CN110563650B - 一种硫酸酯酶的比率型双光子荧光探针及其合成方法和应用 - Google Patents

一种硫酸酯酶的比率型双光子荧光探针及其合成方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种硫酸酯酶的比率型双光子荧光探针及其合成方法和应用，所述荧光探针的结构式如下所示：
Figure DDA0002180995430000011
本发明比率型双光子荧光探针以1,8‑萘酰亚胺为双光子荧光基团，以硫酸酯作为酶切位点，构建比率型双光子硫酸酯荧光探针。该探针通过与硫酸酯酶的酶促反应诱导其硫酸酯基团的断裂及离去，分别通过探针及其反应产物的两个不同波长处荧光强度的比值(F564/F451)的变化，来检测硫酸酯酶的存在及其活性大小。该特异性探针为一类比率型的双光子荧光探针，其在活性检测过程不易受生物体背景及杂质的干扰，可用于各种活细胞及亚细胞水平及动物组织中硫酸酯酶活性的定量检测。

Description

一种硫酸酯酶的比率型双光子荧光探针及其合成方法和应用
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，涉及一种硫酸酯酶的比率型双光子荧光探针及其合成方法和应用。
背景技术
硫酸酯酶是一种属于硫酸酯酶家族的水解酶，主要参与芳香基硫酸酯的催化水解过程，可以调节人体和细菌内诸多生物分子的硫酸化水平。这一调节过程同细胞中激素调节、细胞组分降解、信号通路的调控、细菌感染及炎症等有着密切的关联。其中一类硫酸酯酶定位于内质网，由于其能够调节类固醇，这种酶又被称作类固醇硫酸酯酶(Steroidsulfatase，STS)。STS水解释放类固醇前体，影响激素相关的信号通路，因此与常见的激素依赖性肿瘤(乳腺癌，卵巢癌，子宫内膜癌和前列腺癌)的生长和迁移紧密相关。无活性的雌激素硫酸盐只能通过STS介导的脱硫反应转化为活性雌激素，才能与雌激素受体结合来引发一系列促进作用在癌症信号通路中。由于STS在激素性依赖肿瘤组织中具有高活性，因此近年来以STS作为癌症治疗的靶点受到了广泛地关注，关于STS小分子抑制剂治疗激素相关肿瘤的研究已应用于I期临床。但目前因缺乏原位检测的工具难于深入了解STS的生理和病理作用。因此，仍需要开发一种直接有效的方法用于活细胞和组织中STS的原位检测，这在肿瘤早期诊断和治疗等方面具有重要的意义。
近年来，由于具有高时空分辨、高灵敏度、高选择性和非侵入性等优势，荧光分析检测技术已广泛地应用于生物分子标记、酶分析、环境监测、细胞染色和临床检验诊断等各个领域。基于对商业化硫酸酯酶探针：4-甲基伞形酮硫酸盐的修饰，一些新的荧光探针被报道用于体外检测硫酸酯酶[J.S.Rush et al,ChemBioChem,2010,11,2096-2099；C.H.Taiet al,Chem.Commun.,2014,50,6116-6119；K.E.Beatty et al,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2013,110,12911-12916]。但这些探针缺乏比率特征和亚细胞器靶向，因此难以用于活细胞或亚细胞器中硫酸酯酶(如内质网硫酸酯酶STS)的定量检测。
发明内容
针对现有探针缺乏比率特征和亚细胞器靶向，难以用于活细胞或亚细胞器中硫酸酯酶的定量检测的技术问题，本发明的目的是提供一种硫酸酯酶的比率型双光子荧光探针及其合成方法和应用，该比率型探针在具有良好双光子性质的荧光团上引入硫酸酯酶的位点，发射强蓝色荧光，再与硫酸酯酶反应脱硫酸盐后具有黄色荧光，并通过反应前后发射波长的不同，实现比率型检测，可避免实验因素干扰。利用该探针可对活细胞中内质网硫酸酯酶中的活性与分布进行定量评价，以及利用双光子优势对肿瘤深层组织比率成像，特别适合生物分析以及医学研究。
本发明提供这种硫酸酯酶的比率型双光子荧光探针，其结构式如(1)所示：
Figure BDA0002180995410000021
该荧光探针命名为：2-(2-((4-甲基苯基)磺酰氨基)乙基)-1,3-二氧代-2,3-二氢-1H-苯并[de]异喹啉-6-基硫酸氢盐，具有识别前后易观察、高选择性、灵敏度高的特点。
本发明提供所述硫酸酯酶的比率型双光子荧光探针的合成方法，包括以下步骤：
(1)将4-溴-1，8-萘二甲酸酐与N-(2-氨基乙基)-4-甲基苯磺酰胺在乙醇中加热回流8～12h，冷却抽滤干燥得到化合物1；
(2)将化合物1与N-羟基琥珀酰胺，碳酸钾溶于二甲基亚砜中加热回流4～6h，冷却倒入冰水中，用盐酸调pH到5～8析出固体抽滤烘干得到化合物2；
(3)将化合物2与三乙胺，二甲氨基吡啶溶于干燥的二氯甲烷与乙腈的混合溶液，冰浴条件下加入三氯乙基硫酰氯，室温反应12～16小时，旋干溶剂进行柱层析分离，得到白色化合物3；
(4)将化合物3与锌粉，甲酸铵溶于二氯甲烷与甲醇混合溶液，室温反应1～6h，旋干溶剂进行柱层析分离，得到所述比率型双光子荧光探针，命名为探针ERNathS。
所述步骤(1)中，4-溴-1，8-萘二甲酸酐、N-(2-氨基乙基)-4-甲基苯磺酰胺的摩尔比1:(1～3)；4-溴-1，8-萘二甲酸酐与乙醇的摩尔体积比为1:(5～7)mmol/mL。
所述步骤(2)中，化合物1与N-羟基琥珀酰胺的摩尔比1:(1～3)；化合物1与二甲基亚砜的摩尔体积比为1:(2～5)mmol/mL。
所述步骤(3)中，化合物2与三乙胺的摩尔比1:(1～3)；化合物2与二甲氨基吡啶的摩尔比1:(0.5～2)；化合物2与二氯甲烷的摩尔体积比为1:(2～5)mmol/mL；化合物2与乙腈的摩尔体积比为1:(1～3)mmol/mL。
所述步骤(4)中，化合物3与锌粉的摩尔比1:(2～6)；化合物3与甲酸铵的摩尔比1:(0.5～3)；化合物3与二氯甲烷的摩尔体积比为1:(1～5)mmol/mL；化合物3与甲醇的摩尔体积比为1:(2～6)mmol/mL。
另外，发明人分别通过核磁共振氢谱、碳谱、质谱、紫外光谱等手段进行表征，表明所述比率型双光子荧光探针ERNathS成功合成。
本发明还提供所述比率型双光子荧光探针在检测硫酸酯酶中的应用。
所述比率型双光子荧光探针在检测硫酸酯酶中的应用，采用上述探针ERNathS作为硫酸酯酶的特异性底物，探针本身为强蓝色荧光，通过与硫酸酯酶的酶促反应诱导其硫酸酯基团的离去后发出黄色荧光，通过定量检测单位时间内的反应产物的荧光强度与探针荧光强度的比值(F564/F451)来定量测定不同生物体系中硫酸酯酶的活性。
所述检测硫酸酯酶的具体方法如下：
体系中以1，8-萘酰亚胺类硫酸化衍生物作为比率双光子探针底物，在Tri-HCl缓冲溶液中，反应温度为20℃至45℃之间，孵育pH环境介于3～10之间，反应时间为0～120min，确保以上底物相应的脱硫酸酯产物达到定量限，可采用紫外分光度计和荧光检测器同时实现底物及产物的快速、灵敏检测；荧光检测条件：激发波长为405nm，最大发射波长分别为451nm和564nm。
进一步，反应温度优选为37℃；孵育pH环境优选为5。
ERNathS探针的合成过程如下所示：
Figure BDA0002180995410000041
本发明所述的ERNathS探针，在没有加入硫酸酯酶时，所述探针的最大吸收为353nm和荧光发射波长为451nm，当加入硫酸酯酶，353nm处的吸收减弱，451nm处的荧光减弱，最大吸收和最大发射均红移至450nm和564nm。
作为高特异性的硫酸酯酶的双光子比率型荧光探针，该化合物可以用来检测各种活细胞内硫酸酯酶的活性，借助其内质网靶向可以快速定位于内质网，并用于检测内质网硫酸酯酶的活性。
根据其不同类型细胞中的内生硫酸酯酶的活性大小不仅可以区分正常细胞和肿瘤细胞，还可以区分不同类型的肿瘤细胞，尤其是激素依赖性肿瘤。
该特异性探针为一类比率型的双光子荧光探针，其在活性检测过程不易受生物体背景及杂质的干扰，可用于各种活细胞及亚细胞水平及动物组织中硫酸酯酶活性的定量检测。该探针底物及脱硫酸酯代谢产物的荧光比率检测方法，还可用于硫酸酯酶抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。
本发明比率型双光子荧光探针以1,8-萘酰亚胺为双光子荧光基团，以硫酸酯作为酶切位点，通过处在近红外区域(700～1000nm)、穿透性强的双光子激发，利用探针反应前后由蓝色荧光变为黄色荧光的区别，构建比率型双光子硫酸酯荧光探针。该探针通过与硫酸酯酶的酶促反应诱导其硫酸酯基团的断裂及离去，分别通过探针及其反应产物的两个不同波长处荧光强度的比值(F564/F451)的变化，来检测硫酸酯酶的存在及其活性大小。
本发明比率型双光子荧光探针，利用双光子激发可以对肿瘤深层组织中的硫酸酯酶进行成像。
双光子荧光探针是一种利用近红外激光脉冲进行成像的技术，其相比单光子探针具有许多优点：更深的组织穿透深度、更高的空间分辨率、更高的信倍比以及更小的光损伤。因次，引入双光子的优势、克服已有硫酸酯酶探针的不足，进而开发一种双光子比率型内质网硫酸酯酶的荧光探针用于活细胞以及组织中的检测和监控，具有重大的意义。
与现有技术相比，具有的有益技术效果为：
1)廉价易得：可通过简单化学合成获得，合成原料廉价易得，合成工艺简单易行，成本低，易于推广；
2)双通道比率检测：探针本身为强蓝色荧光，与硫酸酯酶反应后变为黄色荧光，通过荧光颜色变化可以定性检测，以及两个最大发射波长荧光强度的比值(F564/F451)的变化可以定量检测；
3)高特异性与高灵敏度：探针可被硫酸酯酶特异性水解成黄色荧光的羟基萘酰胺荧光团，通过标准曲线进行定量检测硫酸酯酶的检测下限为0.002U/mL；
4)活细胞及组织检测：探针可用于检测活细胞内的硫酸酯酶活性，以及利用双光子显微成像技术进行肿瘤组织深层组织比率成像以及三维成像。
附图说明
图1是化合物3的1H NMR图谱；
图2是化合物3的13C NMR图谱；
图3是荧光探针ERNathS的1H NMR图谱；
图4是荧光探针ERNathS的13C NMR图谱；
图5是荧光探针ERNathS的高分辨质谱图；
图6是实施例3中(a)荧光探针ERNathS对硫酸酯酶响应的紫外可见光谱图；
图7是实施例3中(a)荧光探针ERNathS对不同浓度硫酸酯酶响应的荧光光谱图；(b)实例中荧光探针ERNathS的荧光强度比值(F564/F451)与不同浓度硫酸酯酶之间的关系图；
图8是实例中荧光探针ERNathS选择性测试，柱状图即探针的荧光强度比值(F564/F451)与不同蛋白、酶、生物分子等之间的关系图(1.空白样，2.硫酸酯酶,3.碱性磷酸酯酶,4.三磷酸腺苷双磷酸酶,5.谷氨酰转肽酶,6.亮氨酸氨基肽酶,7.基质金属蛋白酶-2,8.脂肪裂解酶,9.酪氨酸酶,10.β-半乳糖糖苷酶,11.还原型谷胱甘肽,12.半胱氨酸,13.硫化氢,14.维生素C,15.牛血清蛋白,16.亚铁离子,17.过氧化氢,18.次氯酸钠,19.超氧化钾,20.磷酸钾)；
图9是实例中荧光探针ERNathS与商业化亚细胞器定位试剂的细胞共定位图像；
图10是实例中荧光探针ERNathS检测各种活细胞中硫酸酯酶的细胞成像图；
图11是实例中荧光探针ERNathS检测肿瘤组织中硫酸酯酶的双光子成像图。
具体实施方式
实施例1荧光探针ERNathS的合成
荧光探针ERNathS的合成路线如下，具体包括以下步骤：
(1)将2.9mmol 4-溴-1，8-萘二甲酸酐和3.2mmol N-(2-氨基乙基)-4-甲基苯磺酰胺溶于20mL乙醇中，将反应加热至80℃搅拌8h；反应完毕后将其冷却至室温，倒入冰水中析出固体，得化合物1，产率31.8％；
(2)将1.0mmol化合物1、2.0mmol N-羟基琥珀酰胺和3.0mmol碳酸钾溶于15mL二甲基亚砜中加热回流6h，冷却到室温倒入冰水中，用盐酸调pH到5析出固体抽滤烘干得到化合物2，产率77.1％；
(3)取0.5mmol化合物2、1.0mmol三乙胺和0.6mmol二甲氨基吡啶置于圆底烧瓶中，加入11mL干燥的二氯甲烷和乙腈的混合溶液(8:3,v/v)至反应物完全溶解，冰浴条件下加入1mmol三氯乙基硫酰氯，室温反应12小时，旋干溶剂进行柱层析分离，得到白色化合物3，产率37.2％；
对本实施例制备的化合物3进行核磁共振分析(图1～2)，其结果如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.51(d,J＝7.2Hz,1H),8.47(d,J＝8.1Hz,1H),8.41(d,J＝8.4Hz,1H),7.80(dd,J＝15.9,7.9Hz,2H),7.47(d,J＝7.6Hz,2H),6.76(d,J＝7.6Hz,2H),4.91(s,2H),4.20(s,2H),3.38(d,J＝4.6Hz,2H),1.96(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.0,163.4,150.2,143.0,137.0,132.5,131.7,129.4,129.3,128.4,127.8,126.8,124.5,122.4,121.6,118.1,92.1,81.0,42.1,39.4,21.2；
(4)取0.16mmol化合物3与1.0mmol锌粉，0.3mmol甲酸铵溶于12ml二氯甲烷与甲醇混合溶液(2:10,v/v)，室温反应3h，旋干溶剂进行柱层析分离，得到探针ERNathS，产率57.9％。
Figure BDA0002180995410000071
对本实施例制备的探针ERNathS进行核磁共振和质谱分析(图3～5)，其结果如下：1HNMR(400MHz,MeOD)δ8.64(d,J＝8.3Hz,1H),8.51(s,1H),8.46(s,1H),7.91(d,J＝8.0Hz,1H),7.81(t,J＝7.8Hz,1H),7.48(d,J＝7.5Hz,2H),6.84(d,J＝7.5Hz,2H),4.21(s,2H),3.35(s,2H),2.02(s,3H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ164.5,163.9,154.4,142.9,137.6,132.1,131.2,129.2,129.0,126.4,126.2,125.2,122.0,117.6,116.0,100.0,40.8,39.2,20.0.HRMS(m/z):Cacld for[M-H-]:489.0432,found:489.0433。
实施例2荧光探针ERNathS对不同浓度硫酸酯酶的响应
将实施例1中得到的荧光探针ERNathS配制成二甲基甲砜(DMSO)母液，浓度为1mM。
分别取出10μL上述母液加入到两个含2mL Tris-HCl缓冲溶液中，稀释至最终探针浓度为5μM，一个作为空白样，另外一个加入0.8U/mL硫酸酯酶，在37℃的摇床震荡60分钟后，用紫外分光光度计测定其最大吸收波长，其紫外可见光谱图见图6。
分别取出10μL上述母液加入到含2mL Tris-HCl缓冲溶液中，稀释至最终探针浓度为5μM，后分别加入不同浓度的硫酸酯酶(0～0.8U/mL)，在37℃的摇床震荡60分钟后，以405nm为激发波长，分别测定这些样品中的荧光强度，得到这些样品的发射光谱图，见图7(a)，根据图7(a)在564nm和451nm两处荧光强度比值(F564/F451)的变化可作出对应的拟合曲线，结果见图7(b)。因此确定探针ERNathS的检测限为0.002U/mL。
通过核磁共振氢谱、碳谱、质谱、紫外光谱等手段进行表征，表明所述比率型双光子荧光探针ERNathS成功合成。
实施例3荧光探针ERNathS对硫酸酯酶选择性测试
配置最终探针浓度为5μM的20个相同样品，分别向该体系中加入不同的干扰物质、硫酸酯酶，在37℃的摇床震荡60分钟后，以405nm为激发波长分别进行荧光扫描得到这些样品中的荧光强度，并以564nm和451nm两处荧光强度比值的变化作出对应的柱状图，结果如图8所示，其中，1：空白；2：硫酸酯酶(1U/mL)；3：碱性磷酸酯酶(10U/mL)；4：三磷酸腺苷双磷酸酶(2.5U/mL)；5：谷氨酰转肽酶(1U/L)；6：亮氨酸氨基肽酶(1U/L)；7：基质金属蛋白酶-2(1μg/mL)；8：脂肪裂解酶(5mg/mL)；9：酪氨酸酶(100U/L)；10：β-半乳糖糖苷酶(100U/L)；11：GSH(1mM)；12：Cys(200μM)；13：H2S(200μM)；14：Vc(1mM)；15：BSA(100μg/mL)；16：Fe2+(100μM)；17：H2O2(100μM)；18：HClO(100μM)；19：KO2(100μM)；20：K3PO4(200μM)。根据图8可知，除了加入硫酸酯酶，其荧光比值(F564/F451)明显增加外，其他干扰物质对其荧光强度比值(F564/F451)几乎没有影响。说明探针ERNathS能够抗多种干扰物质，对硫酸酯酶有高的选择性和特异性。
实施例4荧光探针ERNathS与商业化亚细胞器定位试剂的细胞共定位图像
将实施例2中获得的探针ERNathS母液，染色时用培养基稀释成最终浓度为20μM的染色液。用共聚焦皿接种肝癌HepG-2活细胞在染色液中37℃孵育2小时，用DPBS洗三次，然后用荧光显微镜进行成像，激发波长为405nm，发射收集波段为500～550nm。同时用商业化亚细胞器定位试剂(内质网红ER-tracker Red、溶酶体红Lyso-tracker Red和线粒体深红Mito-tracker Deep Red)进行定位实验，其中内质网红和溶酶体红的激发波长为561nm，发射波段为570～620nm，线粒体深红的激发波长为640nm，发射波段为663～738nm。得到共定位图像如图9所示，其中第一行：探针与内质网红ER-tracker Red的共定位图及其叠加图，第二行：探针与溶酶体红Lyso-tracker Red的共定位图及其叠加图，第三行：探针与线粒体深红Mito-tracker Deep Red的共定位图及其叠加图。通过三种商业化共定位试剂的比较，可以发现探针主要定位于内质网中。
实施例5荧光探针ERNathS检测各种活细胞中硫酸酯酶的细胞成像图
将实施例2中获得的探针ERNathS母液，染色时用培养基稀释成最终浓度为20μM的染色液。用共聚焦皿接种各种活细胞(HEK-293、HL-7702、HepG-2、HeLa与MCF-7)在染色液中37℃孵育2小时，用DPBS洗三次，然后用荧光显微镜进行成像得到共聚焦显微成像如图10所示，激发波长为405nm，发射收集波段：蓝色通道425～475nm与绿色通道500～550nm。其中，三种癌细胞(HepG-2、HeLa与MCF-7)中绿色通道与蓝色通道荧光比值(F绿/F蓝)高于两种正常细胞(HEK-293和HL-7702)中的荧光比值(F绿/F蓝)，说明肿瘤细胞中硫酸酯酶的活性高于正常细胞。且激素依赖性肿瘤细胞(HeLa与MCF-7)中的荧光比值(F绿/F蓝)更高，说明硫酸酯酶的活性在激素依赖性肿瘤中更高。
实施例6荧光探针ERNathS检测肿瘤组织中硫酸酯酶的双光子比率成像图
将实施例2中获得的探针ERNathS母液，染色时用DPBS稀释成最终浓度为40μM的染色液。将肿瘤组织与正常乳腺组织在染色液中37℃孵育4小时，用DPBS洗三次，将组织置于载玻片上，然后用荧光显微镜进行单/双光子成像，单/双光子激发波长分别为405nm与820nm，发射收集波段：蓝色通道425～475nm与绿色通道500～550nm。组织单/双光子比率成像图如图11所示，其中肿瘤组织中绿色通道与蓝色通道荧光比值(F绿/F蓝)明显高于正常乳腺组织。由此可知，肿瘤组织中硫酸酯酶的活性远远高于正常组织。

Claims (5)

1.一种硫酸酯酶的比率型双光子荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构式如(1)所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
(1)；
硫酸酯酶的比率型双光子荧光探针的合成方法，包括以下步骤：
(1) 将4-溴-1，8-萘二甲酸酐与N-（2-氨基乙基）-4-甲基苯磺酰胺在乙醇中加热回流8~12h，冷却抽滤干燥得到化合物1；
(2) 将化合物1与N-羟基琥珀酰胺，碳酸钾溶于二甲基亚砜中加热回流4~6 h，冷却倒入冰水中，用盐酸调pH到5~8析出固体抽滤烘干得到化合物2；
(3) 将化合物2与三乙胺，二甲氨基吡啶溶于干燥的二氯甲烷与乙腈的混合溶液，冰浴条件下加入三氯乙基硫酰氯，室温反应12~16小时，旋干溶剂进行柱层析分离，得到白色化合物3；
(4) 将化合物3与锌粉，甲酸铵溶于二氯甲烷与甲醇混合溶液，室温反应1~6 h，旋干溶剂进行柱层析分离，得到所述比率型双光子荧光探针，命名为探针ERNathS；
比率型双光子荧光探针在作为检测硫酸酯酶的试剂中的应用：采用上述探针ERNathS作为硫酸酯酶的特异性底物，探针本身为强蓝色荧光，通过与硫酸酯酶的酶促反应诱导其硫酸酯基团的离去后发出黄色荧光，通过定量检测单位时间内的反应产物的荧光强度与探针荧光强度的比值F564/F451来定量测定不同生物体系中硫酸酯酶的活性；
所述步骤(3)中，化合物2与三乙胺的摩尔比1:(1~3)；化合物2与二甲氨基吡啶的摩尔比1:(0.5~2)；化合物2与二氯甲烷的摩尔体积比为1:(2~5) mmol/mL；化合物2与乙腈的摩尔体积比为1:(1~3)mmol/mL；
所述步骤(4)中，化合物3与锌粉的摩尔比1:(2~6)；化合物3与甲酸铵的摩尔比1:(0.5~3)；化合物3与二氯甲烷的摩尔体积比为1:(1~5)mmol/mL；化合物3与甲醇的摩尔体积比为1:(2~6)mmol/mL。
2.根据权利要求1所述硫酸酯酶的比率型双光子荧光探针，其特征在于，所述步骤(1)中，4-溴-1，8-萘二甲酸酐、N-（2-氨基乙基）-4-甲基苯磺酰胺的摩尔比1:(1~3)；4-溴-1，8-萘二甲酸酐与乙醇的摩尔体积比为1:(5~7) mmol/mL。
3.根据权利要求1所述硫酸酯酶的比率型双光子荧光探针，其特征在于，所述步骤(2)中，化合物1与N-羟基琥珀酰胺的摩尔比1:(1~3)；化合物1与二甲基亚砜的摩尔体积比为1:(2~5) mmol/mL。
4.根据权利要求1所述比率型双光子荧光探针，其特征在于，所述检测硫酸酯酶的具体方法如下：
体系中以1，8-萘酰亚胺类硫酸化衍生物作为比率双光子探针底物，在Tri-HCl缓冲溶液中，反应温度为20℃至45℃之间，孵育pH环境介于3~10之间，反应时间为0~120min，确保以上底物相应的脱硫酸酯产物达到定量限，可采用紫外分光度计和荧光检测器同时实现底物及产物的快速、灵敏检测；荧光检测条件：激发波长为405nm，最大发射波长分别为451nm和564nm。
5.根据权利要求4所述比率型双光子荧光探针，其特征在于，反应温度为37℃；孵育pH环境为5。
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