CN114605343B - 一种荧光基团LAN-OH、荧光传感器LAN-βgal及其制备方法和应用 - Google Patents
一种荧光基团LAN-OH、荧光传感器LAN-βgal及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种荧光基团LAN‑OH、荧光传感器LAN‑βgal及其制备方法和应用，涉及传感器技术领域。本发明基于所述荧光基团LAN‑OH设计并合成了一种膜透性荧光化学传感器LAN‑βgal，对光、酸度和温度具有出色的稳定性，并且对β‑gal具有特异性。LAN‑βgal可以灵敏的检测卵巢癌细胞系中的细胞内β‑gal活性，并能够清楚的区分卵巢癌细胞与其他癌细胞和正常卵巢细胞。而且，LAN‑βgal在腹膜转移瘤模型中对直径小于5mm的卵巢癌肿瘤进行成像，可将所述LAN‑βgal用于卵巢肿瘤成像。
Description
技术领域
本发明属于传感器技术领域，具体涉及一种荧光基团LAN-OH、荧光传感器LAN-βgal及其制备方法和应用。
背景技术
腹膜转移瘤是恶性肿瘤最常见的转移部位，由癌细胞直接种植生长或癌细胞通过微血管转移至腹膜引起。常见于胃癌、结肠癌、卵巢癌等。特别是，60-75％的卵巢癌患者被诊断为侵袭性腹膜转移，这主要是由于早期疾病的无症状性，早期诊断很困难。发生腹膜转移，患者常为晚期。因此，卵巢癌的早期诊断尤为重要。
LacZ基因编码的β-半乳糖苷酶(β-gal)是一种典型的糖苷水解酶，可催化多种底物的水解，包括神经节苷脂GM1、乳糖和多种糖蛋白，也是卵巢癌的重要生物标志物。与正常细胞相比，β-gal在卵巢癌细胞中过度表达，参与卵巢癌细胞的发生和转移。同时，β-gal也被认为是细胞衰老的原因。此外，β-gal缺乏可导致β-半乳糖唾液酸中毒或Morquio B综合征。与此同时，β-gal也是原发性卵巢癌的重要生物标志物，在此被选为卵巢癌细胞成像和体内恶性肿瘤可视化的分子靶标。但是现有的检测方法，由于大多数现有的探针发射波长短、荧光强度弱或选择性差，因此，开发一种特异性的β-gal检测和成像方法具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种荧光基团LAN-OH、荧光传感器LAN-βgal及其制备方法和应用，所述荧光传感器LAN-βgal具有光稳定性、特异性和超灵敏性，可完成特异性可视化检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种荧光基团LAN-OH，所述荧光基团LAN-OH的结构式如式I所示：
本发明还提供了上述荧光基团LAN-OH的制备方法，包括以下步骤：将式II所示化合物与1-萘酚在酸性条件下反应，纯化得所述荧光基团LAN-OH；
优选的，所述反应前还包括将式II所示化合物与1-萘酚共同溶解于CH2Cl2中；
所述纯化包括硅胶色谱法纯化，使用石油醚和乙酸乙酯的混合物作为流动相，石油醚和乙酸乙酯的体积比为5:1。
本发明还提供了一种基于上述荧光基团LAN-OH制备得到的特异性识别β-半乳糖苷酶的膜透性荧光化学传感器LAN-βgal，所述荧光化学传感器LAN-βgal的制备原料还包括特异性识别单元D-半乳糖残基；
所述D-半乳糖残基包括2,3,4,6-四邻乙酰基-α-D-吡喃半乳糖基溴。
优选的，所述荧光化学传感器LAN-βgal的结构式如式III所示：
本发明还提供了上述荧光化学传感器LAN-βgal的制备方法，包括以下步骤：(1)将荧光基团LAN-OH和2,3,4,6-四邻乙酰基-α-D-吡喃半乳糖基溴共同溶解在乙腈溶剂中，在Cs2CO3和Na2SO4作用下搅拌24h，纯化后得中间产物；
(2)将步骤(1)所述中间产物溶于甲醇中，在甲醇钠作用下搅拌3h，纯化后得荧光化学传感器LAN-βgal。
优选的，步骤(1)所述纯化的方法包括硅胶色谱法，利用甲醇和二氯甲烷的混合物作为流动相，所述甲醇和二氯甲烷的体积比为1:200。
优选的，步骤(2)所述纯化的方法包括硅胶色谱法，使用甲醇和二氯甲烷的混合物作为流动相，所述甲醇和二氯甲烷的体积比为1:100。
本发明还提供了上述荧光化学传感器LAN-βgal在制备可视化靶向卵巢癌肿瘤工具中的应用。
本发明还提供了上述荧光化学传感器LAN-βgal在制备可视化检测β-半乳糖苷酶活性的试剂盒中的应用。
有益效果：本发明提供了一种荧光基团LAN-OH，并基于所述荧光基团LAN-OH制备了膜透性荧光化学传感器LAN-βgal，所述荧光化学传感器LAN-βgal对光、酸度和温度具有出色的稳定性，并且对β-gal具有特异性。本发明利用优异的荧光团LAN-OH(ΦF＝0.47)和特异性识别单元D-半乳糖残基构建的LAN-βgal在激活时能产生大于2000倍的荧光增强，这是迄今为止报道的所有探针中最高的荧光增强。在本发明实施例中，LAN-βgal可以灵敏的检测卵巢癌细胞系(SKOV3和A2780)中的细胞内β-gal活性，并能够清楚的区分卵巢癌细胞与其他癌细胞(HeLa和HepG2)和正常卵巢细胞(IOSE80)，也进一步证实了β-gal与细胞衰老密切相关。最后，LAN-βgal成功用于卵巢肿瘤成像，还成功的在腹膜转移瘤模型中对直径小于5mm的卵巢癌肿瘤进行成像。
附图说明
图1为本发明所述荧光基团LAN-OH和荧光化学传感器LAN-βgal的完整制备流程；
图2为LAN-βgal的光谱特性及光学响应；其中(A)表示LAN-βgal的吸收带，(B)表示LAN-βgal的发射光谱，(C)和(D)表示LAN-βgal的在黑暗中或在激发波长的荧光强度，(E)表示荧光强度随时间的变化，(F)表示荧光强度随pH的变化；
图3为β-gal活性的测定结果；其中(A)表示LAN-βgal对β-gal的敏感性测定结果，(B)表示荧光信号和β-gal浓度的线性关系，(C)表示吸光度与β-gal浓度的测定结果，(D)表示吸光度与β-gal浓度的线性关系；
图4为LAN-βgal对于β-gal的特异性测定结果；其中(A)表示LAN-βgal(10μM)对阳离子的荧光强度(1mM):1.Na+；2.K+；3.Co2+；4.Fe3+；5.Ba2+；6.Li+；7.Cu2+；8.Ag+；9.Zn2+；10.Hg2+；11.Ca2+；12.Ni2+；13.Mg2+；14.Mn2+；(B)表示LAN-βgal(10μM)对阴离子的荧光强度(1mM):1.H2PO4 -；2.F-；3.AcO-；4.SO4 2-；5.Br-；6.I-；7.CN-；8.SCN-；9.ClO4 2-；10.HPO4 2-；11.Cl-；12.HSO4 -；(C)表示LAN-βgal(10μM)对氨基酸(1mM)和小分子(1mM)的荧光强度：1.L-Arginine；2.L-Alanine；3.DL-Homocysteine；4.DL-phenylalanine；5.L-Cysteine；6.L-Leucine；7.DL-Methionine；8.Glycine；9.L-Glutamic；10.D(+)-Mannose；11.D-Fructose；12.Dithiothreitol；13.L-Ascorbic；14.Chitosan；15.H2O2；(D)表示LAN-βgal(10μM)在β-gal和(A)、(B)、(C)等分析物存在下的荧光光谱；
图5为LAN-βgal特异性识别β-gal的机理；
图6为LAN-βgal对β-gal的结合亲和力测定结果；
图7为细胞荧光成像结果；其中(A)表示癌细胞内源性β-gal的荧光成像，所有细胞首先分别与5μM Hoechst33342(一种核酸染料)孵育5min；a、b、c、e：用20μM LAN-βgal处理2h；d、f：先用1mM D-半乳糖处理2h，然后再用20μM LAN-βgal处理2h；λex＝559nm；从580-680nm捕获发射波长；(B)对应于(A)的癌细胞的平均荧光值；
图8为LAN-βgal可以清楚地区分卵巢癌细胞和正常卵巢细胞；其中(A)表示β-gal在正常卵巢细胞(IOSE80)、卵巢癌细胞(SKOV3和A2780)和两组混合细胞(IOSE80细胞分别与SKOV3细胞和A2780细胞混合)中的荧光成像；a、b、c、d、e：20μM LAN-βgal处理2h，λex＝559nm；发射波长为580～680nm；(B)对应于(A)的癌细胞的平均荧光值；
图9为β-gal与细胞衰老的验证结果；其中(A)表示β-半乳糖在非衰老细胞和衰老细胞中的荧光成像比较；a、c、e：与20μM LAN-βgal孵育2h；b、d、f：与1μM MLN4924孵育72h，与20μM LAN-βgal孵育2h；λex＝559nm；发射波长为580～680nm；(B)对应于(A)的癌细胞的平均荧光值；
图10为LAN-βgal在肿瘤中可视化β-gal的测定；其中(A)表示分别对A2780肿瘤和HepG2肿瘤原位注射200μM(50μL)LAN-βgal后3h，荷瘤裸鼠体内β-gal活性的体内成像；(B)在尾静脉注射200μM(200μL)LAN-βgal后3h，荷瘤裸鼠中β-gal活性的体内成像；(C)与200μMLAN-βgal孵育后主要内脏器官、A2780肿瘤和HepG2肿瘤的荧光图像；(D)腹膜转移瘤模型中β-gal活性的荧光成像；左图：用10mM(100μL)PBS处理2h，再用200μM(100μL)LAN-βgal处理3h；右图：用50mM(100μL)D-半乳糖处理2h，再用200μM(100μL)LAN-βgal处理3h。
具体实施方式
本发明提供了一种荧光基团LAN-OH，所述荧光基团LAN-OH的结构式如式I所示：
本发明所述LAN-OH优选为橙色固体(130mg，65％)。1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.60(d,J＝8.0Hz,1H),8.14(d,J＝7.8Hz,1H),7.85(t,J＝7.5Hz,1H),7.78(d,J＝7.4Hz,1H),7.70(d,J＝8.7Hz,1H),6.85(d,J＝8.8Hz,1H),6.76(s,1H),6.36(s,1H).13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ182.42,161.50,151.35,145.32,142.41,132.03,131.33,131.20,131.09,131.01,126.14,125.11,123.82,113.99,105.64,101.77.MS(LC-HRMS,m/z)for C16H10NO3 +[M+H]+:calculated,264.0655；found:264.0652。
本发明还提供了上述荧光基团LAN-OH的制备方法，如图1所示包括以下步骤：将式II所示化合物与1-萘酚在酸性条件下反应，纯化得所述荧光基团LAN-OH；
本发明在所述反应前优选还包括将式II所示化合物与1-萘酚共同溶解于CH2Cl2中。在本发明中，所述反应时式II所示化合物与1-萘酚的摩尔比优选为1.1:1，且利用盐酸提供酸性环境。本发明所述反应优选在室温(18～25℃)下进行，并在反应进行时伴随搅拌，共搅拌5h，而后进行所述纯化。本发明所述纯化优选包括硅胶色谱法纯化，使用石油醚和乙酸乙酯的混合物作为流动相，石油醚和乙酸乙酯的体积比优选为5:1。
本发明还提供了一种基于上述荧光基团LAN-OH制备得到的特异性识别β-半乳糖苷酶的膜透性荧光化学传感器LAN-βgal，所述荧光化学传感器LAN-βgal的制备原料还包括特异性识别单元D-半乳糖残基；
所述D-半乳糖残基包括2,3,4,6-四邻乙酰基-α-D-吡喃半乳糖基溴。
本发明所述荧光化学传感器LAN-βgal的结构式优选如式III所示：
本发明所述LAN-βgal为黄色固体(81mg，71％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.60(d,J＝6.7Hz,1H),8.13(dd,J＝7.6,1.3Hz,1H),7.92–7.77(m,3H),7.18–7.04(m,2H),6.41(d,J＝4.8Hz,1H),5.31(d,J＝5.1Hz,1H),5.06(d,J＝7.6Hz,1H),4.97(d,J＝5.7Hz,1H),4.74(t,J＝5.5Hz,1H),4.61(d,J＝4.7Hz,1H),3.77–3.43(m,6H).13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ182.56,160.11,151.33,144.94,144.14,132.20,131.52,131.43,131.08,130.53,127.57,125.18,124.07,114.44,106.00,102.63,100.73,75.70,73.19,70.08,68.06,60.32.MS(LC-HRMS,m/z)for C22H20NO8 +[M+H]+:calculated,426.1183；found:426.1178。
本发明还提供了上述荧光化学传感器LAN-βgal的制备方法，合成路线如图1所示，包括以下步骤：(1)将荧光基团LAN-OH和2,3,4,6-四邻乙酰基-α-D-吡喃半乳糖基溴共同溶解在乙腈溶剂中，在Cs2CO3和Na2SO4作用下搅拌24h，纯化后得中间产物；
(2)将步骤(1)所述中间产物溶于甲醇中，在甲醇钠作用下搅拌3h，纯化后得荧光化学传感器LAN-βgal。
本发明将荧光基团LAN-OH和2,3,4,6-四邻乙酰基-α-D-吡喃半乳糖基溴共同溶解在乙腈溶剂中，在Cs2CO3和Na2SO4作用下搅拌24h，纯化后得中间产物。本发明所述荧光基团LAN-OH和2,3,4,6-四邻乙酰基-α-D-吡喃半乳糖基溴的摩尔比优选为1:17。本发明所述Cs2CO3和Na2SO4的摩尔比优选为1:4.7，且所述Cs2CO3与LAN-OH的摩尔量相同。本发明所述纯化的方法优选包括硅胶色谱法，利用甲醇和二氯甲烷的混合物作为流动相，所述甲醇和二氯甲烷的体积比优选为1:200。本发明经纯化后得到的中间产物的结构优选如图1中标号为2的化合物所示。
得中间产物后，本发明将步骤(1)所述中间产物溶于甲醇中，在甲醇钠作用下搅拌3h，纯化后得荧光化学传感器LAN-βgal。本发明所述甲醇钠与所述中间产物的摩尔比优选为0.245:0.27。本发明所述搅拌优选在室温下进行，在搅拌后进行纯化，所述纯化的方法包括硅胶色谱法，使用甲醇和二氯甲烷的混合物作为流动相，所述甲醇和二氯甲烷的体积比为1:100。
本发明所述荧光化学传感器LAN-βgal具有光稳定性和良好的pH稳定性，可以实现比色法和荧光法对β-gal的双信号检测；且所述LAN-βgal特异性高。在利用所述LAN-βgal对β-gal进行检测时，β-gal特异性识别并切断LAN-βgal的D-半乳糖单元，释放LAN-OH，最终实现了对β-gal的特异性检测。本发明所述检测的样本优选包括尿液。
在本发明实施例中，基于尿液中令人满意的加标回收率，以商用ELISA试剂盒为对照，成功地利用LAN-βgal准确评估了卵巢癌患者尿液中β-gal的含量。此外，LAN-βgal对卵巢癌细胞进行特异性成像，而对其他癌细胞(HeLa和HepG2)和正常卵巢细胞(IOSE80)没有反应。LAN-βgal也验证了β-gal与细胞老化的密切关系。在体内实验中，LAN-βgal仅通过瘤内或尾静脉注射特异性点亮卵巢癌肿瘤，对肝癌肿瘤没有反应，LAN-βgal可以在腹膜转移肿瘤模型中对直径小于5mm的卵巢癌肿瘤进行成像。如上所述，LAN-βgal可用作荧光引导诊断卵巢癌的非常有前景的工具。
本发明还提供了上述荧光化学传感器LAN-βgal在制备可视化靶向卵巢癌肿瘤工具中的应用。本发明所述应用优选与上述相同，在此不再赘述。
本发明还提供了上述荧光化学传感器LAN-βgal在制备可视化检测β-半乳糖苷酶活性的试剂盒中的应用。本发明所述应用优选与上述相同，在此不再赘述。
下面结合实施例对本发明提供的一种荧光基团LAN-OH、荧光传感器LAN-βgal及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、材料合成
LAN-βgal的合成路线如图1所示：
将化合物1(0.153g，1.1mmol)和1-萘酚(0.144g，1mmol)加入装有5mL CH2Cl2的反应瓶中，然后将3mL盐酸滴加到反应瓶中，混合，室温下搅拌均匀5h。产物通过硅胶色谱法纯化，使用石油醚和乙酸乙酯(v/v＝5:1)的混合物作为流动相，从中得到化合物LAN-OH，为橙色固体(130mg，65％)。
将LAN-OH(0.053g，0.2mmol)和2,3,4,6-四邻乙酰基-α-D-吡喃半乳糖基溴(0.13974g，3.4mmol)溶解在5mL乙腈溶剂中，然后将Cs2CO3(0.065g，0.2mmol)和Na2SO4(0.133g，0.94mmol)加入反应瓶中，室温下搅拌24h。使用甲醇和二氯甲烷(v/v＝1:200)的混合物作为流动相，通过硅胶色谱法纯化产物，由此得到化合物2。
将化合物2(0.1617g，0.27mmol)溶于4mL甲醇中，然后将甲醇钠(0.01325g，0.245mmol)加入反应瓶中，室温搅拌3h。产物通过硅胶色谱法纯化，使用甲醇和二氯甲烷的混合物(v/v＝1:100)作为流动相，从中得到LAN-βgal。
2、一般检测程序
首先将LAN-βgal溶解在二甲基亚砜中，得到1mM的原液。接下来在含有10μM LAN-βgal的1％(v/v)二甲基亚砜的磷酸盐缓冲溶液(PBS 10mM，pH 7.4)中，37℃下检测所有光学性质。激发和发射波长为580和642nm。
3、光谱特性及光学响应
为了测试化学传感器的有效性，用生理缓冲溶液中的β-gal研究了LAN-βgal的光谱特性。如图2中(A)所示，LAN-βgal显示出以415nm为中心的吸收带。用β-gal滴定LAN-βgal后，出现一个以575nm为中心的典型吸收带，与LAN-βgal的吸收带明显不同，颜色由淡黄色到红色有明显变化。随后进一步探索了LAN-βgal的发射光谱。如图2中(B)所示，LAN-βgal在580nm激发波长下显示出极弱的荧光强度。用β-gal滴定到LAN-βgal后，明显的发射曲线出现在642nm处。以上结果表明LAN-βgal可以实现比色法和荧光法对β-gal的双信号检测。
LAN-βgal的光稳定性结果如图2中(C)和(D)所示，LAN-βgal的荧光强度在黑暗中或在激发波长的连续照射下几乎没有显着变化。此外，LAN-OH和反应体系的光稳定性惊人的稳定。以上结果表明LAN-βgal具有光稳定性，可以为检测的准确性提供保障。
时间和pH对检测β-gal的LAN-βgal的影响
结果如图2中(E)所示，荧光强度在0-50min内迅速增加，50min后几乎没有增加。因此，在所有体外实验中，反应时间都设定为50min。随后，研究pH对检测的影响。如图2中(F)所示，无论在酸性、碱性还是中性条件下，LAN-βgal的荧光强度基本保持不变，表明LAN-βgal对pH具有良好的稳定性。LAN-βgal与β-gal在酸性和碱性条件下的检测效果较差，而在中性环境下检测效果较好，尤其是在pH为7.4时。考虑到生物环境中的pH值为7.4，最终在本工作的所有实验中都使用了pH 7.4。
4、β-gal活性的测定
采用荧光法探索LAN-βgal对β-gal的敏感性：在含有10μM LAN-βgal的1％(v/v)二甲基亚砜的磷酸盐缓冲溶液(PBS 10mM，pH 7.4)中，37℃下检测所有光学性质。
在该操作中，分别加入β-gal，控制其中β-gal的浓度为0到1000U/L，反应50min，测定荧光光谱。
结果如图3中(A)所示，在0到1000U/L范围内的β-gal滴定后，以642nm为中心的荧光强度逐渐增加，最终在580nm激发波长下在1000U/L处达到最大值，同时荧光强度惊人地比没有β-gal的LAN-βgal增强了2000倍。如图3中(B)所示，获得了荧光信号和β-gal浓度(0-110U/L)之间令人满意的线性关系。根据DL＝3σ/k计算的检测限低至0.096U/L。上述结果表明，LAN-βgal可以通过荧光法定量准确地检测β-gal。
采用分光光度法进行了浓度滴定实验。
如图3中(C)所示，用β-gal滴定后，以575nm为中心的吸收带逐渐增加，而以415nm为中心的吸收带逐渐减少。如图3中(D)所示，吸光度与β-gal浓度在0-110U/L(r＝0.9991)范围内呈线性关系，表明LAN-βgal可用于定量准确用比色法检测β-gal。
5、传感器的选择性
将LAN-βgal与来自环境和生命系统的一系列潜在干扰物质和常见物质(包括阳离子、阴离子、氨基酸和小分子)，在pH 7.4，37℃条件下，共同孵育50min，测定LAN-βgal的选择性。
结果如图4所示，所有物质几乎都不会干扰LAN-βgal对β-gal的检测，即使潜在干扰物质的浓度高达1mM，这表明LAN-βgal对于β-gal具有高的特异性。
6、传感器的机理
对LAN-βgal进行质谱检测，发现LAN-βgal在m/z 426.1178处出现峰，LAN-OH在m/z264.0652处出现峰。当加入β-gal后，溶液在m/z 264.0656处出现峰，这与LAN-OH的m/z一致。说明反应机理如图5所示，β-gal特异性识别并切断LAN-βgal的D-半乳糖单元，释放LAN-OH，最终实现了对β-gal的特异性识别。
使用分子对接模拟评估LAN-βgal对β-gal的结合亲和力。如图6所示，LAN-βgal与β-gal中的氨基酸(ASP507、LYS551、SER1004、ALA1005和GLU1006)形成六个氢键。LAN-βgal和β-gal的结合能为-8.49kcal/mol。因此，LAN-βgal化学传感器表现出对β-gal的强结合亲和力。
而后基于理论计算来理解和解释LAN-βgal的β-gal识别机制。结果表明识别单元(D-半乳糖残基)的HOMO(-7.12eV)位于激发态LAN-OH的HOMO(-7.44eV)和LUMO(-1.43eV)之间，表明由于分子内PET过程，D-半乳糖残基可以猝灭LAN-OH的荧光。对于LAN-OH，从S1到S0(625.7nm)观察到主要发射，振子强度(f)为1.1193。HOMO和LUMO的分子轨道都位于荧光团上，因此激发时没有电子转移，LAN-OH显示红色荧光。
7、检测人尿液中的β-gal
人尿中LAN-βgal的加标回收实验：先将新鲜人尿离心，收集上清，与0、3、6或9U/Lβ-gal混合，然后加入LAN-βgal(10μM)，测定荧光光谱。结果表明，LAN-βgal测定加标样品中β-gal的回收率为100.4％～105.3％，说明LAN-βgal适用于准确检测尿样中的β-gal。
基于正常人尿液中β-gal的含量(2.51-14.3U/L)，以商业ELISA试剂盒作为对照测试卵巢癌患者的人尿液中的β-gal含量。结果表明，人尿样中β-gal含量分别为24.43、35.84和38.61，与ELISA试剂盒相比，相对误差不超过5％。以上结果验证了LAN-βgal在实际样品中准确检测β-gal的适用性。
8、细胞荧光成像
利用MTT评估LAN-βgal对活细胞的毒性：HepG2细胞(105个/mL)在96孔板中，37℃，5％CO2/95％空气培养箱中培养12h。然后分别加入不同浓度的LAN-βgal(5、10、20、30、50μM))处理24h。24h后，每孔加入MTT溶液20μL；孵育4h后，除去MTT溶液，每孔加入150μL二甲亚砜溶解甲瓒晶体。最后用酶标仪测定490nm下吸光度值，计算细胞存活率。
结果显示当用小于30μM的LAN-βgal处理时，细胞存活率高达85％以上。上述结果说明LAN-βgal的低细胞毒性，证实LAN-βgal可进一步用于细胞内成像。
随后，将LAN-βgal应用于癌细胞(HeLa、HepG2、SKOV3、A2780)中内源性β-gal的荧光成像：将所有细胞首先分别与5μM Hoechst33342(一种核酸染料)孵育5min；a、b、c、e组：用20μM LAN-βgal处理2h；d、f组：先用1mM D-半乳糖处理2h，然后再用20μM LAN-βgal处理2h；使用激光共聚焦显微镜进行成像分析，激发光源为559nm，发射波长收集范围580-680nm。
如图7所示，与LAN-βgal孵育后，HeLa细胞和HepG2细胞均显示出极弱的荧光，而SKOV3细胞和A2780细胞则分别显示出明显的强荧光。此外，连续用D-半乳糖和LAN-βgal处理，SKOV3细胞和A2780细胞均显示出如预期的弱荧光信号。以上结果表明，LAN-βgal可用于细胞内源性β-gal的荧光成像，并能清楚地区分卵巢癌细胞与其他癌细胞。
接下来研究了LAN-βgal是否可以区分卵巢癌细胞和正常卵巢细胞：β-gal在正常卵巢细胞(IOSE80)、卵巢癌细胞(SKOV3和A2780)和两组混合细胞(IOSE80细胞分别与SKOV3细胞和A2780细胞混合)中分别进行荧光成像；a、b、c、d、e组：分别用20μM LAN-βgal处理2h；然后使用激光共聚焦显微镜进行成像分析，激发光源为559nm，发射波长收集范围580-680nm。结果如图8所示，与LAN-βgal孵育后，IOSE80细胞(正常卵巢细胞)呈现出极弱的荧光信号，而SKOV3细胞和A2780细胞则分别呈现出明显的强荧光。随后，分别将IOSE80细胞与SKOV3细胞和A2780细胞共培养。经LAN-βgal处理后，可以从两组混合细胞中清楚地发现，红色通道中的一些细胞没有被LAN-βgal点亮(标记为绿色圆圈)，而另一些则显示出明显的强荧光。以上结果表明β-gal在卵巢癌细胞中过度表达，LAN-βgal可以清楚地区分卵巢癌细胞和正常卵巢细胞。
β-gal也被认为是细胞衰老的原因。接下来进行两组对比实验进行验证：其中(A)表示β-半乳糖在非衰老细胞和衰老细胞中的荧光成像比较；a、c、e组：用20μM LAN-βgal孵育2h；b、d、f组：用1μM MLN4924孵育72h，然后用20μM LAN-βgal孵育2h；然后使用激光共聚焦显微镜进行成像分析，激发光源为559nm，发射波长收集范围580-680nm。(B)对应于(A)的癌细胞的平均荧光值。
结果如图9所示，仅与LAN-βgal孵育2h的a、c和e中的荧光信号非常弱，但在b、d和f中显着增强，用MLN4924(细胞衰老试剂)孵育72h，再用LAN-βgal孵育2h。从以上结果可以很容易地得出结论，β-gal确实与细胞衰老密切相关，并且β-gal在衰老细胞中的含量更高。
9、活体荧光成像
进一步研究LAN-βgal在肿瘤中可视化β-gal的能力。将A2780细胞(1×107)和HepG2细胞(1×107)分别注射到裸鼠背部左右两侧培养20天，成功获得荷瘤小鼠。成像前，将200μM(50μL)LAN-βgal分别原位注射到A2780肿瘤和HepG2肿瘤部位。接下来使用小动物成像系统进行LAN-βgal对β-gal进行体内成像。
结果如图10中(A)所示，A2780肿瘤被LAN-βgal明显点亮，具有显着的荧光信号，与HepG2没有显示荧光信号形成鲜明对比，这与细胞成像实验结果完全一致，LAN-βgal能够特异性识别卵巢细胞而不响应其他癌细胞。
随后，通过尾静脉注射200μM(200μL)LAN-βgal进一步研究了体内成像效果。结果如图10中(B)所示，可以清楚地观察到A2780肿瘤部位被LAN-βgal特异性点亮，而HepG2肿瘤部位也没有显示出荧光信号，这与原位注射的结果完全一致。
此外，解剖另一只通过尾部静脉注射的荷瘤小鼠，取出器官(心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)和两个肿瘤进行荧光成像。如图10中(C)所示，在心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和HepG2肿瘤中没有观察到荧光信号，但在A2780肿瘤中观察到了明显的荧光信号。所有上述结果表明，LAN-βgal可以作为一种有前途的工具，通过有效地靶向β-gal而不受干扰地用于体内卵巢癌肿瘤的可视化。
进一步研究LAN-βgal在腹膜转移肿瘤模型中对卵巢癌肿瘤的可视化能力。在腹腔注射A2780细胞(1×107)20天后成功建立卵巢癌腹膜转移瘤模型。接下来，分别用PBS和50mM(200μL)D-半乳糖预处理2h和200μM(200μL)LAN-βgal再连续处理3h，对两只荷瘤小鼠进行卵巢癌肿瘤成像。
结果如图10中(D)所示，在用PBS(左)预处理的荷瘤小鼠中观察到直径小至<5mm的卵巢癌肿瘤的明显荧光分布，而在用D-半乳糖(右)预处理的荷瘤小鼠中观察到微弱的荧光信号与，进一步证明了LAN-βgal对β-gal识别的特异性。如上所述，LAN-βgal具有在腹膜转移性肿瘤模型中准确靶向卵巢癌肿瘤可视化的能力，这是一种非常有前途的荧光引导诊断工具。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种基于荧光基团LAN-OH制备得到的特异性识别β-半乳糖苷酶的膜透性荧光化学传感器LAN-βgal，其特征在于，所述荧光化学传感器LAN-βgal的结构式如式III所示：
所述荧光基团LAN-OH的结构式如式I所示：
2.权利要求1所述荧光化学传感器LAN-βgal的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将荧光基团LAN-OH和2,3,4,6-四邻乙酰基-α-D-吡喃半乳糖基溴共同溶解在乙腈溶剂中，在Cs2CO3和Na2SO4作用下搅拌24h，纯化后得中间产物；
(2)将步骤(1)所述中间产物溶于甲醇中，在甲醇钠作用下搅拌3h，纯化后得荧光化学传感器LAN-βgal。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤(1)所述纯化的方法为硅胶色谱法，利用甲醇和二氯甲烷的混合物作为流动相，所述甲醇和二氯甲烷的体积比为1:200。
4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤(2)所述纯化的方法为硅胶色谱法，使用甲醇和二氯甲烷的混合物作为流动相，所述甲醇和二氯甲烷的体积比为1:100。
5.权利要求1所述荧光化学传感器LAN-βgal在制备可视化靶向卵巢癌肿瘤工具中的应用。
6.权利要求1所述荧光化学传感器LAN-βgal在制备可视化检测β-半乳糖苷酶活性的试剂盒中的应用。
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| Kotoucek, Milan等.Characterization of color changes of some acid-base indicators.《Acta Universitatis Palackianae Olomucensis, Facultas Rerum Naturalium》.1986,第85卷(第25期),167-179. * |
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