CN111100476B - 一种pH荧光探针的合成及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含氨基荧光显影剂在酸性条件下显影或成像，同时在细胞成像、荧光成像中的应用。所述化合物结构如下式：
制备方法是将氟硼荧光染料A溶于DMF，将SnCl2·2H2O的浓HCl溶液加入到上述溶液中，常温搅拌10‑12h，点板监测反应至原料完全反应，得到反应液；将反应液加碱中和，抽滤后得到粗产品，柱层析得到目标产物I；该探针的合成只需要一步就可以完成，且后处理过程简单。荧光探针响应时间短、灵敏度高、稳定性好，pH值越低，荧光越强。
Description
技术领域
本发明公开了一种检测pH值的荧光分子探针化合物的合成和应用，该化合物可以广泛应用在生物成像、生物传感器和材料科学生物细胞分析等领域。
背景技术
荧光成像技术采用荧光基团，包括无机材料，量子点等，有机材料，如绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白，或荧光染料等进行标记。荧光成像是利用激发光使得荧光基团达到较高的分子能级水平，然后发射出波长更长的可见光，形成体内生物光源，进行检测。目前常用的荧光基团为各种小分子荧光染料、绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白等。近年来，荧光技术已在进行一些分子生物学以及小分子体内代谢研究中得到了广泛的应用。波长较长的荧光团在受光激发时能够避开生物体内小分子化合物的荧光干扰，信噪比高，便于准确检测，长波长更有利于深入细胞组织内部。通过选择性的接入具有不同功能的基团可以来调节染料的吸收波长等光学性质、稳定性和化学性质。
然而，到目前为止，缺乏对荧光分子的充分设计及合理路线的优化，而且存在结构单一的问题，因此，从原料出发，通过简单的合成路线，制备出新型荧光化合物是亟待解决的难题。开发出一种母核为七元环的氟硼染料在酸性条件下能使细胞稳定成像有重要的意义，在细胞成像和荧光传感等方面有广泛的应用。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种荧光探针，是一种对酸性pH值敏感的荧光染料，其本身荧光强度很低，但在酸性条件下，氨基与质子结合，使得该结构由供电基团-氨基变为吸电基团-质子化氨基，导致整个分子PET受限，因此化合物的荧光强度升高。故能有效的测定细胞中酸性溶液pH值的变化。
本发明还提供了一种根据荧光强度来检测pH的探针化合物，并作为显影剂进入活细胞在酸性条件下成像，在荧光传感、细胞成像和光动力治疗中光敏剂等方面有广泛应用。
所述化合物结构如下式：
合成所述的一种能检测pH值的荧光探针的合成方法，所述方法包括以下合成路径：
所述方法包括以下步骤：
(1)氟硼荧光染料A溶于DMF，称取SnCl2·2H2O溶于质量浓度为37％的浓盐酸中，加入上述溶液中，常温搅拌10-12h，点板监测反应至原料完全反应，得到反应液。
(2)将(1)中的反应液加碱中和，抽滤后得到粗产品，柱层析得到目标产物I。所述步骤(1)中化合物A和SnCl2·2H2O的投料摩尔比1：1-10；SnCl2·2H2O：浓盐酸投料摩尔比为1：1-100。
使用氯化亚锡做还原剂将取代硝基还原为氨基，比起钯碳等贵金属还原剂成本低，经济效果好；铁粉和锌粉做还原剂反应比较剧烈，放出大量的热，并且后续处理分离困难。而使用氯化亚锡，具有成本低，产率高，反应温和，操作简单，产物容易分离的优点。DMF与水互溶，可以用水重结晶，抽滤得到粗产品，分离更简单。使用乙醇做溶剂，副产物较多，目标产物收率低。
加入盐酸和氯化亚锡发生配合反应，使还原剂的还原性增强。而硝基作为可离去基团，盐酸浓度高容易发生亲核取代，不能全部还原为目标产物。
(3)所述的荧光探针I作为pH探针在检测细胞的酸性溶液的应用。
(4)所述的荧光探针I作为细胞显影剂使用。
本发明的有益效果如下：
该探针的合成只需要一步就可以完成，且后处理过程简单。化合物本身没有荧光，但是在低pH荧光强度增大，pH值越低，荧光越强。对pH值响应时间短、灵敏度高、稳定性和可逆性好。在酸性条件下，培养的T24细胞有良好的细胞成像效果。
附图说明
图1是实施例1中制备得到的探针的1HNMR图谱。
图2是实施例1中制备得到的探针的13CNMR图谱。
图3是实施例1中制备得到的探针的HRMS图谱。
图4是实施例5中探针检测pH的荧光光谱。
图5是实施例6中探针溶液和试纸的显色，其中(a)为不同pH值的探针溶液在自然光下的显色；其中(b)为不同pH值的探针溶液在紫光灯下的显色；其中(c)为试纸条在紫光灯下的显色，1为中性试纸条，2为暴露于HCl气体的试纸条，3为暴露于Et3N气体中的试纸条。
图6是实施例7中探针的响应时间和重复性测试荧光光谱变化图。
图7是实施例8中探针的金属离子选择性测试光谱变化图。
图8是实施例9中细胞成像图，其中(a)为在4.0pH值环境下空白对照组； (b)为在4.0pH值环境下用探针溶液孵育的T24细胞；(c)为在7.4pH值环境下空白对照组；(d)为在7.4pH值环境下用探针溶液孵育的T24细胞。
具体实施方式
下面结合实施例来进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
实施例1探针分子的合成
取氟硼荧光染料A(3.13g,10mmol)溶于DMF(150ml)中，并取SnCl2·2H2O (3.38g，15mmol)溶于浓盐酸(50ml)中，加入上述溶液中，常温搅拌12h，点板监测反应至原料完全反应，加氢氧化钠中和至pH值为7.0，抽滤后得到粗产品，柱层析得到化合物I1.94g，产物收率为65％，纯度为99.9％。
实施例2探针分子的合成工艺如实施例1
取氟硼荧光染料A(1.57g,5mmol)溶于DMF(150ml)中，并取SnCl2·2H2O (3.38g，15mmol)溶于浓盐酸(50ml)中，加入上述溶液中，常温搅拌12h，点板监测反应至原料完全反应，加氢氧化钠中和至pH值为7.0，抽滤后得到粗产品，柱层析得到化合物I1.27g，产物收率为85％，纯度为99.9％。
增大SnCl2·2H2O的投料比，使氟硼荧光染料A被完全还原化合物I，产品收率提高。
实施例3探针分子的合成工艺如实施例1
取氟硼荧光染料A(1.57g,5mmol)溶于DMF(150ml)中，并取SnCl2·2H2O (1.69g，7.5mmol)溶于浓盐酸(50ml)中，加入上述溶液中，常温搅拌12h，点板监测反应至原料完全反应，加氢氧化钠中和至pH值为7.0，抽滤后得到粗产品，柱层析得到化合物I0.82g，产物收率为55％，纯度为99.9％。
减少SnCl2·2H2O的投料比，氟硼荧光染料A还未完全还原为化合物I，产品收率降低。
实施例4探针分子的合成工艺如实施例1
取氟硼荧光染料A(1.57g,5mmol)溶于DMF(150ml)中，并取SnCl2·2H2O (1.69g，7.5mmol)溶于HCl(75ml)中，加入上述溶液中，常温搅拌12h，点板监测反应至原料完全反应，加氢氧化钠中和至pH值为7.0，抽滤后得到粗产品，柱层析得到目化合物I0.75g，产物收率为50％，纯度为99.9％。
盐酸浓度过高，取代硝基发生亲核反应，氟硼荧光染料A未完全还原为化合物I，产生较多副产物，产品收率降低。
实施例5检测上述实施例制备得到的化合物2对不同的pH值响应
取实施例1制备的化合物I2.9mg溶解在1LCH3CN中，配置成化合物浓度为 10μM/L探针溶液。
以体积比为1:6的比例将CH3CN和PBS缓冲液混合，用氢氧化钠和盐酸将 pH值用氢氧化钠和盐酸将pH值调节为7.5，溶液命名为测试溶液1；
以体积比为1:6的比例将CH3CN和PBS缓冲液混合，用氢氧化钠和盐酸将 pH值用氢氧化钠和盐酸将pH值调节为7.0，溶液命名为测试溶液2；
以体积比为1:6的比例将CH3CN和PBS缓冲液混合，用氢氧化钠和盐酸将 pH值用氢氧化钠和盐酸将pH值调节为6.5，溶液命名为测试溶液3；
以体积比为1:6的比例将CH3CN和PBS缓冲液混合，用氢氧化以体积比为 1:6的比例将CH3CN和PBS缓冲液混合，用氢氧化钠和盐酸将pH值用氢氧化钠和盐酸将pH值调节为6.0，溶液命名为测试溶液4；
以体积比为1:6的比例将CH3CN和PBS缓冲液混合，用氢氧化钠和盐酸将 pH值用氢氧化钠和盐酸将pH值调节为5.5，溶液命名为测试溶液5；
以体积比为1:6的比例将CH3CN和PBS缓冲液混合，用氢氧化钠和盐酸将 pH值用氢氧化钠和盐酸将pH值调节为5.0，溶液命名为测试溶液6；
以体积比为1:6的比例将CH3CN和PBS缓冲液混合，用氢氧化钠和盐酸将 pH值用氢氧化钠和盐酸将pH值调节为4.5，溶液命名为测试溶液7；
以体积比为1:6的比例将CH3CN和PBS缓冲液混合，用氢氧化钠和盐酸将 pH值用氢氧化钠和盐酸将pH值调节为4.0，溶液命名为测试溶液8；
以体积比为1:6的比例将CH3CN和PBS缓冲液混合，用氢氧化钠和盐酸将 pH值用氢氧化钠和盐酸将pH值调节为3.5，溶液命名为测试溶液9；
以体积比为1:6的比例将CH3CN和PBS缓冲液混合，用氢氧化钠和盐酸将 pH值用氢氧化钠和盐酸将pH值调节为3.0，溶液命名为测试溶液10；
以体积比为1:6的比例将CH3CN和PBS缓冲液混合，用氢氧化钠和盐酸将 pH值用氢氧化钠和盐酸将pH值调节为2.5，溶液命名为测试溶液11；
以体积比为1:6的比例将CH3CN和PBS缓冲液混合，用氢氧化钠和盐酸将 pH值用氢氧化钠和盐酸将pH值调节为2.0，溶液命名为测试溶液12；
取十二支试管，向每支试管中分别加入3ml不同的测试溶液，再向每支试管中加入30μL探针母液。用荧光光谱仪测试探针在不同pH值条件下的荧光光谱变化。荧光光谱变化情况如图4所示。结果显示，随着pH值的降低在520nm处荧光发射增强。
实施例6检测化合物2用作pH探针的有效性
取实施例1制备的化合物I2.9mg溶解在1LCH3CN中，配置成化合物浓度为 10μM/L探针溶液。
以体积比为1:6的比例将CH3CN和PBS缓冲液混合，用氢氧化钠和盐酸将pH值调节为2.5，溶液命名为测试溶液1；以体积比为1:6的比例将CH3CN和PBS 缓冲液混合，用氢氧化钠和盐酸将pH值调节为7.4，溶液命名为测试溶液2。取两个样品瓶，向每个瓶中分别加入3ml两种测试溶液，再向每支瓶中加入30μL 探针母液。比较两瓶液体在自然光下和在365nm紫外光下的不同显色。
在自然光下的结果如图5(a)所示，pH值为7.4的溶液显色为橙色，pH值为2.5的溶液显色为黄色。在365nm紫外光下的结果如图5(b)所示，pH值为 7.4的溶液没有荧光，pH值为2.5的溶液发出明显荧光。
取实施例1制备的化合物I 2.9mg溶解在1LCH3CN中，配置成化合物浓度为10μM/L探针溶液。
将试纸条1浸入探针溶液中30秒；将试纸条2浸入探针溶液中30秒，然后将试纸条2暴露在HCl气体环境下5秒；将试纸条2浸入探针溶液中30秒，然后将试纸条3暴露在Et3N气体中5秒。将三张试纸条至于365nm紫光灯下照射。结果如图5(c)所示，试纸条1没有荧光，试纸条2有明显荧光，试纸条3没有荧光。说明化合物A能有效作为pH探针。
实施例7化合物产生荧光的响应时间和重复性测试
取实施例1制备的化合物I2.9mg溶解在1LCH3CN中，配置成化合物浓度为 10μM/L探针溶液。
以体积比为1:6的比例将CH3CN和PBS缓冲液混合，用氢氧化钠和盐酸将 pH值调节为2.5，溶液命名为测试溶液1；以体积比为1:6的比例将CH3CN和PBS 缓冲液混合，用氢氧化钠和盐酸将pH值调节为3.5，溶液命名为测试溶液2；以体积比为1:6的比例将CH3CN和PBS缓冲液混合，用氢氧化钠和盐酸将pH值调节为7.3，溶液命名为测试溶液3。取三支试管，向每支试管中分别加入3ml 三种测试溶液，再向每支试管中加入30μL探针母液。用荧光光谱仪测试溶液在不同pH值条件下的520nm处的荧光光谱变化，记录变化时间。结果如图6(a) 所示，pH值为2.5时，能在零秒达到其最大荧光强度。pH值为3.5时，能在零秒达到其最大荧光强度。pH值为7.3时，荧光强度为零。
取实施例1制备的化合物I2.9mg溶解在1LCH3CN中，配置成化合物浓度为 10μM/L探针溶液。
以体积比为1:6的比例将CH3CN和PBS缓冲液混合，用氢氧化钠和盐酸将pH值调节为7.4，配置为测试溶液。
向试管中加入3ml测试溶液，再向试管中加入30μL探针母液。采用盐酸溶液将测试pH值逐渐调节到2.5，然后再用氢氧化钠溶液将pH值逐渐调节到 7.4，重复上述操作五次。用荧光光谱仪测试溶液在520nm处的荧光光谱变化。结果如图6(b)所示，溶液荧光强度在每次重复操作中都是先随着pH值的降低而增大，再随着pH值的升高再降低。pH值相同时，荧光强度相差不大，说明探针有很好的重复性。
实施例8化合物对金属离子的选择性的测试
取实施例1制备的化合物I2.9mg溶解在1LCH3CN中，配置成化合物浓度为 10μM/L探针溶液。
以体积比为1:6的比例将CH3CN和PBS缓冲液混合，用氢氧化钠和盐酸将 pH值调节为2.5，溶液命名为测试溶液1；向十支试管中分别加入3ml测试溶液 1，再向每支试管中加入30μL探针母液。将一支试管中的溶液作为空白对照组，向其他九支只试管中分别引入金属离子：Cr3+,Mg2+,Na+,K+,Zn2+,Cu2+,Co2+, Fe2+,Al3+，使每只试管中不同的金属离子浓度均为2nmol/L；用光谱仪测试十支试管中的溶液在478nm的发射光谱变化。平行实验三次。结果如附图7所示，在pH值为2.5时，在发射光谱中未检测到显着变化，不同金属离子对探针的荧光强度没有影响。
以体积比为1:6的比例将CH3CN和PBS缓冲液混合，用氢氧化钠和盐酸将pH 值调节为7.5，溶液命名为测试溶液2；向十支试管中分别加入3ml测试溶液2，再向每支试管中加入30μL探针母液，将一支试管中的溶液作为空白对照组，向其他九支只试管中分别引入金属离子：Cr3+,Mg2+,Na+,K+,Zn2+,Cu2+,Co2+, Fe2+,Al3+，使每只试管中不同的金属离子浓度均为2nmol/L；用光谱仪测试十支试管中的溶液在478nm的发射光谱变化。平行实验三次。结果如附图7，在pH 值为7.5时，在发射光谱中未检测到显着变化，不同金属离子对探针的荧光强度没有影响。
实施例9化合物在不同pH值下的细胞荧光成像
取实施例1制备的化合物I2.9mg溶解在1LCH3CN中，配置成化合物浓度为 10μM/L探针溶液。
将50μL CH3CN加入到5ml体积浓度为1％CH3CN，pH为4.0的磷酸盐缓冲盐水中，命名为空白培养液1；将50μL探针溶液加入到5ml体积浓度为1％ CH3CN，pH为4.0的磷酸盐缓冲盐水中，命名为探针培养液2；将50μL CH3CN 加入到5ml体积浓度为1％CH3CN，pH为7.4的磷酸盐缓冲盐水中，命名为空白培养液3；将50μL探针溶液加入到5ml体积浓度为1％CH3CN，pH为7.4的磷酸盐缓冲盐水中，命名为探针培养液4。
将T24细胞分别在四种培养液培养。30min后取出细胞，用5mlPBS溶液清洗细胞3次以除去残留的培养液，然后将载玻片放在荧光显微镜下，拍得在 480nm处激发的T24细胞的照片。
如附图8，其中(a)为在4.0pH值环境下空白对照，不产生荧光。(b)为在4.0pH值环境下用探针溶液孵育的T24细胞，产生强荧光细胞，细胞稳定成像。 (c)为在7.4pH值环境下空白对照组，不产生荧光。(d)为在7.4pH值环境下用探针溶液孵育的T24细胞，不产生荧光。结果显示，用含探针培养液孵育的 T24细胞在pH值为4.0的条件下能稳定成像，用不含探针溶液孵育的T24细胞和用含探针培养液孵育的T24细胞在pH值为7.4的条件下都不能成像。
上述的实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本申请中的实施例及实施例中的特征在不冲突的情况下，可以相互任意组合。本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围。即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种氟硼荧光染料，其特征在于，该氟硼荧光染料为含氨基的荧光分子探针，该化合物的分子式为C16H16N3BF2，结构式如下所示：
2.根据权利要求1所述的氟硼荧光染料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)氟硼荧光染料A溶于DMF，将SnCl2·2H2O的浓HCl溶液加入到上述溶液中，常温搅拌10-12h，点板监测反应至原料完全反应，得到反应液；
(2)将步骤(1)中的反应液加碱中和，抽滤后得到粗产品，柱层析得到目标产物I；
3.根据权利要求2所述的氟硼荧光染料的制备方法，其特征在于，化合物A与SnCl2·2H2O的投料摩尔比1:1-10。
4.根据权利要求2所述的氟硼荧光染料的制备方法，其特征在于，所述的浓盐酸的质量分数为37％，SnCl2·2H2O：浓盐酸的投料摩尔比为1:1-100。
5.根据权利要求1所述的氟硼荧光染料在制备检测细胞酸性溶液的pH探针上的应用。
6.根据权利要求1所述的氟硼荧光染料在制备细胞显影剂上的应用。
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