CN112666134A - 一种连续检测肼和次氯酸根的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种连续检测肼和次氯酸根的检测方法，包括以下步骤：用含醛基的荧光素化合物溶液检测肼，得到含有中间体A的溶液B；用所述溶液B检测次氯酸根。含醛基的荧光素化合物溶液发射很强的绿色荧光，当与待测物肼反应后，得到含有中间体A的溶液B，中间体A中由于碳氮双键(C＝N)的异构化引起分子内非辐射跃迁过程增强，因此溶液B几乎无荧光；再将溶液B用来检测次氯酸根，利用次氯酸根的氧化性，将中间体A中的C＝N键打断，氧化成醛类化合物，溶液的绿色荧光得以恢复。因此，本发明提供的检测方法可依次实现对有害物质肼和次氯酸根的检测，更加高效，且成本较低。
Description
技术领域
本发明涉及荧光探针技术领域，特别涉及一种连续检测肼和次氯酸根的检测方法。
背景技术
环境污染的监测及其防治已成为全球性关注的热点之一。肼(N2H4)是一种重要的工业化学品，被广泛地应用于医药、农药、纺织染料、感光材料、乳化剂、腐蚀抑制剂等材料的制备。然而，它也是一种高毒性水溶生化试剂，可通过口鼻呼吸和皮肤渗透等途径对人体肝脏、呼吸系统和神经系统造成损伤，并具有致癌、致畸、致突变的“三致效应”。世界卫生组织和美国环境保护局(EPA)规定肼的阈限值为0.11mol/L。由于N2H4在生理和病理过程中的多重作用，近年来肼的高效检测已受到人们的高度关注。
另一方面，次氯酸(HClO)是一种活性氧簇，在日常生活和防御外来病原体对宿主的入侵方面都起着重要的作用。它是一种强氧化剂，因此可以用作漂白剂、氧化剂、除臭剂和消毒剂。然而，生物体内过量的次氯酸会损害宿主自身的组织，引发一系列的疾病，例如肾病、动脉硬化症和关节炎等。
近年来，荧光技术作为一种新兴的检测手段，具有灵敏度高、响应速度快、检出限低等特点，被广泛应用于生物化学、细胞生物学和分析化学等相关领域，颇受人们的青睐。但目前只有检测肼的肼荧光探针，或只能检测次氯酸根的次氯酸根荧光探针，检测对象单一，从而使荧光检测的操作麻烦，成本较高。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种连续检测肼和次氯酸根的检测方法，旨在解决现有荧光探针的检测对象单一的问题。
为实现上述目的，本发明提出一种连续检测肼和次氯酸根的检测方法，包括以下步骤：
用含醛基的荧光素化合物溶液检测肼，得到含有中间体A的溶液B；
用所述溶液B检测次氯酸根。
可选地，所述含醛基的荧光素化合物包括如结构式(I)所示的结构：
可选地，所述用含醛基的荧光素化合物溶液检测肼，得到含有中间体A的溶液B的步骤之前，还包括以下步骤：
将荧光素在40～60℃溶解于甲醇中，再依次加入氢氧化钾溶液和三氯甲烷，在催化剂的作用下反应，反应完成后调节pH至7～8，将析出的沉淀过滤，得到粗产品；
将所述粗产品通过硅胶柱层析纯化，得到含醛基的荧光素化合物。
可选地，所述催化剂包括18-冠-6。
可选地，所述用含醛基的荧光素化合物溶液检测肼，得到含有中间体A的溶液B的步骤之前，还包括：
将含醛基的荧光素化合物用有机溶剂配制成第一溶液，再将所述第一溶液用缓冲液稀释，得到含醛基的荧光素化合物溶液。
可选地，所述有机溶剂包括二甲基亚砜、乙腈、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺和丙酮中的任意一种。
可选地，所述缓冲液包括HEPES缓冲液。
可选地，所述含醛基的荧光素化合物溶液中，所述HEPES缓冲液与有机溶剂的体积比为(5～95)：5。
可选地，所述HEPES缓冲液的pH值为6～10。
本发明提供的连续检测肼和次氯酸根的检测方法，含醛基的荧光素化合物溶液发射很强的绿色荧光，当与待测物肼反应后，得到含有中间体A的溶液B，中间体A中由于碳氮双键(C＝N)的异构化引起分子内非辐射跃迁过程增强，因此溶液B几乎无荧光；再将溶液B用来检测次氯酸根，利用次氯酸根的氧化性，将中间体A中的C＝N键打断，氧化成醛类化合物，溶液的绿色荧光得以恢复。因此，本发明提供的检测方法可依次实现对有害物质肼和次氯酸根的检测，更加高效，且成本较低。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明提供的含醛基的荧光素化合物溶液对肼的荧光滴定图；
图2为本发明提供的含醛基的荧光素化合物溶液在525nm处的荧光强度与肼浓度的线性关系；
图3为本发明提供的含醛基的荧光素化合物溶液对常见干扰物水溶液以及肼的识别响应图；
图4为本发明提供的溶液B对次氯酸根的荧光滴定图；
图5为本发明提供的溶液B在525nm处的荧光强度与次氯酸根的线性关系；
图6为本发明提供的溶液B对常见干扰物水溶液以及次氯酸根的识别响应图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
近年来，荧光技术作为一种新兴的检测手段，具有灵敏度高、响应速度快、检出限低等特点，被广泛应用于生物化学、细胞生物学和分析化学等相关领域，颇受人们的青睐。但目前只有检测肼的肼荧光探针，或只能检测次氯酸根的次氯酸根荧光探针，检测对象单一，从而使荧光检测的操作麻烦，成本较高。
鉴于此，本发明提出一种连续检测肼和次氯酸根的检测方法，旨在解决现有荧光探针的检测对象单一的问题。其中，所述连续检测肼和次氯酸根的检测方法包括以下步骤：
步骤S10、用含醛基的荧光素化合物溶液检测肼，得到含有中间体A的溶液B。
本发明不限制所述含醛基的荧光素化合物的具体结构，可为含有两个醛基的荧光素化合物，在本实施例中，所述含醛基的荧光素化合物为如结构式(I)所示的结构(即含有一个醛基)：
为了便于描述，以下将结构式(I)所示的化合物简称为F1。
其中，步骤S10之前，还包括：
S11、将含醛基的荧光素化合物用有机溶剂配制成第一溶液，再将所述第一溶液用缓冲液稀释，得到含醛基的荧光素化合物溶液。
在本实施例中，所述有机溶剂包括二甲基亚砜(DMSO)、乙腈、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺和丙酮中的任意一种。本发明不限制所述缓冲液的具体种类，只要可以维持含醛基的荧光素化合物溶液的pH值的恒定即可。在本实施例中，所述缓冲液为HEPES缓冲液。
需要说明的是，本发明不限制所述含醛基的荧光素化合物溶液的具体浓度，其需要结合待检测的肼的浓度而定。较优地，在所述含醛基的荧光素化合物溶液中，所述HEPES缓冲液与有机溶剂的体积比为(5～95)：5。进一步地，为了使HEPES缓冲液对检测结果的影响较小，所述HEPES缓冲液的pH值为6～10。
此外，所述含醛基的荧光素化合物可以由市面购买所得，也可以为自己制得，在本实施例中，自行制备的制备方法为：
步骤A1、将荧光素在40～60℃溶解于甲醇中，再依次加入氢氧化钾溶液和三氯甲烷，在催化剂的作用下反应，反应完成后调节pH至7～8，将析出的沉淀过滤，得到粗产品；
其中，所述催化剂包括18-冠-6(18-crown-6)。此外，所述甲醇的缩写为MeOH，下文简称MeOH。其反应式如下：
步骤A2、将所述粗产品通过硅胶柱层析纯化，得到含醛基的荧光素化合物。
所述硅胶柱层析纯化为常规纯化步骤，在此不做赘述。
本发明提供的结构式(I)所示的结构的制备方法，制备和分离过程简易，产率较高，且具有低毒性、良好的水溶性和生物相容性。
步骤S20、用所述溶液B检测次氯酸根。
本发明提供的连续检测肼和次氯酸根的检测方法，其反应为如下所示：
化合物F1溶液发射很强的绿色荧光，当与待测物肼反应后，得到含有中间体A的溶液B，中间体A中由于碳氮双键(C＝N)的异构化引起分子内非辐射跃迁过程增强，因此溶液B几乎无荧光；再将溶液B用来检测次氯酸根，利用次氯酸根的氧化性，将中间体A中的C＝N键打断，氧化成醛类化合物，溶液在500～650nm波长范围内的绿色荧光得以恢复。
因此，本发明提供的检测方法可依次实现对有害物质肼和次氯酸根的检测，更加高效，且成本较低；化合物F1中邻位的酚羟基活化了醛基，使得醛基与肼的加成反应更快速，有利于实现对肼的实时检测。此外，所述荧光探针选择性高，对肼和次氯酸根均具有高度专一性。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1化合物F1的制备
(1)将荧光素(2.5g，7.75mmol)在40～60℃溶解于甲醇中，再依次加入氢氧化钾溶液(2.5g KOH+2.5mL H2O)和三氯甲烷(1.5mL)，以18-冠-6作为催化剂，在55℃下反应6小时，反应完毕后，调节pH至7～8，有沉淀析出，将析出的沉淀过滤，得到粗产品；
(2)将所述粗产品通过硅胶柱层析纯化，得到红色固体(1.49g，53.2％)，即F1，化合物结构表征结果为：
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ＝6.68-6.70(m,3H,ArH),6.95(s,1H,ArH),7.03-7.06(d,1H,ArH),7.33-7.35(d,1H,ArH),7.73-7.78(m,2H,ArH),8.00-8.02(d,1H,ArH),9.47(s,1H,-OH),10.72(s,1H,-CHO),12.19(s,1H,-OH)。13C NMR(75MHz,DMSO-d6):δ＝170.3,161.2,159.5,153.9,152.5,149.7,146.8,137.0,131.9,130.1,129.0,127.1,125.4,124.1,113.8,113.0,111.2,109.9,106.2,103.7,83.8ppm.MS(ESI),m/z[M+H]+:359.0,calcd,359.1。
实施例2对肼的定性检测
(1)配制浓度为10mM、pH为7.4的HEPES缓冲液；配制化合物F1的DMSO溶液，得到浓度为1×10-4mol/L的第一溶液。取1mL上述第一溶液置于10mL比色管中，用HEPES缓冲溶液定容，得到浓度为1×10-5mol/L的含醛基的荧光素化合物溶液(即含醛基的荧光素化合物溶液中，HEPES与DMSO的体积比45：5)。
(2)用荧光分光光度计测量含醛基的荧光素化合物溶液的荧光光谱。
(3)将待测溶液加入含醛基的荧光素化合物溶液中，用荧光分光光度计测量其发射光谱。
实施例3对肼的定性检测
(1)配制浓度为10mM、pH为6的HEPES缓冲液；配制化合物F1的DMSO溶液，得到浓度为2×10-4mol/L的第一溶液。取1mL上述第一溶液置于20mL管中，用HEPES缓冲溶液定容，得到浓度为1×10-5mol/L的含醛基的荧光素化合物溶液(即含醛基的荧光素化合物溶液中，HEPES与DMSO的体积比95：5)。
(2)用荧光分光光度计测量含醛基的荧光素化合物溶液的荧光光谱。
(3)将待测溶液加入含醛基的荧光素化合物溶液中，用荧光分光光度计测量其发射光谱。
实施例4对肼的定性检测
(1)配制浓度为10mM、pH为10的HEPES缓冲液；配制化合物F1的DMSO溶液，得到浓度为2×10-5mol/L的第一溶液。取1mL上述第一溶液置于2mL管中，用HEPES缓冲溶液定容，得到浓度为1×10-5mol/L的含醛基的荧光素化合物溶液(即含醛基的荧光素化合物溶液中，HEPES与DMSO的体积比5：5)。
(2)用荧光分光光度计测量含醛基的荧光素化合物溶液的荧光光谱。
(3)将待测溶液加入含醛基的荧光素化合物溶液中，用荧光分光光度计测量其发射光谱。
实施例5对次氯酸根的定性检测
(1)与实施例2的(1)的步骤相同。
(2)取含醛基的荧光素化合物溶液10mL，并加入40μL浓度为3.0×10-3mol/L的N2H4水溶液，得到含有中间体A的溶液B。
(3)用荧光分光光度计测量溶液B的荧光光谱。
(4)将待测溶液加入溶液B中，用荧光分光光度计测量其发射光谱。
(一)对肼的定量分析与选择性检测
1、对肼的定量检测
配制含醛基的荧光素化合物溶液(配制方式与实施例2相同，在此不做赘述)；将1.25mL质量分数为78％的市售水合肼溶液置于10mL比色管中，用去离子水定容，得到浓度为3.0×10-3mol/L的N2H4水溶液；取3mL上述配制的含醛基的荧光素化合物溶液置于石英比色皿中，在室温条件下，激发波长为450nm，用荧光分光光度计测试其发射光谱，然后在该含醛基的荧光素化合物溶液中依次加入体积(单位：μL)为0、0.5、0.5、0.5、0.5、1.0、1.0、1.0、1.0、2.0和3.0的上述配制的N2H4水溶液(对总体积的影响忽略不计)，在相同条件下连续测试荧光光谱，其结果如图1所示，在525nm处从上到下的滴定曲线依次表示体系中N2H4浓度(单位：10-6mol/L)为0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0和11.0时体系的荧光光谱；然后以525nm处的荧光强度为纵坐标，以N2H4浓度为横坐标，绘制标准曲线，其结果如图2所示。如此，根据标准曲线，即可计算出待测溶液中的肼含量。
从图1可以看出，随着N2H4浓度的增大，位于525nm处的荧光发射光谱逐渐减弱，并且，当体系中N2H4浓度仅为5×10-7mol/L时，荧光发射强度便降低了近10％；当N2H4浓度为1.1×10-5mol/L时，荧光发射强度达到最小值。
从图2可以看出，荧光强度与N2H4浓度呈现出良好的线性关系(R2＝0.9910)，表明本发明所述化合物F1可以实现对N2H4的准确定量分析。
进一步地，根据公式LOD＝3σ/k(其中，σ代表测量十次空白样品发射强度值的标准偏差，k代表散点图2中拟合直线的斜率)得出，对N2H4的检出限低达9.0×10-8mol/L。因此，本发明提供的检测方法可实现对N2H4的高灵敏度检测。
2、对肼的选择性检测
配制含醛基的荧光素化合物溶液；分别配制MgSO4、Zn(NO3)2·6H2O、Ni(NO3)2·6H2O、Ba(NO3)2、Al(NO3)3·9H2O、CdSO4·8H2O、Na2SO3、Na2S2O3·5H2O、KClO3、NaF、NaCl、KBr、KI、NaOAc·3H2O、NaHCO3、尿素、正丁胺、乙二胺、二异丁胺的去离子水溶液，即干扰物水溶液，浓度均为1×10-2mol/L；取3mL上述配制的含醛基的荧光素化合物溶液置于石英比色皿中，在室温条件下，激发波长为450nm，用荧光分光光度计测试其发射光谱，然后，在该含醛基的荧光素化合物溶液中分别加入15μL上述配制的竞争物水溶液(对总体积的影响忽略不计)，在相同条件下分别测试其荧光光谱，其结果如图3所示，图3中纵坐标表示525nm处的荧光强度的变化，横坐标表示不同干扰物，1-20分别代表Mg2+、Zn2+、Ni2+、Ba2+、Al3+、Cd2+、SO3 2-、S2O3 2-、ClO3 -、F-、Cl-、Br-、I-、AcO-、HCO3 -、尿素、正丁胺、乙二胺、二异丁胺和N2H4、其中N2H4浓度为1.1×10-5mol/L，其他干扰物浓度均为5×10-5mol/L。
从图3可以看出，本发明提供的检测方法中，对其他常见干扰物的荧光光谱响应远远小于对N2H4的响应，因此，本发明提供的连续检测肼和次氯酸根的检测方法的选择性高，对肼具有高度专一性。
(二)对次氯酸根的定量分析与选择性检测
1、对次氯酸根的定量检测
配制含醛基的荧光素化合物溶液；取10mL含醛基的荧光素化合物溶液，并加入40μL浓度为3.0×10-3mol/L的N2H4水溶液，得到含有中间体A的溶液B；用去离子水配制浓度为3.0×10-3mol/L的NaClO水溶液；取3mL上述溶液B置于石英比色皿中，在室温条件下，激发波长为450nm，用荧光分光光度计测试其发射光谱。然后，在该溶液中依次加入体积(单位：μL)为0、0.2、0.2、0.2、0.2、0.2、0.2、0.2、0.2、0.2、0.2、0.5、0.5、0.5、0.5、1.0、1.0、2.0和2.0的上述配制的NaClO水溶液(对总体积的影响忽略不计)，在相同条件下连续测试荧光光谱。其结果如图4所示，在525nm处从下到上的滴定曲线依次表示体系中NaClO浓度(单位：10- 6mol/L)为0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、8.0和10.0时体系的荧光光谱；然后，以525nm处的荧光强度为纵坐标，以NaClO浓度为横坐标，绘制标准曲线，其结果如图5所示。如此，根据标准曲线，即可计算出待测溶液中的次氯酸根含量。
从图4可以看出，随着NaClO浓度的增大，位于525nm处的荧光发射光谱逐渐增强。并且，当NaClO浓度为1.0×10-5mol/L时，荧光发射强度增大了近120倍。因此，本发明提供的检测方法可以实现对NaClO的高灵敏度检测。
从图5可以看出，荧光强度与NaClO浓度呈现出良好的线性关系(R2＝0.9960)，模拟得到的线性方程为y＝14.9640x-3.6502(y表示525nm处的荧光强度，x表示NaClO的浓度，单位为10-6mol/L)，表明本发明提供的检测的方法可实现次氯酸根的准确定量分析。
2、对次氯酸根的选择性检测
配制含有中间体A的溶液B；分别配制NaOAc·3H2O、NaNO2、NaNO3、KClO3、NaF、NaClO4、NaHCO3、K3PO4·3H2O、NaCl、NaIO3、K2HPO4·3H2O、KBr、NaHSO3、NaHSO4、KI、Na2S2O3·5H2O、KSCN、H2O2和NaClO的去离子水溶液，即干扰物水溶液，浓度均为1×10-2mol/L；取3mL上述配制的溶液B置于石英比色皿中，在室温条件下，激发波长为450nm，用荧光分光光度计测试其发射光谱；然后在该溶液B中分别加入15μL上述干扰物水溶液(对总体积的影响忽略不计)，在相同条件下分别测试其荧光光谱，其结果如图6所示，图6中，纵坐标表示525nm的荧光强度，横坐标1-19分别表示AcO-、NO2 -、NO3 -、ClO3 -、F-、ClO4 -、HCO3 -、PO4 3-、Cl-、IO3 -、HPO4 2-、Br-、HSO3 -、HSO4 -、I-、S2O3 2-、SCN-、H2O2、ClO-，其中ClO-浓度为1.2×10-5mol/L，其他干扰物浓度均为5×10-5mol/L。
从图6可以看出，本发明提供的检测方法中，对其他常见干扰物的荧光光谱响应远远小于对ClO-的响应，因此，本发明提供的连续检测肼和次氯酸根的检测方法的选择性高，对次氯酸根具有高度专一性。
综上所述，本发明提供的连续检测肼和次氯酸根的检测方法可依次对肼和次氯酸根进行准确的定性和定量检测，节约成本，且灵敏度和选择性高，对肼和次氯酸根具有高度专一性，实用性强。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (9)
1.一种连续检测肼和次氯酸根的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
用含醛基的荧光素化合物溶液检测肼，得到含有中间体A的溶液B；
用所述溶液B检测次氯酸根。
2.如权利要求1所述的连续检测肼和次氯酸根的检测方法，其特征在于，所述含醛基的荧光素化合物包括如结构式(I)所示的结构：
3.如权利要求2所述的连续检测肼和次氯酸根的检测方法，其特征在于，所述用含醛基的荧光素化合物溶液检测肼，得到含有中间体A的溶液B的步骤之前，还包括以下步骤：
将荧光素在40～60℃溶解于甲醇中，再依次加入氢氧化钾溶液和三氯甲烷，在催化剂的作用下反应，反应完成后调节pH至7～8，将析出的沉淀过滤，得到粗产品；
将所述粗产品通过硅胶柱层析纯化，得到含醛基的荧光素化合物。
4.如权利要求3所述的连续检测肼和次氯酸根的检测方法，其特征在于，所述催化剂包括18-冠-6。
5.如权利要求1所述的连续检测肼和次氯酸根的检测方法，其特征在于，所述用含醛基的荧光素化合物溶液检测肼，得到含有中间体A的溶液B的步骤之前，还包括：
将含醛基的荧光素化合物用有机溶剂配制成第一溶液，再将所述第一溶液用缓冲液稀释，得到含醛基的荧光素化合物溶液。
6.如权利要求5所述的连续检测肼和次氯酸根的检测方法，其特征在于，所述有机溶剂包括二甲基亚砜、乙腈、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺和丙酮中的任意一种。
7.如权利要求5所述的连续检测肼和次氯酸根的检测方法，其特征在于，所述缓冲液包括HEPES缓冲液。
8.如权利要求7所述的连续检测肼和次氯酸根的检测方法，其特征在于，所述含醛基的荧光素化合物溶液中，所述HEPES缓冲液与有机溶剂的体积比为(5～95)：5。
9.如权利要求7所述的连续检测肼和次氯酸根的检测方法，其特征在于，所述HEPES缓冲液的pH值为6～10。
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