CN104479671B - 用于检测水相介质和细胞内汞离子的罗丹明b双硫类荧光探针及制备与应用 - Google Patents
用于检测水相介质和细胞内汞离子的罗丹明b双硫类荧光探针及制备与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种用于检测水相介质和细胞内汞离子的罗丹明B双硫类荧光探针及制备与应用。该罗丹明B双硫类荧光探针在水相介质中通过对汞离子的螯合配位作用，使罗丹明类荧光探针中分子闭环打开，从而产生荧光，其荧光强度与汞离子的初始浓度有良好的线性关系，并伴随有探针溶液从无色到粉红色的裸眼可见颜色变化；同时，表现出对汞离子很高的专一选择性；另外，该荧光探针具有较好的生物相容性和细胞通透性，较低的细胞毒性，可用于细胞内汞离子的检测，且表现出较好的汞离子检测灵敏度。其制备是以罗丹明B为原料，通过与三氯氧磷作用制得罗丹明B酰氯中间体，此酰氯中间体再进一步与双硫中间体缩合获得具有高灵敏度和高选择性的汞离子探针。
Description
技术领域
本发明属于环境检测及生物诊断领域，特别涉及一种用于检测水相介质和细胞内汞离子的罗丹明B双硫类荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
汞离子是对人类身体健康最有威胁和毒害作用的金属离子之一。它对人体的中枢神经系统、消化系统及肾脏有重要的毒害作用，同时也对呼吸系统、皮肤、血液及眼睛有一定的影响。汞及其污染物通过火山活动、采矿、固体废弃物焚化等多种方式，广泛分布于水、空气和土壤中，并可以进一步通过食物链不断在人身体内富集，对人体的毒性效应不断增强，从而对人的身体健康产生重大威胁。基于此，实现环境及生物组织中低浓度汞离子的检测多年来一直是人们的研究热点。传统汞离子检测技术主要通过原子吸收光谱等费用昂贵、操作复杂的仪器手段实现，此方法不利于大规模推广使用。
化学荧光探针通过与待测物汞离子的作用，利用荧光强度或荧光发射波长的变化，实现对汞离子的检测，具有灵敏度和选择性高、检测迅速、操作简单等优点。同时，由于有机分子结构易修饰、毒性小，在环境及生物组织内的汞离子检测领域具有广泛的应用前景。而在这类化学荧光探针中，由于罗丹明类有机荧光染料具有较大的摩尔消光系数和较高的荧光量子产率，基于罗丹明“开关”效应的重金属离子荧光探针引起了人们极大的兴趣并被广泛开发报道。大量实验结果证明，罗丹明类有机荧光染料是构建重金属汞离子检测探针的优良有机材料【参见：a)H.Yang,Z.Zhou,K.Huang,M.Yu,F.Li,T.Yi,C.Huang,Org.Lett.2007,9,4729–4732；b)J.Huang,Y.Xu,X.Qian,J.Org.Chem.2009,74,2167–2170；c)Y.H.Lee,M.H.Lee,J.F.Zhang,J.S.Kim,J.Org.Chem.2010,75,7159–7165；d)Y.K.Yang,K.J.Yook,J.Tae,J.Am.Chem.Soc.2005,127,16760–16761.】。虽然多种罗丹明类荧光探针已经被开发报到用于检测汞离子，但目前这些荧光探针的选择性、灵敏度以及生物相容性均不甚理想。因此，开发具有高专一选择性、高灵敏度和较好生物相容性等特征的新型汞离子荧光探针在实际应用中仍然具有重要的意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种用于检测水相介质和细胞内汞离子的罗丹明B双硫类荧光探针。该探针可以快速准确、灵敏的检测出水相中以及组织细胞内的汞离子。
本发明的另一目的在于提供上述荧光探针的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述荧光探针的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种用于检测水相介质和细胞内汞离子的罗丹明B双硫类荧光探针，其结构式如式Ⅰ所示：
所述的用于检测水相介质和细胞内汞离子的罗丹明B双硫类荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)2-溴代苯乙酮与1-吡咯啶二硫羧酸铵在丙酮溶液中室温搅拌至反应终止，除去溶剂后，无水乙醇重结晶得白色固体；得到双硫中间体-Ⅰ，其结构式如式II所示：
(2)氮气保护下，将步骤(1)得到的双硫中间体-Ⅰ重新溶于无水乙醇与四氢呋喃的混合溶剂中，于此溶液中加入水合肼，回流至反应终止，除去溶剂，无水乙醇重结晶得白色固体，得到双硫中间体-II，其结构式如式Ⅲ所示，直接用于下一步反应；
(3)氮气保护下，将罗丹明B与三氯氧磷回流反应，移去溶剂，得罗丹明B酰氯中间体；将此罗丹明B酰氯中间体溶于干燥的二氯甲烷，得溶液A；将步骤(2)获得的双硫中间体-II溶于干燥的二氯甲烷，得溶液B；将溶液B缓慢滴加到溶液A中，再向此混合溶液中滴加三乙胺，室温搅拌至反应终止，移去溶剂，得红色粗产品，即罗丹明B双硫类荧光探针。
其中，步骤(1)中所述的2-溴代苯乙酮与1-吡咯啶二硫羧酸铵的摩尔比优选为1：(1～1.5)；
步骤(2)中所述的无水乙醇与四氢呋喃的混合溶剂优选是无水乙醇与四氢呋喃按照体积比1:(1～5)进行混合得到；更优选为按照体积比1:1进行混合得到；
步骤(2)中所述的水合肼的用量优选为双硫中间体-Ⅰ的5～10倍摩尔当量；
所述的反应终止，优选用薄板层析(TLC)法、气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)或液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)等检测；
步骤(3)中所述的回流反应的时间优选为3～5h；更优选为3h；
步骤(3)中所述的反应终止的反应条件为室温，罗丹明B酰氯中间体与双硫中间体-II的摩尔比优选为1：(0.9～1.1)；
步骤(3)中所述的三乙胺的用量优选为双硫中间体-II的10～20倍摩尔当量；
所述的用于检测水相介质和细胞内汞离子的罗丹明B双硫类荧光探针在水相介质和细胞中汞离子检测中的应用。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
本发明所述的罗丹明B双硫类荧光探针在水相介质中具有非常的灵敏度，通过荧光光谱分析，该荧光探针在生物缓冲液HEPES中，可检测到10nM的汞离子浓度(S/N＝3，信噪比为3)，同时，在水相介质中(如水、生物缓冲液、水溶性有机溶剂等)均表现出很高的汞离子专一选择性，Li+、Ca2+、Al3+、Cr3+、Fe2+、Pb2+、Co2+、Ni2+、Cd2+、Ag+、Cu2+等均对Hg2+的检测没有影响。通过荧光共聚焦显微成像分析，该荧光探针具有较好的细胞渗透性，在细胞内同样表现出较好的汞离子检测灵敏度，且无明显的细胞毒害作用。
附图说明
图1是本发明所述的罗丹明B双硫类荧光探针的制备合成路线图。
图2是实施例1得到的罗丹明B双硫类荧光探针的核磁共振氢谱图。
图3是实施例1得到的罗丹明B双硫类荧光探针的核磁共振碳谱图。
图4是实施例1得到的罗丹明B双硫类荧光探针的高分辨质谱图。
图5是实施例7中对实施例1得到的罗丹明B双硫类荧光探针对汞离子的灵敏度分析图；其中，图5a为紫外吸收图，图5b为荧光光谱图。
图6是实施例8中对实施例1得到的罗丹明B双硫类荧光探针对汞离子的选择性荧光光谱分析图。
图7是实施例9中对实施例1得到的罗丹明B双硫类荧光探针在细胞中对汞离子的检测分析图；其中，图7a为细胞中不含汞离子细胞激光共聚焦成像图；图7b为细胞中不含汞离子的细胞明视野图；图7c为细胞内含有汞离子的细胞激光共聚焦成像图；图7d为细胞内含有汞离子的细胞明视野图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂商所建议的实验条件。
实施例1
(1)本发明所提供的一种用于检测水相介质和细胞内汞离子的荧光探针其合成步骤如图1所示，具体如下：在室温下，将1.99g(1.0mmol)2-溴代苯乙酮和1.64g(1.0mmol)1-吡咯啶二硫羧酸铵溶于30mL丙酮中，室温下搅拌至TLC法检测反应终止，蒸去溶剂得黄色固体，经无水乙醇重结晶得白色双硫中间体-Ⅰ，产率75％；
表征数据：1HNMR(400M,CDCl3):δ＝1.96(m,2H),2.08(m,2H),3.74(t,J＝7.2Hz,2H),3.91(t,J＝7.2Hz,2H),4.92(s,2H),7.48(t,J＝7.6Hz,2H),7.81(t,J＝6.4Hz,1H),8.08(m,2H)；13CNMR(101M,CDCl3):δ＝24.39,26.18,44.51,50.82,55.50,128.59,128.71,136.08,191.00,193.44；FAB-MS:m/z＝265。
结构式如下式II所示：
(2)氮气保护下，步骤(1)得到的双硫中间体-Ⅰ1.00g溶于20mL四氢呋喃和无水乙醇(体积比1:1)的混合溶剂中，然后再加入1.00mL(双硫中间体-Ⅰ的5倍摩尔当量)水合肼，此混合溶液回流反应至TLC法检测反应终止，减压蒸去溶剂得黄色固体，此黄色固体经无水乙醇重结晶得白色固体，得到双硫中间体-II，直接用于下一步反应。表征数据：FAB-MS:m/z＝279；
结构式如下式Ⅲ所示：
(3)在氮气保护下，480mg罗丹明B溶于5mL1,2-二氯乙烷中，向此溶液中加入1mL三氯氧磷，加热回流反应3h，减压蒸去溶剂得红色罗丹明B酰氯中间体Rh-Cl，向此红色固体中加入10mL干燥的二氯甲烷，得溶液A；将280mg步骤(2)所得的双硫中间体-II溶于5mL二氯甲烷，得溶液B；将溶液B缓慢滴加到溶液A中，再向此溶液中缓慢滴加1.5mL(双硫中间体-II的10倍摩尔当量)三乙胺，室温搅拌至TLC法检测反应终止，蒸出溶剂得红色固体，经硅胶色谱分离得450mg浅黄色目标罗丹明B双硫类荧光探针I，产率65％。
表征数据：1HNMR(图2，400M,CDCl3):δ＝1.14(m,12H),3.30(m,4H),3.50(t,J＝8.0Hz,2H),3.88(t,J＝8.0Hz,2H),4.74(s,2H),7.21(m,3H),7.29(m,1H),7.49(m,2H),7.70(d,J＝4.0Hz,1H),7.68(d,J＝4.0Hz,1H),7.95(m,1H)；13CNMR(图3，101M,CDCl3):δ＝12.63,24.21,25.99,35.86,44.35,67.55,97.93,106.78,107.94,123.39,124.12,127.94,128.04,128.34,128.56,130.24,130.61,132.63,135.18,148.62,151.38,153.71,161.23,166.79,192.48；MALDI-TOFMS(图4):calcd.for[M+]703.9583,found:704.3036.
结构式如下式I所示：
实施例2
(1)本发明所提供的一种用于检测水相介质和细胞内汞离子的荧光探针其合成步骤如图1所示，具体如下：在室温下，将1.99g(1.0mmol)2-溴代苯乙酮和1.97g(1.2mmol)1-吡咯啶二硫羧酸铵溶于30mL丙酮中，室温下搅拌至TLC法检测反应终止，蒸去溶剂得黄色固体，经无水乙醇重结晶得白色双硫中间体-Ⅰ，产率77％；
(2)氮气保护下，步骤(1)得到的双硫中间体-Ⅰ1.00g溶于20mL四氢呋喃和无水乙醇(体积比1:1)的混合溶剂中，然后再加入1.60mL(双硫中间体-Ⅰ的8倍摩尔当量)水合肼，此混合溶液回流反应至TLC法检测反应终止，减压蒸去溶剂得黄色固体，此黄色固体经无水乙醇重结晶得白色固体，得到双硫中间体-II，直接用于下一步反应。
(3)在氮气保护下，480mg罗丹明B溶于5mL1,2-二氯乙烷中，向此溶液中加入1mL三氯氧磷，加热回流反应3h，减压蒸去溶剂得红色罗丹明B酰氯中间体Rh-Cl，向此红色固体中加入10mL干燥的二氯甲烷，得溶液A；将280mg步骤(2)所得的双硫中间体-II溶于5mL二氯甲烷，得溶液B；将溶液B缓慢滴加到溶液A中，再向此溶液中缓慢滴加1.5mL(双硫中间体-II的10倍摩尔当量)三乙胺，室温搅拌至TLC法检测反应终止，蒸出溶剂得红色固体，经硅胶色谱分离得450mg浅黄色目标罗丹明B双硫类荧光探针I，产率66％。
实施例3
(1)本发明所提供的一种用于检测水相介质和细胞内汞离子的荧光探针其合成步骤如图1所示，具体如下：在室温下，将1.99g(1.0mmol)2-溴代苯乙酮和2.50g(1.5mmol)1-吡咯啶二硫羧酸铵溶于30mL丙酮中，室温下搅拌至TLC法检测反应终止，蒸去溶剂得黄色固体，经无水乙醇重结晶得白色双硫中间体-Ⅰ，产率78％；
(2)氮气保护下，步骤(1)得到的双硫中间体-Ⅰ1.00g溶于20mL四氢呋喃和无水乙醇(体积比1:1)的混合溶剂中，然后再加入2.00mL(双硫中间体-Ⅰ的10倍摩尔当量)水合肼，此混合溶液回流反应至TLC法检测反应终止，减压蒸去溶剂得黄色固体，此黄色固体经无水乙醇重结晶得白色固体，得到双硫中间体-II，直接用于下一步反应。
(3)在氮气保护下，480mg罗丹明B溶于5mL1,2-二氯乙烷中，向此溶液中加入1mL三氯氧磷，加热回流反应3h，减压蒸去溶剂得红色罗丹明B酰氯中间体Rh-Cl，向此红色固体中加入10mL干燥的二氯甲烷，得溶液A；将280mg步骤(2)所得的双硫中间体-II溶于5mL二氯甲烷，得溶液B；将溶液B缓慢滴加到溶液A中，再向此溶液中缓慢滴加1.5mL(双硫中间体-II的10倍摩尔当量)三乙胺，室温搅拌至TLC法检测反应终止，蒸出溶剂得红色固体，经硅胶色谱分离得450mg浅黄色目标罗丹明B双硫类荧光探针I，产率65％。
实施例4
(1)本发明所提供的一种用于检测水相介质和细胞内汞离子的荧光探针其合成步骤如图1所示，具体如下：在室温下，将1.99g(1.0mmol)2-溴代苯乙酮和1.64g(1.0mmol)1-吡咯啶二硫羧酸铵溶于30mL丙酮中，室温下搅拌至TLC法检测反应终止，蒸去溶剂得黄色固体，经无水乙醇重结晶得白色双硫中间体-Ⅰ，产率75％；
(2)氮气保护下，步骤(1)得到的双硫中间体-Ⅰ1.00g溶于20mL四氢呋喃和无水乙醇(体积比1:1)的混合溶剂中，然后再加入1.00mL(双硫中间体-Ⅰ的5倍摩尔当量)水合肼，此混合溶液回流反应至TLC法检测反应终止，减压蒸去溶剂得黄色固体，此黄色固体经无水乙醇重结晶得白色固体，得到双硫中间体-II，直接用于下一步反应。
(3)在氮气保护下，480mg罗丹明B溶于5mL1,2-二氯乙烷中，向此溶液中加入1mL三氯氧磷，加热回流反应3h，减压蒸去溶剂得红色罗丹明B酰氯中间体Rh-Cl，向此红色固体中加入10mL干燥的二氯甲烷，得溶液A；将252mg步骤(2)所得的双硫中间体-II溶于5mL二氯甲烷，得溶液B；将溶液B缓慢滴加到溶液A中，再向此溶液中缓慢滴加1.5mL(双硫中间体-II的10倍摩尔当量)三乙胺，室温搅拌至TLC法检测反应终止，蒸出溶剂得红色固体，经硅胶色谱分离得450mg浅黄色目标罗丹明B双硫类荧光探针I，产率60％。
实施例5
(1)本发明所提供的一种用于检测水相介质和细胞内汞离子的荧光探针其合成步骤如图1所示，具体如下：在室温下，将1.99g(1.0mmol)2-溴代苯乙酮和1.64g(1.0mmol)1-吡咯啶二硫羧酸铵溶于30mL丙酮中，室温下搅拌至TLC法检测反应终止，蒸去溶剂得黄色固体，经无水乙醇重结晶得白色双硫中间体-Ⅰ，产率75％；
(2)氮气保护下，步骤(1)得到的双硫中间体-Ⅰ1.00g溶于20mL四氢呋喃和无水乙醇(体积比1:1)的混合溶剂中，然后再加入1.00mL(双硫中间体-Ⅰ的5倍摩尔当量)水合肼，此混合溶液回流反应至TLC法检测反应终止，减压蒸去溶剂得黄色固体，此黄色固体经无水乙醇重结晶得白色固体，得到双硫中间体-II，直接用于下一步反应。
(3)在氮气保护下，480mg罗丹明B溶于5mL1,2-二氯乙烷中，向此溶液中加入1mL三氯氧磷，加热回流反应3h，减压蒸去溶剂得红色罗丹明B酰氯中间体Rh-Cl，向此红色固体中加入10mL干燥的二氯甲烷，得溶液A；将308mg步骤(2)所得的双硫中间体-II溶于5mL二氯甲烷，得溶液B；将溶液B缓慢滴加到溶液A中，再向此溶液中缓慢滴加1.5mL(双硫中间体-II的10倍摩尔当量)三乙胺，室温搅拌至TLC法检测反应终止，蒸出溶剂得红色固体，经硅胶色谱分离得450mg浅黄色目标罗丹明B双硫类荧光探针I，产率67％。
实施例6
(1)本发明所提供的一种用于检测水相介质和细胞内汞离子的荧光探针其合成步骤如图1所示，具体如下：在室温下，将1.99g(1.0mmol)2-溴代苯乙酮和1.64g(1.0mmol)1-吡咯啶二硫羧酸铵溶于30mL丙酮中，室温下搅拌至TLC法检测反应终止，蒸去溶剂得黄色固体，经无水乙醇重结晶得白色双硫中间体-Ⅰ，产率75％；
(2)氮气保护下，步骤(1)得到的双硫中间体-Ⅰ1.00g溶于20mL四氢呋喃和无水乙醇(体积比1:1)的混合溶剂中，然后再加入1.00mL(双硫中间体-Ⅰ的5倍摩尔当量)水合肼，此混合溶液回流反应至TLC法检测反应终止，减压蒸去溶剂得黄色固体，此黄色固体经无水乙醇重结晶得白色固体，得到双硫中间体-II，直接用于下一步反应。
(3)在氮气保护下，480mg罗丹明B溶于5mL1,2-二氯乙烷中，向此溶液中加入1mL三氯氧磷，加热回流反应3h，减压蒸去溶剂得红色罗丹明B酰氯中间体Rh-Cl，向此红色固体中加入10mL干燥的二氯甲烷，得溶液A；将280mg步骤(2)所得的双硫中间体-II溶于5mL二氯甲烷，得溶液B；将溶液B缓慢滴加到溶液A中，再向此溶液中缓慢滴加3.0mL(双硫中间体-II的20倍摩尔当量)三乙胺，室温搅拌至TLC法检测反应终止，蒸出溶剂得红色固体，经硅胶色谱分离得450mg浅黄色目标罗丹明B双硫类荧光探针I，产率66％。
实施例7
对实施例1中所述的罗丹明B双硫类荧光探针在水相介质中对汞离子检测的灵敏度分析：在1μM荧光探针I的生物缓冲液HEPES(HEPES购自生工生物工程(上海)股份有限公司，配方：1.19gHEPES溶解在4mL蒸馏水中，加0.5M的NaOH水溶液调节至PH为7.4，然后用蒸馏水定容至50mL，于4℃保存。)中，逐渐加入高氯酸汞的HEPES溶液至最终汞离子的浓度为20μM，在此过程中记录该荧光探针的紫外吸收(图5a)和荧光光谱(图5b)的变化。同时，通过分析荧光光谱强度的变化(图5b)，测定荧光强度的信噪比(S/N＝3)，该荧光探针可实现10nM的汞离子检测限。
实施例8
对实施例1中所述的罗丹明B双硫类荧光探针在水相介质中对汞离子检测的选择性分析：在1μM荧光探针的生物缓冲液HEPES中，逐渐加入LiCl、CaCl2、AlCl3、CrCl3、FeCl2、PbCl2、CoCl2、NiCl2、CdCl2、AgNO3、CuCl2的HEPES溶液至最终金属离子的浓度为20μM，测定记录其荧光强度的变化(图6)，通过图6中可以看出，该荧光探针具有非常好的汞离子专一选择性。
实施例9
对实施例1中所述的罗丹明B双硫类荧光探针在细胞内对汞离子进行检测成像分析：首先，将10μM荧光探针I的二甲基亚砜(DMSO)溶液分别加入到同等两份含有人肾近曲小管上皮细胞HK-2(购自上海复蒙基因生物科技有限公司)的细胞培养基DMEM(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)中，37℃下孵育30分钟，吸出培养液，并用PBS缓冲溶液(0.01M、pH7.4)冲洗三次，再加入新的DMEM培养液，其中一份加入含20μM的高氯酸汞HEPES缓冲液，37℃下孵育30分钟后，分别进行激光共聚焦显微成像，如图7，从图7中可以看出，该荧光探针可以在细胞内对汞离子实现很好的检测响应，获得良好的细胞成像图，图7c，并具有良好的细胞渗透率，无明显的细胞毒性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于检测水相介质和细胞内汞离子的罗丹明B双硫类荧光探针，其特征在于：其结构式如式Ⅰ所示：
2.权利要求1所述的用于检测水相介质和细胞内汞离子的罗丹明B双硫类荧光探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)2-溴代苯乙酮与1-吡咯啶二硫羧酸铵在丙酮溶液中室温搅拌至反应终止，除去溶剂后，无水乙醇重结晶得白色固体；得到双硫中间体-Ⅰ，其结构式如式II所示：
(2)氮气保护下，将步骤(1)得到的双硫中间体-Ⅰ重新溶于无水乙醇与四氢呋喃的混合溶剂中，于此溶液中加入水合肼，回流至反应终止，除去溶剂，无水乙醇重结晶得白色固体，得到双硫中间体-II，其结构式如式Ⅲ所示：
(3)氮气保护下，将罗丹明B与三氯氧磷回流反应，移去溶剂，得罗丹明B酰氯中间体；将此罗丹明B酰氯中间体溶于干燥的二氯甲烷，得溶液A；将步骤(2)获得的双硫中间体-II溶于干燥的二氯甲烷，得溶液B；将溶液B缓慢滴加到溶液A中，再向此混合溶液中滴加三乙胺，室温搅拌至反应终止，移去溶剂，得红色粗产品，即罗丹明B双硫类荧光探针。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的2-溴代苯乙酮与1-吡咯啶二硫羧酸铵的摩尔比为1：(1～1.5)。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的无水乙醇与四氢呋喃的混合溶剂是无水乙醇与四氢呋喃按照体积比1:(1～5)进行混合得到。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的水合肼的用量为双硫中间体-Ⅰ的5～10倍摩尔当量。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的反应终止，用薄板层析法、气相色谱-质谱联用仪或液相色谱-质谱联用仪检测。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的回流反应的时间为3～5h。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的罗丹明B酰氯中间体与双硫中间体-II的摩尔比为1：(0.9～1.1)。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的三乙胺的用量为双硫中间体-II的10～20倍摩尔当量。
10.权利要求1所述的用于检测水相介质和细胞内汞离子的罗丹明B双硫类荧光探针在水相介质和细胞中汞离子检测中的应用。
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