CN105439948A - 定量检测亚硝酸盐和亚硝化硫醇的小分子荧光探针 - Google Patents

Abstract

本发明涉及定量检测亚硝酸盐和亚硝化硫醇的小分子荧光探针，所述探针具有下式I的结构，其中R₁是-COOH、-C(O)O-C1-C4烷基、-SO₃H、-SO₂NH₂或CN；和R₂是H、C1-C4烷基-NH₂或C1-C4烷基。本发明还涉及含有所述探针的检测组合物，检测试剂盒，检测样品中的亚硝酸盐和/或亚硝化硫醇的方法，以及所述探针或检测组合物在检测样品中的亚硝酸盐和/或亚硝化硫醇中的应用。

Description

定量检测亚硝酸盐和亚硝化硫醇的小分子荧光探针

技术领域

本发明涉及亚硝酸盐和亚硝化硫醇的定量检测，具体涉及用于定量检测亚硝酸盐和亚硝化硫醇的小分子荧光探针。

背景技术

亚硝酸盐(NO₂ ^-)不是一氧化氮生物代谢的终产物，而是在其代谢中扮演着重要的作用。在体内，亚硝酸盐可以由多种途径生成，其中包括：水(H₂O)或者硫醇(RSH)与三氧化二氮(N₂O₃)发生的亚硝化反应，过氧亚硝酸根(OONO^-)的还原反应，以及硝酸根(NO₃ ^-)的还原反应。在酸性的胃液中，亚硝酸盐可以被转化为一氧化氮，在胃肠道中起抗菌、抗病毒作用。在乏氧环境下，亚硝酸盐可以被还原为一氧化氮，在乏氧血管舒张过程中起重要作用。由于亚硝酸盐在生理及病理过程中的作用，定量检测不同生物样品中的亚硝酸盐含量是非常重要的工作。另外，环境中水体的亚硝酸盐含量是水质的一个重要指标。虽然，低浓度的亚硝酸盐对健康是无害的甚至是有益处的，但是高浓度的亚硝酸盐(30mg/kg)则会引起高铁血红蛋白症甚至死亡。因此，实用的亚硝酸盐检测试剂不仅可以用于传统领域如食品安全、疾病检测、环境监控和司法鉴定等，还对生命科学基础研究有重大价值。

最早也是到目前为止应用最广泛的亚硝酸根检测试剂是1858年开发出来的Griess试剂。该试剂通过比色法实现检测，其检测极限大约为0.5μM。由于一些生物样本中的亚硝酸盐的含量低于此检测限，在1970年，Wiersma利用2,3-二氨基萘(DAN)开发了荧光检测法来检测亚硝酸盐。检测限达到10nM。但是，以上两种常用试剂并不是完美的。

Griess试剂用了两步反应来检测亚硝酸盐(图1a)：首先，所加入的亚硝酸盐会与等当量的磺胺在酸性条件下反应生成亲电性的重氮化合物。接着，与随后加入的萘乙二胺反应得到偶氮染料，进而质子化生成化合物5。该化合物呈现出的紫色(λ_abs＝540nm)则用于Griess试剂检测亚硝酸盐。为了简化实验操作，一些商用化的操作步骤会指示将含有亚硝酸盐的样品直接加入到化合物1和化合物3的混合溶液中。但是，这样的操作有可能使化合物3中胺基被亚硝化，从而干扰检测。另外，该检测需要15分钟或更长来使检测反应完成。检测通量有限。

DAN试剂的检测同样是两步的检测过程(图1b)。在第一步反应中，DAN的酸性溶液DAN与亚硝酸盐生成萘酚三唑。可是，在酸性条件下的萘酚三唑荧光较弱，因而需要将pH值由强酸性调至强碱性后再检测溶液荧光强度。另外，DAN试剂检测速度较慢。比如，亚硝酸盐(10μM)与DAN(63nM)之间的反应需要50分钟甚至更长才能完成。再次，DAN试剂的检测容易受到FADH₂，FMNH₂和NADPH荧光的干扰。

因此，有必要开发检测迅速、操作方便、高选择性的亚硝酸盐检测试剂。

发明内容

因此，本发明设计了一系列选择性高、动力学快并且使用更方便的亚硝酸盐探针。本发明的探针可以同时用比色和荧光来实现检测，进而可以适用于现有Griess和DAN试剂的检测设备。

本发明的探针具有下式I所示的结构：

式I中，

R₁是-COOH、-C(O)O-C1-C4烷基、-SO₃H、-SO₂NH₂或CN；和

R₂是H、-C1-C4烷基-NH₂或C1-C4烷基。

在一具体实施例中，R₁为CN或-C(O)O-C1-C4烷基。

在一具体实施例中，R₁为CN或-COOH。

在一具体实施例中，R₁为CN。

在一个具体实施例中，R1为-COOMe。

在一具体实施例中，R₂为C1-C3烷基。

在一个具体实施例中，R2为-CH₂CH₂NH₂。

在一具体实施例中，R₂为甲基或乙基。

在一具体实施例中，R₁为CN，R₂为C1-C3烷基。

在一具体实施例中，本发明的化合物具有下式结构：

本发明还提供一种检测组合物，该组合物含有本发明式I化合物。

本发明的检测组合物还可含有溶解式I化合物的溶剂。

在一个具体实施例中，所述溶剂可以是例如盐酸溶液。

在一个具体实施例中，所述检测组合物还含有能在酸性水溶液中提供溶解的Hg²⁺的Hg盐，例如Hg(NO₃)₂。

本发明提供一种检测试剂盒，所述试剂盒含有本发明式I化合物，或含有本发明的检测组合物。

本发明还提供一种检测样品中的亚硝酸盐和/或亚硝化硫醇的方法，所述方法包括使本发明式I化合物或检测组合物与样品接触，并检测紫外可见光谱或荧光发射光谱信号。

在一个具体实施例中，所述方法还包括用本发明式I化合物或检测组合物接触已知浓度的亚硝酸盐和/或亚硝化硫醇标准溶液，建立标准校正曲线。

在一个具体实施例中，检测溶液在490纳米处的紫外可见吸收强度，并用所得紫外可见吸收值与所加亚硝酸盐或亚硝化硫醇的标准浓度建立基于所述紫外可见数据的标准校准曲线。

在一个具体实施例中，在470纳米激发下检测溶液在555纳米处的荧光发射强度，并用所得荧光强度与所加亚硝酸盐或亚硝化硫醇的标准浓度建立基于荧光发射数据的标准校正曲线。

在一个具体实施例中，所述方法包括将检测到样品的紫外可见广谱或荧光发射广谱信号与所述基于紫外可见数据的标准校准曲线或基于荧光发射数据的标准校正曲线进行比较，从而确定样品中亚硝酸盐或亚硝化硫醇的存在量。

在一个具体实施例中，所述方法还包括：

用本发明式I化合物或检测组合物接触已知浓度的亚硝酸盐和/或亚硝化硫醇标准溶液，建立标准校正曲线；和

将检测到样品的紫外可见广谱或荧光发射广谱信号与所述基于紫外可见数据的标准校准曲线或基于荧光发射数据的标准校正曲线进行比较，从而确定样品中亚硝酸盐或亚硝化硫醇的存在量。

在一个具体实施例中，所述方法还包括：检测溶液在490纳米处的紫外可见吸收强度，并用所得紫外可见吸收值与所加亚硝酸盐或亚硝化硫醇的标准浓度建立基于所述紫外可见数据的标准校准曲线；或在470纳米激发下检测溶液在555纳米处的荧光发射强度，并用所得荧光强度与所加亚硝酸盐或亚硝化硫醇的标准浓度建立基于荧光发射数据的标准校正曲线。

本发明还包括式I化合物在检测样品中的亚硝酸盐和亚硝化硫醇中的应用。

在一个具体实施例中，所述检测是定量检测。

本发明还提供式I化合物的制备方法：

式I中，

R₁是-COOH、-C(O)O-C1-C4烷基、-SO₃H、-SO₂NH₂或CN，优选CN；和R₂是H、-C1-C4烷基-NH₂或-C1-C4烷基，优选C1-C3烷基；

所述方法包括在溶剂中，使式II和式III化合物在催化剂的存在下反应，从而得到式I化合物：

式II和III中，R₁是-COOH、-C(O)O-C1-C4烷基、-SO₃H、-SO₂NH₂或CN，优选CN；和R₂是H、-C1-C4烷基-NH₂或-C1-C4烷基，优选C1-C3烷基；X为卤素。

在一个具体实施例中，所述溶剂含有苯、乙醇和水。

在一个具体实施例中，所述催化剂是Pd(PPh₃)₄。

在一个具体实施例中，还存在在Suzuki耦联反应中起催化作用的碱，包括但不限于Na₂CO₃。可使用其它盐，如NaOAc、K₂CO₃、Cs₂CO₃、K₃PO₄等替换Na₂CO₃。

在一个具体实施例中，将化合物II、III、Na₂CO₃和Pd(PPh₃)₄加到反应容器，用苯、乙醇和水溶解后，除去反应容器中的氧气，加热回流进行反应。

在一个具体实施例中，反应冷却，用水和二氯甲烷萃取，收集有机相，干燥(例如通过加入无水MgSO₄)，过滤，减压蒸馏出去有机溶剂，从而获得含有式I化合物的产物。

在一个具体实施例中，所述方法还包括，以石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂进行柱层析，纯化得到式I化合物。

附图说明

图1：a)Griess试剂的检测原理；b)DAN试剂的检测原理。

图2：本发明探针NT555的结构与检测原理。

图3：a)NT555对NaNO₂的紫外可见滴定；b)紫外可见滴定在489纳米处的吸收随NaNO₂的当量变化；c)NT555对NaNO₂的荧光滴定；d)荧光滴定中555纳米处的荧光强度随NaNO₂的当量变化；e)NT555对NaNO₂的检测动力学研究；f)NT555对NaNO₂的最低检测限的研究。

图4：a)NT555和Hg(NO₃)₂的混合溶液对GSNO的紫外可见滴定中；溶液在489纳米处的紫外可见吸收值随GSNO的当量变化。b)NT555和Hg(NO₃)₂的混合溶液对GSNO的荧光滴定中；溶液在470纳米激发下，555纳米处的荧光发射强度值随GSNO的当量变化。c)NT555和Hg(NO₃)₂的混合溶液对GSNO的检测动力学研究。

具体实施方式

本发明利用“共价组装”的探针设计思路，设计合成了一个新颖的可定量检测亚硝酸盐和亚硝化硫醇的荧光探针NT555。在检测过程中，溶液的紫外可见光谱的最大吸收带向长波长方向移动，并且被激发后在555纳米处出现一个从零背景下增加的荧光信号。NT555的最低检测限为4nM。NT555的检测时间为60秒，较Griess试剂检测所需的15分钟大幅缩短。NT555的荧光检测波长比DAN试剂更长，可以避免许多内源性物质自身荧光的干扰。

具体而言，本发明涉及使用本发明式I化合物检测样品中的亚硝酸盐和亚硝化硫醇：

式I中，R₁是-COOH、-C(O)O-C1-C4烷基、-SO₃H、-SO₂NH₂或CN；和R₂是H、-C1-C4烷基-NH₂或C1-C4烷基。

“烷基”在本文中指支链或直链饱和烃基。在一些实施方式中，烷基含有1－4个碳原子，在优选的实施例中，烷基含有1－3个碳原子，在更优选的实施例中，烷基有1－2个碳原子。烷基的例子有甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基等。

“卤素”可以是F、Cl、Br和I。

优选的式I化合物是R₁为CN、R₂为C1-C3烷基的化合物。

本发明式I化合物可按以下步骤制备：

式I、II和III中，R₁是-COOH、-C(O)O-C1-C4烷基、-SO₃H、-SO₂NH₂或CN；和R₂是H、-C1-C4烷基-NH₂或C1-C4烷基；X是卤素。

具体而言，可将化合物II、III、Na₂CO₃和Pd(PPh₃)₄加到反应容器，用苯/乙醇/水溶解后，除去反应容器中的氧气，然后加热回流。待反应冷却后，用水和二氯甲烷萃取。收集有机相，加入无水MgSO₄。过滤，减压蒸馏出去有机溶剂。粗品进一步以石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂进行柱层析，可得到式I化合物。

本发明提供一种检测组合物，该组合物含有本发明式I的化合物和溶剂。溶剂可以是各种溶解本发明化合物并适用于亚硝酸盐和亚硝化硫醇的检测的溶剂。这类溶剂包括但不限于各种酸，例如有机酸或无机酸，具体包括盐酸和硫酸等。溶剂的浓度不限，可根据实际检测情况使用，通常酸的浓度为0.5-2M。在一个具体实施例中，使用1M的盐酸溶液作为溶剂。

检测组合物中，本发明式I的化合物通常为100μM以内的任意浓度。例如，本发明化合物的浓度通常为5-50μM，优选为5-20μM。

由于亚硝基硫醇可以在Hg²⁺的存在下转化为亚硝酸盐，因此，当用本发明的检测组合物检测亚硝基硫醇时，可在检测组合物中加入能在酸性水溶液中提供溶解的Hg²⁺的Hg盐，例如Hg(NO₃)₂。Hg²⁺的浓度通常为式I化合物的1－5倍。例如，若使用20μM的式I化合物，则检测组合物中最高可含有100μM的Hg²⁺。

因此，当使用本发明的检测组合物检测亚硝基硫醇时，该组合物可含有本发明式I化合物、酸以及能在该组合物所处的酸性条件下提供Hg²⁺的Hg盐。

本发明还提供一种检测试剂盒，所述试剂盒含有本发明式I的化合物，或本发明的检测组合物。本发明的检测试剂盒还可包括用于指导检测样品中的亚硝酸盐和亚硝化硫醇的说明书。

本发明提供一种检测样品中的亚硝酸盐和亚硝化硫醇的方法，所述方法包括使本发明式I化合物或本发明检测组合物与样品接触，并检测紫外可见光谱或荧光发射光谱信号。

可先用本发明式I化合物或检测组合物接触已知浓度的亚硝酸盐和/或亚硝化硫醇标准溶液，建立标准校正曲线。通常，可检测溶液在490纳米处的紫外可见吸收强度，并用所得紫外可见吸收值与所加亚硝酸盐或亚硝化硫醇的标准浓度建立基于所述紫外可见数据的标准校准曲线；或者，可在470纳米激发下检测溶液在555纳米处的荧光发射强度，并用所得荧光强度与所加亚硝酸盐或亚硝化硫醇的标准浓度建立基于荧光发射数据的标准校正曲线。

可将检测到样品的紫外可见广谱或荧光发射广谱信号与所述基于紫外可见数据的标准校准曲线或基于荧光发射数据的标准校正曲线进行比较，从而确定样品中亚硝酸盐或亚硝化硫醇的存在量。

本发明的化合物、组合物、试剂盒及方法不仅可以用于传统领域如食品安全、疾病检测、环境监控和司法鉴定，还可用于生命科学基础研究领域。

因此，适用于本发明方法检测的样品可以是生物样品，包括但不限于血液、尿液、泪液、粪便等；也可以是来自环境的待测样品，包括例如工业废水、土壤、植物部分(例如怀疑被汞污染的植物的叶子、树干、根等)，也可以是怀疑受汞污染的大气等。

本发明的检测是体外检测方法。可采用本领域常规的荧光仪进行检测。

在使本发明化合物或检测组合物与样品接触之前，可先对样品进行预处理，包括，例如对于土壤溶入纯净水中，然后过滤除去残渣等等。这些预处理可根据不同检测对象而不同，但都属于本领域的常规预处理手段。

下文将以具体实施例的方式描述本发明。应理解，这些具体实施例仅仅是阐述性的，本发明并不限于这些具体实施例。实施例中所使用到的各种试剂、反应条件等，除非另有说明，否则为本领域常规使用的试剂和反应条件。

实施例1：NT555的合成

探针NT555是由4-氨基-3-碘苯甲腈和芳基苯硼酸通过Suzuki偶联以86％的产率得到。NT555在酸性条件下发生重氮化反应以75％的产率得到化合物9。

4-氨基-3-(1-甲基-1,2,3,4,-四氢喹啉-7-基)苯甲腈(NT555)将化合物10(100mg，0.41mmol)和11(112mg，0.41mmol)，Na₂CO₃(130mg，1.23mmol)，Pd(PPh₃)₄(5mg，0.4mol％)加入到Schlenk瓶中，用苯/乙醇/水(v/v10:3:3，32mL)溶解。通氩气15分钟出去瓶中氧气，加热回流8小时。待反应冷却后，用水和二氯甲烷萃取。收集有机相，加入无水MgSO₄。过滤，减压蒸馏出去有机溶剂。粗品进一步以石油醚/乙酸乙酯(v/v10:3)为洗脱剂进行柱层析，得到93mg白色固体NT555，产率为86％。

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)7.41(d,1H,J＝2.0Hz),7.37(dd,1H,J＝8.4Hz,2.0Hz),7.02(d,1H,J＝7.6Hz),6.69(d,1H,J＝8.4Hz),6.59(dd,1H,J＝7.6Hz,1.2Hz),6.52(d,1H,J＝1.2Hz),4.33(s,2H),3.28(t,2H,J＝6.0Hz),2.90(s,3H),2.80(t,2H,J＝6.4Hz),2.04-1.98(m,2H).¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃)148.0,147.4,136.1,134.4,132.4,129.5,128.6,122.8,120.4,116.2,114.9,111.0,100.3,51.3,39.2,27.7,22.4.EI-HRMSC₁₇H₁₇N₃[M]⁺理论值263.1422,实际值263.1423。

11-甲基-8,9,10,11-四氢苯并[c]吡啶并[2,3-g]噌啉-2-甲腈(8)将NT555(10mg，0.04mmol)溶解在含有1M盐酸水溶液(20mL)的100mL烧杯中。在0℃条件下，亚硝酸钠(3mg，0.048mmol)的水溶液滴加至以上反应液中，并伴随剧烈搅拌。反应2小时后，用NaHCO₃溶液将反应液的pH值调至中性，后用二氯甲烷萃取。收集有机相，加入无水MgSO₄。过滤，减压蒸馏出去有机溶剂。粗品进一步以二氯甲烷/甲醇(v/v20:1)为洗脱剂进行柱层析，得到8mg化合物8，产率为75％。

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.73(d,1H,J＝1.2Hz),8.56(d,1H,J＝8.8Hz),8.16(s,1H),7.88(dd,1H,J＝8.8Hz,1.2Hz),7.11(s,1H),3.56(t,2H,J＝6.0Hz),3.22(s,3H),3.05(t,2H,J＝6.0Hz),2.09(m,2H).¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃):δ149.9,145.1,141.5,131.6,130.5,129.5,129.2,128.1,121.7,120.7,118.9,112.3,95.5,51.6,39.5,28.5,21.4.EI-HRMSC₁₇H₁₅N₄[M]⁺理论值274.1218,实际值274.1219。

实施例2：采用NT555检测亚硝酸盐

探针NT555，Griess试剂和DAN试剂被应用于工业盐中亚硝酸盐含量的检测。首先，根据已有的操作规程用Griess与DAN试剂检测样品中亚硝酸盐的质量分数为7.3％。而根据吸收和荧光发射谱的变化，NT555也给出了相同的结果。而硝酸盐可在与镉发生化学反应或者通过硝基还原酶反应被定量还原为亚硝酸盐，因而NT555也可以用于间接检测硝酸盐。

亚硝酸根的具体检测方法如下：

把探针NT555溶于1M的盐酸溶液中，配制探针的检测溶液。探针的浓度可以是100μM以内的任意浓度。在此实施例中NT555的最终浓度为20μM。向一定体积的该探针NT555溶液中加入一定体积的NaNO₂的标准溶液。在本实施例中NT555溶液的体积为2mL，NaNO₂的标准溶液体积是50μM。所得溶液在室温下搅拌2分钟后用各类紫外可见分光光度计或者紫外可见光谱仪检测溶液在490纳米处的紫外可见吸收强度。用所得紫外可见吸收值与所加NaNO₂的标准浓度建立一条基于紫外可见数据的标准校正曲线。也可以用各类荧光分光光度计或者荧光光谱仪在470纳米激发下检测溶液在555纳米处的荧光发射强度。用所得荧光强度与所加NaNO₂的标准浓度建立一条基于荧光发射数据的标准校正曲线。再取2mLNT555溶液，并向其中加入50μM待测溶液，搅拌2分钟后检测溶液的在490纳米处的紫外可见吸收或者在470纳米激发时555纳米处的荧光发射。再和对应的校正曲线对照确定待测溶液中NaNO₂的含量。

检测结果显示在图3中。

实施例3：使用NT555检测亚硝基硫醇

亚硝基硫醇可以在Hg²⁺的存在下被转化为亚硝酸盐，因此也可以用NT555检测。NT555对亚硝基谷胱甘肽(GSNO)的滴定实验作为一个范例被完成(图4)。随着GSNO溶液的加入到含有100μMHg²⁺的NT555(20μM)的盐酸溶液(1M)，经过300s反应后，检测了吸收和荧光发射信号。类似于亚硝酸盐的滴定，该检测的吸收和荧光发射信号随检测物当量变化而增强。检测动力学实验显示该反应在150s内完成。

亚硝化硫醇的具体检测方法如下：

把探针NT555和Hg(NO₃)₂溶于1M的盐酸溶液中配制探针的检测溶液。探针的浓度可以是100μM以内的任意浓度。Hg(NO₃)₂浓度为探针浓度的1－5倍。Hg(NO₃)₂也可以被其它在酸性水溶液中可以溶解的Hg²⁺代替。在此实施例中NT555的最终浓度为20μM，Hg(NO₃)₂的浓度为100μM。向一定体积的该探针NT555溶液中加入一定体积的GSNO的标准溶液。在本实施例中探针溶液的体积为2mL，GSNO的标准溶液体积是50μM。所得溶液在室温下搅拌5分钟后用各类紫外可见分光光度计或者紫外可见光谱仪检测溶液在490纳米处的紫外可见吸收强度。用所得紫外可见吸收值与所加GSNO的标准浓度建立一条基于紫外可见数据的标准校正曲线。也可以用各类荧光分光光度计或者荧光光谱仪在470纳米激发下检测溶液在555纳米处的荧光发射强度。用所得荧光强度与所加GSNO的标准浓度建立一条基于荧光发射数据的标准校正曲线。再取2mL探针溶液，并向其中加入50μM待测GSNO溶液，室温搅拌5分钟后检测溶液的在490纳米处的紫外可见吸收或者在470纳米激发时555纳米处的荧光发射。再和对应的校正曲线对照确定待测溶液中GSNO的含量。

检测结果显示在图4中。

虽然已以具体实施例的方式阐述了本发明，但应理解，上述具体实施例仅仅是阐述性的，并不用于限定本发明的保护范围。在不偏离本申请的精神的情况下对本发明做出的任何修改，都应包括在本发明的范围之内。

Claims (10)

1.下式I所示的化合物：

式I中，

R₁是-COOH、-C(O)O-C1-C4烷基、-SO₃H、-SO₂NH₂或CN，优选CN；和

R₂是H、-C1-C4烷基-NH₂或-C1-C4烷基，优选C1-C3烷基。

2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有下式结构：

3.一种检测组合物，其特征在于，所述组合物含有权利要求1－2中任一项所述的化合物和溶解所述化合物并适用于亚硝酸盐和亚硝化硫醇的检测的溶剂，如无机酸或有机酸。

4.如权利要求3所述的检测组合物，其特征在于，所述检测组合物还含有能在酸性水溶液中提供溶解的Hg²⁺的Hg盐，例如Hg(NO₃)₂。

5.一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1－2中任一项所述的化合物或权利要求3－4中任一项所述的检测组合物。

6.一种检测样品中的亚硝酸盐和/或亚硝化硫醇的方法，所述方法包括使权利要求1－2中任一项所述的化合物或权利要求3－4中任一项所述的检测组合物与样品接触，并检测紫外可见光谱或荧光发射光谱信号。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

用权利要求1－2中任一项所述的化合物或权利要求3－4中任一项所述的检测组合物接触已知浓度的亚硝酸盐和/或亚硝化硫醇标准溶液，建立标准校正曲线；和

将检测到样品的紫外可见广谱或荧光发射广谱信号与所述基于紫外可见数据的标准校准曲线或基于荧光发射数据的标准校正曲线进行比较，从而确定样品中亚硝酸盐或亚硝化硫醇的存在量。

8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，检测溶液在490纳米处的紫外可见吸收强度，并用所得紫外可见吸收值与所加亚硝酸盐或亚硝化硫醇的标准浓度建立基于所述紫外可见数据的标准校准曲线；或在470纳米激发下检测溶液在555纳米处的荧光发射强度，并用所得荧光强度与所加亚硝酸盐或亚硝化硫醇的标准浓度建立基于荧光发射数据的标准校正曲线。

9.权利要求1－2中任一项所述的化合物在检测样品中的亚硝酸盐和亚硝化硫醇中的应用。

10.下式I化合物的制备方法：

式I中，

R₁是-COOH、-C(O)O-C1-C4烷基、-SO₃H、-SO₂NH₂或CN，优选CN；和R₂是H、-C1-C4烷基-NH₂或-C1-C4烷基，优选C1-C3烷基；

所述方法包括在溶剂中，使式II和式III化合物在催化剂的存在下反应，从而得到式I化合物：

式II和III中，R₁是-COOH、-C(O)O-C1-C4烷基、-SO₃H、-SO₂NH₂或CN，优选CN；和R₂是H、-C1-C4烷基-NH₂或-C1-C4烷基，优选C1-C3烷基；X为卤素。