CN104710976A - 次氯酸根离子荧光探针、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种次氯酸根离子荧光探针、制备方法及其应用,其可用于环境中次氯酸根离子含量的检测以及次氯酸根在生物样本中分布的荧光显影及含量检测。本发明荧光探针仅次氯酸根有荧光响应,对其他各种活性氧物种(ROS)包括H2O2、NO·、·O2 -、ONOOˉ、ROO·、1O2、·OH均无反应,具有很好的选择性和特异性;该探针制备工艺简单易行,易于规模化生产。本发明的探针结构如式Ⅰ所示;其制备方法为:将荧光素单醛和肼基吡啶在乙醇溶液中反应即生成次氯酸根离子荧光探针。
Description
技术领域
本发明涉及一种次氯酸根离子荧光探针、制备方法及其应用。
背景技术
次氯酸根作为活性氧物种的一种,在免疫抵抗微生物感染和炎症过程中发挥着极其重要的作用。在生物体中,H2O2和氯离子在髓过氧化物酶的催化作用下产生次氯酸根,这是内因性次氯酸根的主要来源。保持适当的次氯酸根浓度对许多细胞功能至关重要,然而研究结果表明,一旦细胞内的次氯酸根水平不能保持在正常的生理水平范围内,将可能会导致多种疾病,例如动脉粥样硬化、关节炎、类风湿性关节炎甚至肿瘤。与其它类型探针相比,荧光探针拥有与生俱来的多项优势,它灵敏度高,特异性好,便于操作而且响应迅速,在生物医学领域不但可以用于体外分析还可以用于活体的影像学研究。最近几年来,能特异性检测HClO/ClOˉ的小分子荧光探针被大量报道。然而,其中许多探针水溶性差、灵敏度低、pH对其检测效果影响大,还有一些探针生物毒性大、细胞膜渗透能力差,这些缺陷很大程度上影响了探针的应用。因此,开发出能克服这些缺陷的新的荧光探针非常有必要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是:克服现有技术存在的问题,提供一种次氯酸根离子荧光探针,该荧光探针生物兼容性好、选择性高、灵敏度高,可方便检测次氯酸根离子,本发明还提供该荧光探针的制备方法以及该探针在次氯酸根检测中的应用
本发明的技术构思如下:该基于荧光素的衍生物探针可选择性与次氯酸根反应并产生强烈荧光,且在0-50μM次氯酸根离子浓度范围内所产生的荧光强度与离子浓度线性相关。本发明首次制备联氨吡啶基荧光素衍生物并首次将其用于次氯酸根离子的选择性检测,从而解决上述技术问题。
本发明解决其技术问题的技术方案如下:
本发明的次氯酸根离子荧光探针,其为如式Ⅰ所示的联氨吡啶基荧光素衍生物:
本发明上述次氯酸根离子荧光探针的制备方法,其包括以下步骤:
第一步:将荧光素、氯仿、15-冠-5在甲醇溶液中反应,接着加入氢氧化钠溶液,反应后得到如式Ⅱ结构的荧光素单醛,
第二步:将荧光素单醛和肼基吡啶在乙醇溶液中反应生成的联氨吡啶基荧光素衍生物即为次氯酸根离子荧光探针。
本发明的上述次氯酸根离子荧光探针的制备方法,其进一步的技术方案是第一步的具体过程为:将荧光素溶于甲醇,加入摩尔比为2:1-10:1的氯仿,然后加入摩尔比为0.1%-10%15-冠-5,接着缓慢滴加10%-70%氢氧化钠溶液,反应结束后冷却,用浓度为10mol/L硫酸酸化,产生沉淀,过滤,收集沉淀,真空干燥,将产品用硅胶层析法分离,得到的浅黄色固体即为荧光素单醛。优选地,其反应条件为:于40-60℃温度下反应,持续搅拌回流5小时或以上;第一步中在层析柱纯化过程中采用体积比200:3的二氯甲烷:甲醇为洗脱液。
本发明的上述次氯酸根离子荧光探针的制备方法,其进一步的技术方案还可以是第二步的具体过程为:在30min内,向荧光素单醛的乙醇溶液中滴加溶有肼基吡啶的甲醇溶液进行反应,其中荧光素单醛和肼基吡啶的摩尔比为1:0.5-1:10。优选地,溶解肼基吡啶的甲醇应尽可能少量,可选择范围为不大于乙醇用量的1/8;其反应条件为:于室温下反应,持续搅拌12小时或以上。优选地,第二步反应后进行纯化:产品为沉淀,在反应溶剂中析出,收集产品烘干得粗品,然后用正戊烷洗涤即得次氯酸根离子荧光探针。
本发明上述次氯酸根离子荧光探针在次氯酸根离子含量检测、生物样本中次氯酸根的荧光显影中的应用。可用于环境中金离子含量的检测,生物样本中次氯酸根荧光显影及含量检测。
本发明的有益效果如下:
1)本发明荧光探针在pH=7.4的PBS缓冲溶液中呈粉红色且无荧光,与次氯酸根离子反应后显示黄色并且发出强烈的绿色荧光。
2)采用本发明荧光探针后,检测灵敏度高,对次氯酸根的检测限可达到10-9M。
3)本发明荧光探针仅与次氯酸根发生荧光反应,对其它活性氧物种(ROS)包括H2O2、NO·、·O2 -、ONOOˉ、ROO·、1O2、·OH均无反应,具有很好的选择性和特异性。此外,检测性能能耐受较大的pH变化范围并且具有适宜的荧光发射波长(521nm)。
4)本发明荧光探针可用于细胞中外源性和内源性ClOˉ的影像学研究。
5)本发明荧光探针制备工艺简单易行,易于规模化生产。
附图说明
图1为本发明实施例2荧光探针与各种活性氧反应的荧光发射光谱。
图2为本发明实施例3荧光探针与次氯酸钠反应的荧光增量图。
图3为本发明实施例3荧光探针对次氯酸钠浓度的荧光强度线性关系图。
图4为本发明实施例4荧光探针对外源性次氯酸根的细胞荧光图。
图4中a、b、c为探针培养MCF-7细胞;d、e、f为先用次氯酸钠处理再用探针培养的细胞。
图5为本发明实施例4荧光探针对内源性次氯酸根的细胞荧光图。
图5中a、b、c为探针培养RAW 264.7细胞;d、e、f为先用LPS处理再用探针培养的RAW 264.7细胞。
图6为本发明实施例1制备的荧光探针的1H-NMR图
图7为本发明实施例1制备的荧光探针的高分辨质谱图
具体实施方式
下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。
实施例1制备次氯酸根荧光探针
一、荧光素单醛的制备
将4g荧光素,10mL氯仿,6mL甲醇,0.06g 15-冠-5放入烧瓶内反应,接着加入20g 50%氢氧化钠溶液,在55℃下搅拌5小时,冷却后,用浓度为10mol/L硫酸酸化,产生沉淀,过滤,收集沉淀,真空干燥,将产品用硅胶层析法分离,使用二氯甲烷/甲醇(200:3)作为洗脱剂,得到浅黄色荧光素单醛固体。
二、探针的制备
在30min内,向200mg荧光素单醛的40mL乙醇溶液中缓慢滴加5mL溶有59mg肼基吡啶的甲醇溶液。室温下反应12小时,反应结束后产物以沉淀形式析出。过滤收集产物,在真空干燥箱烘干得粗产品。用正戊烷洗涤即可得砖红色固体137mg,即为次氯酸根探针纯品。(1H-NMR图和高分辨质谱图见图6、图7)。所得荧光探针纯品实测分子量为451。
本实施例工艺路线:
实施例2制得次氯酸根荧光探针与各种活性氧反应的光谱性质
称取4.5mg实施例1制得次氯酸根荧光探针,配成浓度为1mM的10mL乙腈溶液,作为母液。
荧光光谱测试:将30μL上述母液加入到一定量的10mM PBS缓冲溶液(pH 7.4)中,然后分别加入各种离子活性氧物种(ROS)。(H2O2:200μM;NO·:200μM NOC-12;·O2 -:0.1unit xanthine oxidase and 200μM xanthine;ONOOˉ:1mM KNO2+1mM H2O2;ROO·:200μM2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐;1O2:1mM硫酸亚铁铵+1mM叔丁基过氧化氢;·OH:1mM硫酸亚铁铵+200μM H2O2;NaClO:100μM)荧光探针终浓度为10μM。在494nm激发光波长下即时测试其荧光发射光谱。激发与发射的狭缝宽度为1.5/1.5nm。所得结果如图1所示。
以上结果表明:
(1)实施例1制得荧光探针本身在溶液呈粉红色中无荧光,但随次氯酸钠的加入,该探针在494nm处产生吸收,并在523nm处产生绿色荧光。
(2)实施例1制得荧光探针对次氯酸根具有高度的选择性和特异性,并且在上述条件下,能够从H2O2,NO·,·O2 -,ONOOˉ,ROO·,1O2, ·OH等常见活性氧物种中区分出次氯酸根。
实施例3制得次氯酸根荧光探针与次氯酸根反应产物的光谱性质
将30μL实施例2中的母液加入到一定量的10mM PBS缓冲溶液(pH 7.4)中,然后加入不同当量的次氯酸钠溶液,使荧光探针的终浓度为10μM,次氯酸根离子终浓度分别为0μM、5μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM。离子加入后,即时测量其荧光发射光谱。荧光发射光谱测定时以494nm激发;激发与发射的狭缝宽度为1.5/1.5nm。所得荧光增量图见图2。
该实验结果表明,反应后的荧光强度随次氯酸钠浓度的增加而增加;反应后荧光强度与0-50μM范围内的次氯酸钠浓度呈线性关系,可以用于次氯酸根离子含量的定量分析检测,以521nm处的荧光强度与0-50μM范围内的次氯酸钠浓度线性关系曲线见图3。
实施例4制得次氯酸根荧光探针对细胞外源性次氯酸根的影像学研究
用实施例1制得荧光探针培养人乳腺癌细胞(MCF-7)进行本例研究,细胞培养分为两组。第一组:用10μM探针培养MCF-7细胞2小时;第二组:先用100μM次氯酸钠培养MCF-7细胞1小时,然后用用10μM探针培养1小时。试验结束后使用Olympus FV1000荧光显微镜观察两组细胞显影效果,结果见图4。
实验结果表明,用次氯酸钠处理过的MCF-7细胞中出现绿色荧光,而只用探针培养的MCF-7细胞则没有此现象。因此,实施例1制得荧光探针能很好地对细胞外源性次氯酸根进行检测。
实施例5制得次氯酸根荧光探针对细胞内源性次氯酸根的影像学研究
用实施例1制得荧光探针培养老鼠巨噬细胞(RAW 264.7)进行本例研究,细胞培养分为两组。第一组:用10μM探针培养RAW 264.7细胞24小时;第二组:先用2μg/mL脂多糖(LPS)培养RAW 264.7细胞24小时,然后用用10μM探针培养1小时。试验结束后使用Olympus FV1000荧光显微镜观察两组细胞显影效果,结果见图5。
实验结果表明,用LPS处理过的RAW 264.7细胞中出现绿色荧光,而只用探针培养的RAW 264.7细胞则没有此现象。因此,实施例1制得荧光探针能很好地对细胞内源性次氯酸根进行检测。
除上述实施例外,本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案,均落在本发明要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种次氯酸根离子荧光探针,其特征在于所述的探针为如式Ⅰ所示的联氨吡啶基荧光素衍生物:
2.一种如权利要求1所述次氯酸根离子荧光探针的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
第一步:将荧光素、氯仿、15-冠-5在甲醇溶液中反应,接着加入氢氧化钠溶液,反应后得到如式Ⅱ结构的荧光素单醛,
第二步:将荧光素单醛和肼基吡啶在乙醇溶液中反应生成的联氨吡啶基荧光素衍生物即为次氯酸根离子荧光探针。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于第一步的具体过程为:将荧光素溶于甲醇,加入摩尔比为2:1-10:1的氯仿,然后加入摩尔比为0.1%-10%15-冠-5,接着缓慢滴加10%-70%氢氧化钠溶液,反应结束后冷却,用浓度为10mol/L硫酸酸化,产生沉淀,过滤,收集沉淀,真空干燥,将产品用硅胶层析法分离,得到的浅黄色固体即为荧光素单醛。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于反应条件为:于40-60℃温度下反应,持续搅拌回流5小时或以上。
5.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于第一步中在层析柱纯化过程中采用体积比200:3的二氯甲烷:甲醇为洗脱液。
6.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于第二步的具体过程为:在30min内,向荧光素单醛的乙醇溶液中滴加溶有肼基吡啶的甲醇溶液进行反应,其中荧光素单醛和肼基吡啶的摩尔比为1:0.5-1:10。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于所述的甲醇用量不超过乙醇用量的1/8。
8.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于所述的反应条件为:于室温下反应,持续搅拌12小时或以上。
9.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于第二步反应后进行纯化:产品为沉淀,在反应溶剂中析出,收集产品烘干得粗品,然后用正戊烷洗涤即得次氯酸根离子荧光探针。
10.一种如权利要求1所述次氯酸根离子荧光探针在次氯酸根离子含量检测、生物样本中次氯酸根的荧光显影中的应用。
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