CN103820103A

CN103820103A - 一种检测汞离子的反应型罗丹明荧光探针及其制备方法

Info

Publication number: CN103820103A
Application number: CN201410058568.9A
Authority: CN
Inventors: 张煊; 朱迎迎
Original assignee: Donghua University
Current assignee: Donghua University
Priority date: 2014-02-20
Filing date: 2014-02-20
Publication date: 2014-05-28

Abstract

本发明涉及一种检测汞离子的反应型罗丹明荧光探针及其制备方法，所述反应型罗丹明荧光探针RBHA的结构式为：制备方法，包括：将罗丹明B和水合肼加入溶剂中，在80-90℃条件下回流反应1-2h，旋转蒸发，然后加水并调节pH，过滤，提纯，得到罗丹明B酰肼；将上述罗丹明B酰肼和乙醛酸溶于溶剂中，室温条件下，搅拌反应过夜，过滤，提纯，即得。本发明对汞离子具有高度的选择性，其它常用离子都无明显干扰；可在宽pH=5-10的环境条件下工作，具有应用于生物荧光成像和环境水样分析中的应用前景。

Description

一种检测汞离子的反应型罗丹明荧光探针及其制备方法

技术领域

本发明属于荧光探针材料及其制备领域，特别涉及一种检测汞离子的反应型罗丹明荧光探针及其制备方法。

背景技术

汞是典型的有毒重金属，可造成生物体神经系统的永久性损伤。重金属污染已成为目前环境污染中的重大污染源之一，因此发展可在水溶液环境中检测汞离子的简单、快速、灵敏的检测方法，对水体环境中重金属污染的监测具有重要意义。分子荧光探针法具有简单快速、灵敏度高、选择性好、易于实现自动化和可视化成像等特点而备受关注。近年来基于小分子荧光探针法检测汞离子已有大量报道（Chem.Rev.,2008,108,3443-3480），但由于重金属离子固有的猝灭荧光发射的性质，使得发展灵敏度较高的荧光增强型荧光探针依然具有一定挑战性。另外对于应用于水体环境中的荧光探针，尤其对于应用于生理环境中的荧光探针，不仅要求其水溶性好，还要求可在生理环境酸度条件下工作，并利于可见光激发以防止紫外光对细胞造成损伤。罗丹明B荧光染料具有荧光量子产率高、激发和发射波长均在可见区范围等优良的光物理性质，在发展荧光探针方面得到了广泛研究（Chem.Rev.,2012,112,1910-1956）。但已报道的多数基于罗丹明B的汞离子荧光探针仅能用于有机溶剂介质或含大量有机溶剂的水溶液中工作。反应型荧光探针具有高度选择性，自第一例反应型罗丹明B酰肼荧光探针应用于检测铜离子以来，受到人们的极大关注（J.Am.Chem.Soc.1997,119,7386-7387）。但目前报道的检测汞离子的反应型罗丹明荧光探针一般均通过汞离子的脱硫反应实现,而基于其它反应的汞离子荧光探针较少（Chem.Rev.,2013,113,192-270）。本发明所涉及的荧光探针RBHA与已报道的不同，是通过汞离子选择性催化罗丹明酰肼衍生物水解产生罗丹明母体分子的反应，进行汞离子检测，合成方法简单、收率高，具有生物荧光成像和环境水样中汞离子的高选择性荧光检测的应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测汞离子的反应型罗丹明荧光探针及其制备方法，该方法对汞离子具有高度的选择性，其它常用离子都无明显干扰；可在宽pH范围（pH=5-10）的环境条件下工作，具有应用于生物荧光成像和环境水样分析中的应用前景。

本发明的一种检测汞离子的反应型罗丹明荧光探针，所述反应型罗丹明荧光探针RBHA的结构式为：

本发明的一种检测汞离子的反应型罗丹明荧光探针的制备方法，包括：

（1）将罗丹明B和水合肼加入溶剂中，在80-90℃条件下回流反应1-2h，旋转蒸发，然后加水并调节pH，过滤，提纯，得到罗丹明B酰肼；

（2）将上述罗丹明B酰肼和乙醛酸溶于溶剂中，室温条件下，搅拌反应过夜，过滤，提纯。得到反应型罗丹明荧光探针。

所述步骤（1）中溶剂为乙醇。

所述步骤（1）中罗丹明B、水合肼、溶剂的质量体积比为5g：5ml：30ml。

所述步骤（1）中氢氧化钠调节pH为9-10。

所述步骤（1）中提纯为抽滤，水洗涤提纯。

所述步骤（2）中溶剂为甲醇。

所述步骤（2）中罗丹明B、乙醛酸、溶剂的质量体积比为1g：0.4g：15mL。

所述步骤（2）中提纯为抽滤，甲醇洗涤提纯。

反应型罗丹明荧光探针RBHA对汞离子的检测方法为：将呈梯度变化的汞离子的水溶液分别加入荧光探针RBHA的pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，以汞离子浓度为横坐标，荧光强度的变化为纵坐标作图，得到线性工作曲线，通过测定荧光强度即可从图中读出溶液中汞离子的含量，其中激发波长520nm，发射波长576nm。

本发明所述的新型荧光探针RBHA的荧光很弱，在与汞离子反应后水解产生罗丹明B，经520nm可见光激发，576nm处的荧光信号显著增强，通过记录荧光强度即可测定汞离子的浓度。荧光探针RBHA在pH=7.4的生理环境水溶液中对汞离子可进行高选择性检测，具有在生物活体细胞中荧光成像和在环境水样分析中的应用前景。

有益效果

本发明的荧光探针是罗丹明B酰肼与乙醛酸缩合后直接过滤洗涤所得，制备方法简单，水溶性良好，实验过程中仅引入低于1%的乙醇作为共同溶剂；选择性高，对汞离子具有高度选择性，其它常见离子都无明显干扰；可在宽pH范围（pH=5-10）的环境条件下工作，具有应用于生物荧光成像和在环境水样分析中的前景。

附图说明

图1为本发明所涉及的反应型荧光探针RBHA的合成路线；

图2为本发明所涉及的反应型荧光探针RBHA在水溶液中对汞离子的选择性响应荧光光谱图，其中插图为RBHA溶液在不同金属离子存在下相应荧光发射的照片；

图3为本发明涉及的反应型荧光探针RBHA随汞离子浓度变化的荧光光谱图；

图4为本发明涉及的反应型荧光探针RBHA的荧光强度变化与汞离子浓度之间的线性关系；图5为本发明涉及的反应型荧光探针RBHA在不同干扰金属离子存在下加入汞离子后的荧光强度变化柱状图；

图6为本发明涉及的反应型荧光探针RBHA在加入汞离子后的质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

（1）罗丹明B酰肼的合成：罗丹明B（5.0g）和水合肼（5.0ml）在30ml乙醇中回流反应2小时，旋转蒸发除去溶剂，加水并利用1M稀盐酸调至酸性（pH=2），使固体残余物全部溶解，再利用1M氢氧化钠溶液调至弱碱性（pH=9-10）；将析出的沉淀过滤，水洗提纯，真空干燥，得到4.0g罗丹明B酰肼，产率78%。ESI-MS(M+H)⁺:m/z calcd457.3;found457.4。（2）反应型荧光探针RBHA的合成：罗丹明B酰肼（1.0g）和乙醛酸（0.4g）溶解于15mL甲醇中，室温氮气保护下搅拌反应10小时。过滤用甲醇洗涤沉淀3次，真空干燥，即得到0.85g目标产物RBHA，产率76%。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),d(ppm):1.08(t,J=8.0Hz,12H),3.32(q,J=8.0Hz,8H),6.34-6.43(m,6H),7.05(d,J=4.0Hz,1H),7.46(s,1H),7.56-7.63(m,2H),7.95(d,J=4.0Hz,1H),13.14(s,1H);¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆),d(ppm)：12.87,44.12,49.07,65.47,97,81,104.26,108.72,123.99,124.33,126.90,127.90,129.41,135.49,149.17,152.54,152.82,164.73,165.28;ESI-MS(M+H)⁺:m/z calcd513.5;found513.1。.

荧光探针RBAH的合成路线如图1所示。

实施例2

荧光探针RBHA对汞离子荧光检测的选择性：

采用pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液控制实验条件。

在不同10ml比色管中分别依次加入0.1ml荧光探针RBAH的乙醇溶液（1mM），2ml待测金属离子水溶液（金属离子浓度均为1mM），用Tris-HCl缓冲溶液定容至10ml，放置1小时。将3ml工作液转移至1cm荧光比色皿中测定荧光光谱，激发波长为520nm。空白实验为上述溶液中不加任何金属离子。对汞离子的选择性检测如图2所示（嵌入图为荧光发射的照片）。可见荧光仅在汞离子存在下显著增强，表明了本发明所涉及的荧光探针RBAH对汞离子的高度选择性。

实施例3

荧光探针RBAH对汞离子的定量荧光检测：

在不同10ml比色管中分别依次加入0.1ml荧光探针RBAH的乙醇溶液（1mM），0-3.0ml不同体积的1mM的汞离子水溶液，并用Tris-HCl缓冲溶液定容至10ml，放置1h。定容后荧光探针的浓度为10mM，汞离子浓度为0-300mM。将3ml工作液转移至1cm荧光比色皿中记录荧光光谱并读取记录576nm处的荧光强度。将荧光强度和相应汞离子浓度数据输入软件Origin8进行拟合，在汞离子浓度为5-200mM范围内得一线性工作曲线，线性回归常数为0.9825，表明探针可定量检测汞离子的浓度。随汞离子浓度变化的荧光光谱变化以及相应线性关系分别如图3和4所示。

实施例4

其它金属离子对荧光探针RBAH检测汞离子的干扰实验：

在不同10ml比色管中分别依次加入0.1ml荧光探针RBAH的乙醇溶液（1mM），2ml浓度均为1mM的其它干扰金属离子（Cu²⁺，Fe³⁺，Fe²⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Pb²⁺，Zn²⁺，Cd²⁺，Ca²⁺，Mg²⁺，K⁺，Na⁺）的水溶液；再分别依次加入2ml浓度为1mM的汞离子水溶液，并用Tris-HCl缓冲溶液定容至10ml。定容后荧光探针的浓度为10mM，干扰金属离子的浓度为200mM，汞离子的浓度为200mM。放置1小时后，将3ml工作液转移至1cm荧光比色皿中测定荧光光谱，激发和发射波长分别为520nm和576nm。将记录的荧光强度与不同金属离子作柱状图，结果如图5所示，表明其它常见金属离子对本发明所涉及的荧光探针RBHA检测汞离子无显著干扰。图5中横坐标中1为加入汞离子，2-13分别为在Cu²⁺，Fe³⁺，Fe²⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Pb²⁺，Zn²⁺，Cd²⁺，Ca²⁺，Mg²⁺，K⁺，Na⁺等金属离子存在下，再分别加入汞离子后的荧光强度。

实施例5

荧光探针RBAH检测汞离子的质谱分析实验：

在10ml比色管中依次加入0.1ml荧光探针RBAH的乙醇溶液（1mM），2ml浓度为1mM的汞离子水溶液，并用乙醇定容至10ml，放置1小时后，将1滴溶液滴在MALDI-TOF-MS的样品板上自然干燥后进行质谱分析。结果如图6所示，质谱图上主要观察到m/z443处的质谱峰，可归属为罗丹明B母体分子，表明RBAH为反应型荧光探针，在汞离子存在下RBAH发生水解，产生了强荧光的罗丹明B母体分子。

Claims

1.一种检测汞离子的反应型罗丹明荧光探针，其特征在于：所述反应型罗丹明荧光探针RBHA的结构式为：

2.一种检测汞离子的反应型罗丹明荧光探针的制备方法，包括：

（2）将上述罗丹明B酰肼和乙醛酸溶于溶剂中，室温条件下，搅拌反应过夜，过滤，提纯，得到反应型罗丹明荧光探针。

3.根据权利要求2所述的一种检测汞离子的反应型罗丹明荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中溶剂为乙醇。

4.根据权利要求2所述的一种检测汞离子的反应型罗丹明荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中罗丹明B、水合肼、溶剂的质量体积比为5g：5ml：30ml。

5.根据权利要求2所述的一种检测汞离子的反应型罗丹明荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中氢氧化钠调节pH为9-10。

6.根据权利要求2所述的一种检测汞离子的反应型罗丹明荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中提纯为抽滤，水洗涤提纯。

7.根据权利要求2所述的一种检测汞离子的反应型罗丹明荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中溶剂为甲醇。

8.根据权利要求2所述的一种检测汞离子的反应型罗丹明荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中罗丹明B、乙醛酸、溶剂的质量体积比为1g：0.4g：15mL。

9.根据权利要求2所述的一种检测汞离子的反应型罗丹明荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中提纯为抽滤，甲醇洗涤提纯。