BTDA-RSS可视化癌细胞：
将活癌细胞(HeLa、4T1和A549)和活正常细胞(MPC5、PC12和TM3)分别与BTDA-RSS(5μM)一起孵育30分钟，癌细胞中的荧光信号明显强于正常细胞，荧光增强5倍以上(图11)。这一观察结果是癌细胞和正常细胞之间LDs中生物硫醇水平不同的结果；因此，BTDA-RSS可用作区分癌细胞与正常细胞的有效探针。
(2)使用BTDA-RSS可视化动物癌组织：
通过将HeLa细胞皮下注射到裸鼠的右腋窝中14天来制备荷瘤小鼠。然后，从小鼠中分离出正常器官(心脏、脾脏、肝脏、肺和肾脏)和肿瘤，并切片为5μm厚；这些组织切片与BTDA-RSS(20μM)一起孵育30分钟，与BTDA-RSS孵育30min后，肿瘤组织表现出明显明亮的荧光信号，而在正常组织中可以检测到非常微弱的荧光，表明肿瘤组织中的生物硫醇水平升高(图12)，并且探针BTDA-RSS是癌症特异性的。
(3)使用BTDA-RSS可视化人类癌症组织：
将采集的患者手术标本，包括两个良性组织(包括甲状腺和乳房)及其恶性组织，冷冻切片为5μm厚；将切片与BTDA-RSS(5μM)一起孵育20分钟，所有恶性组织都显示出比良性组织显着增强的荧光信号，证实了BTDA-RSS对人类癌症的临床诊断潜力(图13)。
另外，需要说明，本发明的细胞培养与细胞毒性试验如下：
HeLa、4T1、A549、MPC5、PC12和TM3细胞在补充有10％胎牛血清和1％抗生素的RPMI1640或DEME培养基中于37℃、5％CO2气氛中培养。BTDA-RSS对活HeLa细胞的细胞毒性通过标准CCK-8测定法进行。将200μL细胞培养基中的细胞约以每孔1×104个接种在96孔微孔板中，然后将培养基更换为含有不同浓度BTDA-RSS的新鲜培养基，分别在0μM、0.5μM、1μM、2.5μM、5μM、7.5μM、10μM浓度中培养24h，用新鲜培养基洗涤细胞3次后，每孔加入20μLCCK-8的180μL PBS溶液，再上样4h。然后用ELISA酶标仪分析每个孔，并在450nm处检测吸光度；细胞活力表示为相对于作为100％代谢活性的对照细胞。

Claims (8)

1.一种癌细胞组织诊断的脂滴靶向和生物硫醇敏感的荧光探针，其特征在于，该荧光探针的具体结构式如下：
2.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，该荧光探针对Cys、Hcy、GSH、Na2S均具有选择性。
3.权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤S1、以4-(二乙氨基)水杨醛和2,4-二硝基苯磺酰氯为反应原料在常温常压下反应；其中，4-(二乙氨基)水杨醛与2,4-二硝基苯磺酰氯的物质的量之比为1～2：1.1～50；
步骤S2、将步骤S1得到的中间产物与苯并噻唑-2-乙腈进行反应，制备BTDA-RSS。
4.根据权利要求3所述的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤S1和步骤S2的反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂为二氯甲烷、乙醇、乙腈、甲醇、正丁醇、无水甲苯中的任意一种，反应温度为0-110℃，反应时间为10h～36h；步骤S1和步骤S2反应得到的产物均需通过硅胶色谱纯化，硅胶色谱纯化所用的溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇或丙酮与石油醚的混合物。
5.根据权利要求4所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S1的具体步骤为：在0℃下将4-(二乙氨基)水杨醛溶解在二氯甲烷中，加入2,4-二硝基苯磺酰氯，然后加入Et3N，将所得溶液在室温下搅拌过夜，然后真空浓缩溶剂，使用硅胶层析纯化残余物，硅胶层析所用的溶剂为PE/EtOAc,体积比为10～60：1～2；步骤S2的具体步骤为：将步骤S1得到的中间产物、苯并噻唑-2-乙腈和乙酸铵在EtOH中的混合物在室温下搅拌过夜，然后真空浓缩溶剂，使用硅胶层析纯化残余物，硅胶层析所用的溶剂为PE/EtOAc,体积比为10～60：1～2。
6.权利要求1所述的荧光探针在制备用于癌症诊断的检测试剂和/或试剂盒中的应用。
7.根据权利要求6所述的荧光探针的应用，其特征在于，所述癌症为宫颈癌、肺癌、乳腺癌或甲状腺癌。
8.权利要求1所述的荧光探针在制备用于特异性标记细胞内的脂滴的检测试剂和/或试剂盒中的应用。
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