CN102994072A

CN102994072A - 一种检测次氯酸根的荧光探针及其制备方法

Info

Publication number: CN102994072A
Application number: CN2012105367982A
Authority: CN
Inventors: 张煊
Original assignee: Donghua University
Current assignee: Donghua University
Priority date: 2012-12-12
Filing date: 2012-12-12
Publication date: 2013-03-27

Abstract

本发明涉及一种检测次氯酸根的荧光探针，制备方法包括：将荧光素与水合肼在乙醇中回流反应生成荧光素酰肼；再与苯基异氰酸酯在N，N-二甲基甲酰胺中室温反应，通过硅胶柱色谱纯化，得到荧光素酰胺基苯基脲荧光探针；本发明的荧光探针水溶性好，反应时间快，选择性高，对次氯酸根具有高度专一性，可在pH=7.4的生理环境条件下工作，具有应用于生物荧光成像的前景。

Description

一种检测次氯酸根的荧光探针及其制备方法

技术领域

本发明属于荧光探针及其制备领域，具体涉及一种检测次氯酸根的荧光探针及其制备方法。

背景技术

次氯酸（HOCl）是具有重要生理意义的活性氧之一，而在生理环境酸度下（pH～7.4），主要以次氯酸根离子（ClO^-）形式存在。尽管次氯酸根对于维持生命具有重要作用，但浓度过高反而有害无益，因此发展在生理环境条件下对次氯酸根的快速定量检测方法具有重要意义。荧光探针法具有灵敏度高、选择性好和易于实现自动化与可视化成像等特点而备受关注。马会民等发明了一种N-苯甲酰基罗丹明B肼的荧光探针（马会民，陈新启，2008年，专利号CN101302220A），该荧光探针需要在强碱性（pH=12.2）和含30%的四氢呋喃有机溶剂条件下与次氯酸根离子反应30分钟，显然强碱性和大量有机溶剂的使用不适合于测定生理环境下的次氯酸根。韩克利等发明了一种花箐染料的荧光探针(韩克利等，2012年，专利号CN102344795A)，引入的邻苯二酚基团经次氯酸根氧化转变为醌式结构而导致荧光减弱，其荧光减弱的响应性能不利于可视化的荧光成像应用，另外常见氧化剂对次氯酸根的测定有干扰。Lin Yuan等（L.Yuan et al，Chem.Eur.J.,2012,18,2700–2706）公开了一种罗丹明B结合氨基硫脲的荧光探针，次氯酸根可使其发生脱硫反应生成荧光性产物，但荧光探针的水溶性差，需要50%的N，N-二甲基甲酰胺有机溶剂作为共同溶剂，而且选择性不好，汞离子的存在亦能发生同样的脱硫反应。荧光素水溶性好并且荧光量子产率高，基于控制其分子结构中螺环的“开-关”机理可设计适合生理环境条件下工作的荧光增强型荧光探针（X.-Q.Chen et al,Chem.Rev.,2012,112,1910–1956.）。Xiao-Hong Cheng等（X.-H.Chen et al,Chem.Commun.,2011,47,11978-11980）公开了一种荧光素醛肟衍生物，与次氯酸根反应后肟水解为醛荧光增强，但需要10%的二甲亚砜有机溶剂作为共同溶剂，因此不适合在生理环境条件下的应用。Yi Zhou等（Y.Zhou,et al,Chem.Commun.,2012,48,4677–4679）公开了一种二氢荧光素酯衍生物，次氯酸氧化后荧光增强，但反应需要2小时。因此发展在生理条件下可快速检测次氯酸根的荧光素类荧光探针具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供了一种检测次氯酸根的荧光探针。本发明的荧光探针水溶性好，反应时间快，选择性高，对次氯酸根具有高度专一性，可在pH=7.4的生理环境条件下工作，具有应用于生物荧光成像的前景。

本发明的一种检测次氯酸根的荧光探针1的结构如式I。

本发明的一种可快速检测次氯酸根的荧光探针制备方法，包括：

将荧光素与水合肼在乙醇中回流反应生成荧光素酰肼；再与苯基异氰酸酯在N，N-二甲基甲酰胺中室温反应，通过硅胶柱色谱纯化，得到荧光素酰胺基苯基脲荧光探针。

所述荧光素、水合肼、乙醇的质量配比为1:3:30；荧光素酰肼、苯基异氰酸酯、N，N-二甲基甲酰胺的质量配比为1:1.1:5。

所述荧光探针用于中性水溶液中次氯酸根的快速检测。

合成路线如图1所示。

本发明通过实验证实，所合成的荧光探针1本身在pH=7.4的缓冲溶液中没有荧光，但加入次氯酸根后，溶液发射强绿色荧光，反应可在3分钟内完成，适用于生理环境条件下次氯酸根的快速检测。响应时间曲线如图2所示。

将浓度呈梯度变化的次氯酸根的溶液分别加入荧光探针1（式I）的pH=7.4的PBS缓冲溶液中，荧光强度逐渐增强，以次氯酸根浓度为横坐标，荧光强度（发射波长525nm）的变化为纵坐标作图，得到线性关系，通过测定荧光强度即可从图中读出溶液中次氯酸根的含量。

本发明所涉及的荧光探针（式I）为螺环关闭结构，因此不发射荧光，次氯酸根氧化打开螺环结构后，生成荧光性产物，同时荧光增强。通过ESI-MS实验分析，提出了本发明涉及的荧光探针检测次氯酸根的原理，证实了加氯中间产物的生成。检测原理示意图如图3所示。

有益效果

本发明克服了一般的荧光探针水溶性不好、选择性差和响应耗时等弊端。本发明的荧光探针水溶性好，实验过程中仅引入低于1%的乙醇作为共同溶剂；反应时间快，3分钟内即可完成；选择性高，对次氯酸根具有高度专一性，其它常见离子和氧化剂等都不干扰；可在pH=7.4的生理环境条件下工作，具有应用于生物荧光成像的前景。

附图说明

图1是本发明所涉及的荧光探针的合成路线；

图2是本发明所涉及的荧光探针对次氯酸根响应的时间曲线；

图3是本发明涉及的荧光探针对次氯酸根检测的原理示意图；

图4是本发明涉及的荧光探针对次氯酸根的的（a）选择性响应荧光光谱图及相应荧光发射照片和（b）柱状图；

图5是本发明涉及的荧光探针的荧光强度随次氯酸浓度变化的荧光光谱图变化和线性关系图；

图6是本发明涉及的荧光探针1在加入次氯酸根前后的ESI质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

荧光探针的合成路线如图1所示。

荧光素酰肼由荧光素（1g）和过量水合肼（3ml）在30ml乙醇中回流反应5小时，旋转蒸发除去乙醇后，加蒸馏水洗涤，抽滤得产物900mg，产率86.5%。ESI-MS(M+H)⁺:m/zcalcd 347.1;found 347.0。

式I所示结构的荧光探针1合成步骤为：荧光素酰肼（346mg）和苯基异氰酸酯（0.3mL）溶解于5mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌过夜反应。然后在上述溶液中加入20mL蒸馏水，并用20mL二氯甲烷萃取三次，将分离得到的有机相用蒸馏水洗涤后经无水硫酸钠干燥，再用旋转蒸发仪除去二氯甲烷。所得粗产物通过硅胶柱色谱纯化，洗脱溶剂为二氯甲烷/甲醇（体积比10：1）。最后得到290mg浅黄色粉末目标产物1，产率62.2%。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)，(ppm)：9.85(s,2H),8.65(s,1H),8.40(s,1H),8.08(s,1H),7.88(d,2H,J=8.0Hz),7.62-7.55(m,2H),7.30-7.17(m,5H),7.06(d,2H,J=8.0Hz),6.91(t,1H,J=6.0Hz),6.57(s,1H),6.48(d,1H,J=8.0Hz);¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆),ppm)：165.45,158.92,154.00,152.87,151.91,140.16,139.67,134.00,130.00,129.23,129.07,128.94,124.34,123.33,122.34,122.28,118.67,118.52,112.46,109.29,102.56,65.28.ESI-MS(M+H)⁺:m/z calcd466.1;found 465.9。

实施例2

式I所示荧光探针对次氯酸根荧光检测的选择性。

采用pH=7.4的10mM的PBS缓冲溶液控制实验条件符合生理环境条件。

于系列10ml比色管中分别依次加入0.1ml荧光探针1的乙醇溶液（1mM），8.0ml PBS缓冲溶液，0.3ml待测物（其中新鲜配置的次氯酸钠浓度为1mM，其余待测物的浓度均为10mM），并用PBS缓冲溶液定容至10ml。定容后探针的浓度为10M，次氯酸根浓度为30M，其余待测物均为300M。摇匀，平衡3分钟后，将3ml工作液转移至1cm荧光皿中测定荧光光谱，激发和发射波长分别为480nm和525nm。空白实验为上述溶液中不加任何待测物。对次氯酸根的选择性检测如图4所示（嵌入图为荧光发射照片）。体系荧光仅在次氯酸根存在下显著增强，表明了本发明所涉及的荧光探针对次氯酸根的高度专一选择性。

实施例3

式I所示荧光探针对次氯酸根的定量荧光检测。

于系列10ml比色管中分别依次加入0.1ml荧光探针1的乙醇溶液（1mM），8.0ml PBS缓冲溶液，0-1.0ml不同体积的1mM的次氯酸钠溶液并用PBS缓冲溶液定容至10ml。定容后探针的浓度为10M，次氯酸根浓度为0-100M。摇匀，平衡3分钟后，将3ml工作液转移至1cm荧光皿中读取记录525nm处的荧光强度。将荧光强度和相应次氯酸根浓度数据输入软件Origin8进行拟合，在次氯酸钠浓度为0.67-1.8M范围内得一线性工作曲线，线性回归常数为0.9964，表明探针可定量检测次氯酸根的浓度。随次氯酸根离子浓度变化的荧光光谱（图5a）以及相应线性关系（图5b）如图5所示。

实施例4

式I所示荧光探针对次氯酸根荧光检测的原理。

通过ESI-MS分析了在加入次氯酸根离子前后的荧光探针溶液，对相应分子离子峰进行归属，提出本发明所涉及的荧光探针1对次氯酸根荧光检测的原理。在未加入次氯酸根离子时，在m/z=465.9观察到对应(M+H)⁺的信号（图6a）；加入3倍次氯酸根离子后，在m/z=463.2，487.8，500.0和521.8观察到信号（图6b），分别归属为的氧化产物P⁺，(M+Na)⁺，（M+35）的中间产物(IP+H)⁺，以及(IP+Na)⁺。证实了本发明中次氯酸根氧化荧光探针反应的过程中有加氯中间产物生成，加氯中间产物脱去一分子HCl转变为最终产物，检测原理如图2所示。质谱图及其归属如图6所示。

Claims

1.一种检测次氯酸根的荧光探针1，结构式如式I所示

2.根据权利要求1所述的一种检测次氯酸根的荧光探针制备方法，包括：

3.根据权利要求1所述的一种检测次氯酸根的荧光探针制备方法，其特征在于：所述荧光素、水合肼、乙醇的质量配比为1:3:30；荧光素酰肼、苯基异氰酸酯、N，N-二甲基甲酰胺的质量配比为1:1.1:5。

4.根据权利要求1所述的一种检测次氯酸根的荧光探针的应用，其特征在于：所述荧光探针用于中性水溶液中次氯酸根的快速检测。