CN109096189A

CN109096189A - 一种检测细胞内质网内pH的双光子荧光探针

Info

Publication number: CN109096189A
Application number: CN201811071868.5A
Authority: CN
Inventors: 林伟英; 张楠; 董宝利; 孔秀琪; 宋文辉
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2018-09-14
Filing date: 2018-09-14
Publication date: 2018-12-28

Abstract

本发明提供了一种检测细胞内质网内pH的荧光探针：。可以4‑溴‑1,8‑萘二甲酸酐、BOC‑乙二胺、三氟乙酸和对甲苯磺酰氯为原料通过三步反应获得。该荧光探针可用于检测溶液或细胞内质网中的pH。该荧光探针可经化学合成获得，合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，易于推广，并且具有高特异性，不受其他组分的干扰，具有双光子性质，可用于组织内活细胞内质网内pH的实时测定，具有广阔的应用前景。

Description

一种检测细胞内质网内pH的双光子荧光探针

技术领域

本发明涉及用于细胞内pH检测的新型荧光探针及其应用，属于小分子荧光材料领域。

背景技术

内质网作为细胞重要的细胞器，是细胞质中由膜组成的一系列片状的囊腔和管状的腔，由粗而内质网和滑而内质网两部分组成.内质网在细胞中将细胞核、细胞质、细胞膜有机的连接成一个整体，负责物质在细胞中的转运，同时也是蛋白质、脂类、糖类等的合成基地.膜分泌性蛋白、磷脂、氨基多糖、胆固醇、钙信号等的代谢均和细胞内质网的功能直接相关.此外，病毒感染，氨基酸剥夺，蛋白表达异常，氧化剂、还原剂、钙调节异常等应激都可导致未折叠蛋白质在内质网中积累，进而诱发神经退行性疾病、心脏病、糖尿病和癌症等疾病.因此，实时跟踪内质网构型变化，以及其中各类活性生物小分子水平，对于掌握内质网复杂生理功能过程及与内质网相关疾病的病理机制具有重要意义

内质网（ER）作为必需的细胞器在钙稳态，脂质合成和折叠以及膜和分泌蛋白的成熟中起重要作用。当ER的正常功能受到各种条件的干扰时，例如葡萄糖毒性，ER中的Ca^{2 +}失衡，缺血和缺氧，自由基，蛋白质合成增加，ER应激将出现。最近，许多研究表明ER应激在许多代谢疾病的发展中起着至关重要的作用，包括肥胖，胰岛素抵抗和糖尿病。例如，ER应激的标志物在糖尿病动物中升高，并且操纵ER应激反应的组分的治疗策略将改善糖尿病环境中的正常功能。这表明靶向ER应激可能是预防或减弱相应疾病发展的可行治疗选择。细胞内pH在许多细胞事件中起重要作用，例如细胞生长，细胞凋亡，离子转运，自噬，酶活性，体内平衡和其他细胞过程。

特别地，对于ER作为重要参数的pH，对于调节该细胞器的正常生理功能是重要的。大量研究表明，ER应激可引发自噬，导致ER酸化。作为动态平衡的扰动，ER酸化过程与ER应激诱发疾病的进展密切相关。因此，由于ER中 pH酸化的生理意义，实时观察ER内部pH变化具有重要意义。应用于阐明细胞代谢，并深入了解相关疾病的发病机制。荧光成像正在成为监测生命系统中各种生物活性分子的有前途和有力手段，这得益于其显着的优势，如操作简便，灵敏度高，时间-空间高分辨率。具体而言，双光子荧光显微成像是一种利用近红外激光脉冲的迷人方法，其具有许多优点，包括更深的组织穿透，更高的空间分辨率和最小的背景发射，以及更长的观察时间。因此，近年来已经报道了许多具有用于各种生物活性分子的单光子或双光子特性的荧光探针，这促进了细胞生物学和治疗成像的进展。其中，已经提出了许多pH响应传感器，它们在一定程度上揭示了pH的化学生物学。并且，本文提出适用于ER中pH值成像的荧光探针，实时可视化ER酸化的荧光探针，具有更加重大的意义。

发明内容

针对现有技术中存在的定位内质网荧光探针少、合成步骤繁琐、成本高等问题，本发明提供一种细胞内质网靶向的检测pH的双光子荧光探针，特异性高、不受干扰。

本发明的另一目的是提供上述双光子荧光探针的合成方法，原料廉价易得，制备成本低。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种检测细胞内质网内pH的荧光探针，其结构式如式（I）所示：

式（I）。

一种上述荧光探针的合成方法，采用以下步骤：

（1）4-溴-1,8-萘二甲酸酐与BOC-乙二胺在乙醇中加热回流，产物分离纯化后得化合物1：；

（2）化合物1与三氟乙酸在二氯甲烷中室温反应，产物分离纯化得化合物2：；

（3）化合物2与对甲基苯磺酰氯在二氯甲烷中低温反应，产物分离纯化后得化合物3：；

（4）化合物3与1-（2-羟乙基）哌嗪在乙二醇甲醚加热回流反应，产物分离纯化得荧光探针。

步骤（1）中，所述4-溴-1,8-萘二甲酸酐与BOC-乙二胺的摩尔比为1-1.2:1。

步骤（1）中，加热温度为80℃；反应时间为4-6小时。

步骤（1）中，所述分离纯化步骤为抽滤后的固体以乙酸乙酯：石油醚=3:1（v/v）为淋洗液过硅胶层析柱。

步骤（2）中，所述化合物1与三氟乙酸的摩尔比为1:1-1.5。

步骤（2）中，所述反应时间为2-5小时。

步骤（2）中，所述分离纯化步骤为干燥得粗产物，再以甲醇：二氯甲烷=15:1（v/v）为淋洗液过硅胶层析柱。

步骤（3）中，所述化合物1与对甲基苯磺酰氯的摩尔比为1:1-1.2。

步骤（3）中，反应温度为-5-0℃；反应时间为2-6小时。

步骤（3）中，所述分离纯化步骤为干燥得粗产物，再以二氯甲烷：甲醇=100:1（v/v）过硅胶柱层析。

步骤（4）中，化合物3与1-（2-羟乙基）哌嗪在乙二醇甲醚的摩尔比为1:1-1.2。

步骤（4）中，反应温度为110℃，反应时间为3-6小时。

步骤（4）中，所述分离纯化步骤为干燥得粗产物，再以二氯甲烷：甲醇=10:1（v/v）过硅胶层析柱。

一种上述双光子荧光探针在检测溶液、细胞或组织内内质网pH的应用。优选的，上述应用中，单光子荧光成像中激发波长为405nm，发射波段为500-550nm；双光子荧光成像中激发波长为800nm，发射波段为500-550nm。

本发明具有以下优点：

本发明所述的荧光探针可经化学合成获得，合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，易于推广。本发明所述的荧光探针具有高特异性，在进行相应pH检测过程中不受其他组分的干扰，可用于活细胞内质网pH的实时测定，具有广阔的应用前景。由于该荧光探针具有双光子性质，可用于组织内活细胞内质网pH的实时测定。本发明所述的荧光探针灵敏度高，具有良好的荧光发射光谱特性，通过绘制标准曲线进行细胞内质网pH的测定，可以实现对细胞内质网pH快速准确检测的目的。

附图说明

图1是荧光探针的¹H NMR图谱；

图2是荧光探针在不同pH条件下的荧光光谱；

图3是荧光探针与不同pH的线性关系数据；

图4是荧光探针对不同物质的选择性；

图5是荧光探针与内质网ER-traker探针的细胞共定位图像；

图6是荧光探针检测组织活细胞中pH的生物成像图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 荧光探针的合成

（1）4-溴-1,8-萘二甲酸酐（1 mmol）溶于25 mL乙醇中回流加热至全部溶解后，将BOC-乙二胺（1 mmol）溶于2 mL乙醇后滴加至反应液中，继续回流搅拌4小时，抽滤得白色固体，以乙酸乙酯：石油醚=3:1（v/v）为淋洗液进行柱层析，得化合物1；

（2）将上述化合物1全部溶于20 mL二氯甲烷中，滴加2.5 mL的三氟乙酸，室温下搅拌3小时。旋干后，以甲醇：二氯甲烷=15:1（v/v）为淋洗液进行柱层析，得到化合物2；

（3）将化合物2（0.5 mmol）溶于15 mL二氯甲烷中，冰盐浴下（-5℃）将对甲基苯磺酰氯（0.5 mmol）的二氯甲烷溶液滴加到上述溶液中，搅拌3小时后旋干，以二氯甲烷：甲醇=100:1（v/v）为淋洗液进行柱层析，得到化合物3；

（4）将化合物3（0.5 mmol）与1-(2-羟乙基)哌嗪（0.5 mmol）溶于5 mL乙二醇甲醚中，110℃回流5小时后旋干，以二氯甲烷：甲醇=10:1（v/v）为淋洗液进行柱层析得到荧光探针；其¹H NMR图谱见图1。各步骤反应式如下：

。

实施例2 荧光探针对不同pH环境的响应

将实施例1中获得的探针，用乙醇溶解后，以水稀释成10 μM探针缓冲溶液（含10%乙醇）。取13份上述探针溶液，分别加入相同体积pH缓冲溶液，使pH依次为4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10.0。然后进行荧光扫描（λ_Ex=400 nm）；计算各体系中相对荧光强度。探针对不同pH的响应如图2所示：其最大荧光强度峰值为531nm。以531 nm处相对应光强度（I_531nm）为纵坐标，以pH为横坐标，得图3，可知I_531nm处的荧光强度与pH呈线性相关，随着pH的增大荧光强度减弱。

实施例3 荧光探针的选择性

将实施例1中获得的探针，用乙醇溶解后，以水稀释成10 μM探针缓冲溶液（含10%乙醇）。分别取15份上述探针溶液5 mL，分别加入，然后分别向该体系中依次加入水或不同干扰物质PBS缓冲液，然后进行荧光扫描（λ_Ex= 400 nm）；计算各体系中相对荧光强度；以531nm处相对应光强度（I_531nm）为纵坐标，得到探针对不同物质的响应柱状图，如图4所示：其中，1: 水; 2: Na⁺(5mM); 3: K⁺(5mM); 4: Ca²⁺(500μM); 5: Mg²⁺(500μM); 6: Al³⁺(200μM);7: Cu²⁺(200μM); 8: Fe³⁺(200μM); 9: Zn²⁺(500μM); 10: GSH(5mM); 11: Cys(5mM); 12:HCys(5mM); 13: H₂O₂(5mM); 14: NaClO (200μM); 15: pH 4.0。根据图4可知，除了加入较低pH溶液其他物质不能增强探针的相对荧光强度，说明探针能够抗多种干扰物质，专一性识别pH。

实施例4 荧光探针与内质网商业探针的共定位

将实施例1中获得的探针用DMSO配成10 mM母液，染色时用培养基稀释成终浓度为10 μM的染色液。将接种好的HepG2细胞在染色液中37 ºC孵育30 min，用PBS洗3次，贴壁生长的细胞置于载玻片上；然后用荧光显微镜进行荧光成像。然后用荧光显微镜进行荧光成像（激发波长为400 nm，发射波段为500-550 nm）。同时用商用内质网探针ER-traker进行共定位实验（激发波长为561 nm，发射波段为570-620 nm），由共聚焦荧光显微镜下图像如图5所示，其中：a图为探针与商业探针的叠加图像，b图为在400 nm激发后在500和550nm之间收集的探针的荧光图像，c图为在561nm激发后在570和620nm之间收集的，商业染料的荧光图像，d图为ER-tracker和探针强度的相关图，e图为ER-tracker和探针共孵育细胞上的线性区域（白色箭头）的强度分布。由此可知，荧光探针能够定位于内质网内。

实施例5 荧光探针对不同pH组织细胞的生物成像

将小鼠活组织分别放置于条件为37℃ pH7.4与4.0的缓冲溶液中，分别加入终浓度为10μM的实施例1中的探针，同时培养1h，然后用荧光显微镜进行双光子荧光成像，激发波长为800nm，发射波段为500-550nm，不同深度组织细胞的荧光图像如图6所示。其中，当pH值为4.0（深度100μm）时探针在活组织中的荧光强度明显强于pH值为7.0（深度80μm）时的荧光强度。由此可知，荧光探针能够穿透组织细胞进行成像；且正常pH的细胞荧光较弱，酸化的细胞能够发出强烈的荧光。

Claims

1.一种检测细胞内质网内pH的荧光探针，其结构式如式（I）所示：

式（I）。

2.一种如权利要求1所述的荧光探针的合成方法，其特征在于，采用以下步骤：

3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）中，所述4-溴-1,8-萘二甲酸酐与BOC-乙二胺的摩尔比为1-1.2:1；化合物1与三氟乙酸的摩尔比为1:1-1.5；化合物1与对甲基苯磺酰氯的摩尔比为1:1-1.2；化合物3与1-（2-羟乙基）哌嗪在乙二醇甲醚的摩尔比为1:1-1.2。

4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）中，加热温度为80℃，反应时间为4-6小时；步骤（2）中，反应时间为2-5小时；步骤（3）中，反应温度为-5-0℃，反应时间为2-6小时；步骤（4）中，反应温度为110℃，反应时间为3-6小时。

5.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）中，所述分离纯化步骤为抽滤后的固体以乙酸乙酯：石油醚=3:1（v/v）为淋洗液过硅胶层析柱；

步骤（2）中，所述分离纯化步骤为干燥得粗产物，再以甲醇：二氯甲烷=15:1（v/v）为淋洗液过硅胶层析柱；

步骤（3）中，所述分离纯化步骤为干燥得粗产物，再以二氯甲烷：甲醇=100:1（v/v）过硅胶柱层析；

6.一种如权利要求1所述的荧光探针在检测溶液、细胞或组织内内质网pH的应用。