CN106147750A - 一种双光子比率荧光探针及其在检测β-半乳糖苷酶中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种双光子比率荧光探针及其在检测β-半乳糖苷酶中的应用。所述的荧光探针的结构为其中R₁、R₂为H、烷基、芳基或含杂原子的取代基，R₃为烷基、芳基或含杂原子的取代基。本发明在具有较大双光子吸收截面的荧光母体上引入β-半乳糖苷结构作为与β-半乳糖苷酶识别及反应的活性中心，利用反应物与产物的荧光波长差别，实现双光子激发比率检测β-半乳糖苷酶。

Description

一种双光子比率荧光探针及其在检测β-半乳糖苷酶中的应用

技术领域：

本发明涉及荧光探针领域，具体涉及一种双光子比率荧光探针及其在检测β-半乳糖苷酶中的应用。本发明在具有较大双光子吸收截面的荧光母体上引入β-半乳糖苷结构作为与β-半乳糖苷酶识别及反应的活性中心，利用反应物与产物的荧光波长差别，实现双光子激发比率检测β-半乳糖苷酶。

背景技术：

β-半乳糖苷酶是人体中一种重要的酶，它能催化乳糖、神经节苷脂、乳糖基酰基神经酰胺及各种糖蛋白水解生成相应的产物，具有十分重要的生理功能，例如神经节苷脂贮积症与黏多糖贮积症IV型均与β-半乳糖苷酶的缺乏有关。另外，在分子与细胞生物学中，β-半乳糖苷酶还常被用作报告标记以确定外源基因是否成功进入细胞，并能进一步用于指导优化转染条件。然而，长久以来检测手段的缺乏阻碍了人们对β-半乳糖苷酶在生命体系中作用的研究。

荧光探针是有效检测生命体内β-半乳糖苷酶的手段之一。一个具有应用前景的荧光探针应具有作用前后荧光变化明显、对目标分子响应快、选择性好、合成简单等优点。Ching-Hsuan Tung等公开了一种用以检测β-半乳糖苷酶的荧光探针DDAOG(结构见图1a，Ching-Hsuan Tung et al.，Cancer Res,2004,64,1579)，经β-半乳糖苷酶催化水解后荧光增强从而检测β-半乳糖苷酶的存在。但是该探针发射光谱太窄且与激发光谱重叠严重，因而检测灵敏度大打折扣。基于水解前后发生光致电子转移过程的效率不同，YasuteruUrano等以荧光素为荧光母体设计了荧光探针TG-βGal(结构见图1b，Yasuteru Urano et al.,J.AM.CHEM.SOC.2005,127,4888)用于检测β-半乳糖苷酶。但是该荧光探针发射波长偏短，且依然存在发射光谱与激发光谱相隔太近的问题。Tetsuo Nagano等发表了一个以罗丹荧为荧光母体的荧光探针HMDER-βGal(结构见图1c，TetsuoNagano et.al,J.AM.CHEM.SOC.2011,133,12960)，利用水解前后在生理pH(7.2-7.4)下螺环化程度不同导致荧光强度的不同实现检测β-半乳糖苷酶的目的。但是该荧光探针激发光波长偏短，无法消除背景荧光、探针分布及入射光强度对检测结果的影响。因此开发具有更高灵敏度和信噪比的可用于生物体系中β-半乳糖苷酶检测的荧光探针具有重要意义。

发明内容：

本发明就是针对上述问题，提供了一种可用于双光子激发比率检测细胞内β-半乳糖苷酶的荧光探针，此探针可以在生理条件下经β-半乳糖苷酶催化水解，所得产物荧光相对于原探针显著红移，同时探针与水解产物均具有双光子吸收性能，可用红外激光进行双光子激发。

本发明采用如下技术方案：在具有较大双光子吸收截面的荧光母体上引入β-半乳糖苷结构作为与β-半乳糖苷酶识别及反应的活性中心，利用反应物与产物的荧光波长差别，实现双光子激发比率检测β-半乳糖苷酶。所述荧光探针的通式为：

通式I中，R₁、R₂为H、烷基、芳基或含杂原子的取代基，R₃为烷基、芳基或含杂原子的取代基。R₁、R₂、R₃为烷基、芳基时，一般为C₁～C₂₀的烷基、芳基，最佳为C₁～C₁₀的烷基、芳基；R₁、R₂、R₃为杂原子取代基时，为磺酸基、羧基、羟基、卤素、氨基、胺基、烷氧基、氰基或硝基。

上述通式I表示的化合物应用于双光子比率检测β-半乳糖苷酶，在β-半乳糖苷酶作用下生成具有通式II结构的化合物，后者相对于前者在生理pH(7.2-7.4)下会部分脱去质子，更容易发生分子内电荷转移过程，因而荧光光谱发生显著红移，此过程可比率检测β-半乳糖苷酶。

通式II中，R₁、R₂为H、烷基、芳基或含杂原子的取代基，R₃为-OH或-O^-。R₁、R₂为烷基、芳基时，一般为C₁～C₂₀的烷基、芳基，最佳为C₁～C₁₀的烷基、芳基。R₁、R₂为杂原子取代基时，为磺酸基、羧基、羟基、卤素、氨基、胺基、烷氧基、氰基或硝基。

通式I应用于双光子比率检测β-半乳糖苷酶，其特征在于，β-半乳糖苷酶的测定包括以下工序：

(a)使具有通式I结构的化合物与β-半乳糖苷酶反应；

(b)测定由上述工序中的反应引起的荧光变化。

本发明的有益效果：

本发明提供的荧光探针在β-半乳糖苷酶存在下荧光波长发生显著红移，可用于高灵敏性地比率检测β-半乳糖苷酶，同时，这类探针具有双光子吸收性能，可用红外激光进行双光子激发，不仅使发射光与激发光完全分开以消除激发光对检测的影响，而且更容易穿透生物样品，减少背景荧光对检测结果的影响，这对于深入研究β-半乳糖苷酶在生物体内的生理和病理作用具有重要意义。

附图说明：

图1背景技术中所举的已公开的用于检测β-半乳糖苷酶的荧光探针；

图2实施例1制备的荧光探针NI-βGal检测β-半乳糖苷酶的原理示意图；

图3实施例1中合成荧光探针NI-βGal的流程图；

图4实施例2中荧光探针NI-βGal及水解产物NI在不同pH下用445nm光激发时的荧光强度示意图；

图5实施例3中荧光探针NI-βGal在加入β-半乳糖苷酶后的荧光强度随时间变化示意图；

图6实施例4中NI-βGal及水解产物NI的双光子作用光谱示意图；

图7实施例5中荧光探针NI-βGal用于细胞内β-半乳糖苷酶比率检测的双光子共聚焦荧光显微镜照片。

具体实施方式：

实施例用于进一步说明本发明，但本发明不限于实施例。

实施例中所用的主要实验药品来源如下：

2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-α-D-galactopyranosyl bromide(纯度≥98％)与β-半乳糖苷酶(400单位/毫克)均购买自百灵威科技有限公司，甲醇钠(纯度≥50％)购买自国药集团化学试剂有限公司，C6/lacZ7细胞购买自美国模式培养物集存库(American TypeCulture Collection)。

实施例1(探针的合成)：

如图3所示，实施例所采用的探针化合物的结构用代号NI-βGal表示。

NI-βGal Tetraacetate的合成：向100mL三口烧瓶中加入0.9g4-羟基-氮-正丁基-1，8萘酰亚胺，2.1g 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-α-D-galactopyranosylbromide，1.34g碳酸钾，真空/氮气置换3次，加入15mL HPLC纯级乙腈，氮气保护下加热回流4小时，冷却至室温后将反应混合物倒入水中，过滤，水洗滤渣三次，用乙酸乙酯溶解滤渣，真空旋干，所得固体经柱层析纯化得NI-βGal Tetraacetate。

NI-βGal的合成：向50mL烧瓶中加入0.62g NI-βGal Tetraacetate，0.11g甲醇钠，40mL甲醇，室温下搅拌3h，加入事先稀释10倍的37％浓盐酸0.8mL，过滤，将滤液真空旋干，用甲醇重结晶，过滤得固体后再在甲醇中进行二次重结晶得白色薄纸状固体，即为目标产物NI-βGal。

实施例2(NI-βGal在生理pH下应用的可行性)：

pH采用PB(磷酸盐缓冲溶液)控制。测定NI-βGal经β-半乳糖苷酶催化水解产物NI在不同pH下的荧光光谱时，先后将2955μL各种pH下的PB(浓度为0.1M)、45μL浓度为1mM的NI/乙醇溶液加入到1cmⅹ1cmⅹ4cm的比色皿中，使得混匀后探针NI的浓度为15μM，激发光选用445nm，用荧光光谱仪测定550nm处荧光强度。测定NI-βGal的荧光光谱时，除NI-βGal浓度改为3μM外其他测试条件同NI。NI-βGal及NI的荧光强度随pH的变化如图4所示。图4表明在生理pH(7.2-7.4)下，NI-βGal经β-半乳糖苷酶催化水解后的产物NI有很强的荧光，而NI-βGal在此波段几乎没有荧光，因而使得NI-βGal具备在生理pH下比率检测β-半乳糖苷酶的可行性。

实施例3(NI-βGal对β-半乳糖苷酶的比率检测)：

先后将2973μL PB(pH＝7.4，浓度为0.1M)、27μL浓度为333μM的探针溶液加入到1cmⅹ1cmⅹ4cm的比色皿中，使得混匀后NI-βGal的浓度为3μM。加入24μL浓度为250mL的β-半乳糖苷酶溶液(即最终β-半乳糖苷酶的含量为6U)，并立即开始计时，激发光选用400nm，用荧光光谱仪测量工作液在30分钟内的荧光光谱变化如图5所示。图5表明，加入β-半乳糖苷酶后，在440nm处荧光显著降低，与此同时，探针水解产物NI的最大发射波长550nm处荧光显著升高，因而NI-βGal可以实现对β-半乳糖苷酶的比率检测。

实施例4(NI-βGal与NI的双光子吸收性)：

配制100μM Rhodamine 6G/甲醇溶液、50μM NI-βGal/PB溶液及60μM NI/PB溶液，其中Rhodamine 6G/甲醇溶液为参比溶液。将上述三种样品分别取2mL加入到细胞培养皿中，置于双光子共聚焦荧光显微镜下，选用10倍物镜，在720-900nm范围内以10nm为步长，逐渐改变激发光波长，测定上述三种样品的荧光光谱，将数据输入到OriginPro 8.5，处理后得NI-βGal与NI的双光子作用光谱如图6所示。图6表明，激发波长在720-840nm范围内，NI-βGal与NI均具有较为可观的双光子吸收性能，因而可以在此波段选择某一波长为红外激发光波长，应用双光子吸收过程，实现对β-半乳糖苷酶的检测。

实施例5(NI-βGal用于细胞内β-半乳糖苷酶的检测)：

C6、C6/lacZ7细胞按照American Type Culture Collection规定进行培养。用10.0μM NI-βGal孵育C6细胞45分钟，置于双光子共聚焦荧光显微镜下拍照，激发光波长为740nm，细胞DIC通道、蓝光通道、黄光通道、比率通道成像结果分别如图7a、7b、7c、7d所示(图中比例尺表示20μm)。用10.0μM NI-βGal孵育C6/lacZ7细胞(该细胞能够产生β-半乳糖苷酶)45分钟，置于双光子共聚焦荧光显微镜下拍照，细胞DIC通道、蓝光通道、黄光通道、比率通道成像结果分别如图7e、7f、7g、7h所示(图中比例尺表示20μm)。从图中可以看出，经NI-βGal孵育后的正常C6细胞荧光比率值在0.5以下，而能产生β-半乳糖苷酶的C6/lacZ7细胞荧光比率值在2.5甚至3以上，表明本发明所述的荧光探针NI-βGal能够有效地用于双光子激发比率检测生物体系中的β-半乳糖苷酶。

由以上附图和实施例可见，本发明所述荧光探针因其具有的双光子吸收性能和比率荧光特性而能够有效识别体外试管溶液体系及复杂生物体系中的β-半乳糖苷酶。

Claims (4)

1.一种双光子比率荧光探针，其特征在于：所述荧光探针的结构如通式I所示：

通式I中，R₁、R₂为H、烷基、芳基或含杂原子的取代基，R₃为烷基、芳基或含杂原子的取代基。

2.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于：所述的通式I中R₁、R₂、R₃为烷基、芳基时，为C₁～C₂₀的烷基、芳基，优选为C₁～C₁₀的烷基、芳基；

R₁、R₂、R₃为含杂原子取代基时，为磺酸基、羧基、羟基、卤素、氨基、胺基、烷氧基、氰基或硝基。

3.一种权利要求1所述的荧光探针的应用，其特征在于：所述的荧光探针可用于检测β-半乳糖苷酶，具体为，通式I所示的荧光探针在生理条件下经β-半乳糖苷酶催化水解作用后生成具有通式II结构的化合物，从而导致荧光红移，探针与水解产物均具有双光子吸收性能，实现β-半乳糖苷酶的检测；

通式II中，R₁、R₂为H、烷基、芳基或含杂原子的取代基，R₃为-OH或-O^-。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的R₁、R₂为烷基、芳基时，为C₁～C₂₀的烷基、芳基，优选为C₁～C₁₀的烷基、芳基；R₁、R₂为含杂原子取代基时，为磺酸基、羧基、羟基、卤素、氨基、胺基、烷氧基、氰基或硝基。