CN110229165B - 上转换荧光探针罗丹明衍生物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种上转换荧光探针罗丹明衍生物及其应用，其制备方法包括以下步骤，在氮气氛围和有机溶剂中，将罗丹明B和乙二胺进行反应，得到罗丹明‑乙二胺；再将罗丹明‑乙二胺与异硫氰酸苯酯反应，得到上转换荧光探针罗丹明衍生物；本发明的上转换荧光探针罗丹明衍生物作为荧光探针，具有对汞离子高效的下转换荧光增强响应识别特性，也具有对汞离子高效的上转换荧光增强响应识别特性。
Description
技术领域
本发明属于上转换荧光增强试剂领域和重金属离子上转换荧光探针技术领域，具体涉及一种具有上转换荧光增强响应的罗丹明衍生物探针及其制备方法，以及该探针在检测水环境或生物体中汞离子的应用。
背景技术
汞离子对生物体及自然环境极其有害，对其作出快速高灵敏性的检测具有重要意义。目前，测定汞离子的方法已有不少报道，主要包括：分光光度法、荧光分析法、电化学法和原子吸收光谱法等。其中，荧光分析法因其具有灵敏度高、选择性专一、响应时间短和成本低廉等优点，受到广泛关注。同时，基于罗丹明类荧光分子探针在检测汞离子方面亦备受青睐。
现有的荧光检测汞离子均是采用斯托克斯荧光（即下转换荧光）检测方法，其机理是在短波长光源的激发下，电子从基态的零振动级（S0）跃迁到第一激发态（S1），然后回落至基态并释放出长波长的荧光。可见，斯托克斯荧光（即下转换荧光）的光谱特征是“短波（长）激发，长波（长）发射”。然而，使用反斯托克斯荧光（即上转换荧光）检测方法还鲜见报道。
发明内容
本发明提供一种上转换荧光增强探针RhB-NA及其制备方法；得到的探针分子不但可以通过下转换荧光增强响应来检测汞离子，而且具有上转换荧光增强响应，可以通过上转换荧光增强响应来检测汞离子，在水环境中和生物活体内具有实际应用价值。所谓上转换荧光检测则是采用“长波长激发，短波长发射”，由于以长波长光为激发的光源，可加深激发光源在介质中的穿透深度，有效地消除生物体背景荧光，提高信噪比；同时，由于以长波长光为激发的光源，因其所需激发能量低对生物体细胞伤害小，因此，对活体的生物成像和细胞环境检测具有潜在应用价值；显然，上转换荧光增强检测技术具有更加重要的实际应用价值。
为达上述发明目的，本发明采用的技术方案是：
一种上转换荧光探针罗丹明衍生物，所述上转换荧光探针罗丹明衍生物的分子结构式如下：
本发明公开了上转换荧光探针罗丹明衍生物的制备方法，包括以下步骤，在氮气氛和有机溶剂中，将罗丹明B和乙二胺进行反应，得到罗丹明-乙二胺；再将罗丹明-乙二胺与异硫氰酸苯酯反应，得到上转换荧光探针罗丹明衍生物RhB-NA。
本发明还公开了一种检测溶液中汞离子的方法，包括以下步骤：
（1）在氮气氛和有机溶剂中，将罗丹明B和乙二胺进行反应，得到罗丹明-乙二胺；再将罗丹明-乙二胺与异硫氰酸苯酯反应，得到上转换荧光探针罗丹明衍生物；
（2）将上转换荧光探针罗丹明衍生物加入溶液中，用激发光照射溶液，如果检测到发射光荧光增强响应，则溶液中含有汞离子。
本发明中，发射光荧光增强响应为常规术语，可以理解为荧光强度显著增强超过5倍。
本发明公开了上述上转换荧光探针罗丹明衍生物在检测溶液中汞离子中的应用。
本发明中，所述有机溶剂为乙醇、乙腈、二氯甲烷中的一种或者几种；溶剂体系有利于原料的溶解、反应的进行和产率的提高。罗丹明B和乙二胺进行反应的反应温度为50~120℃，优选80℃，反应时间为24h；罗丹明-乙二胺与异硫氰酸苯酯反应的反应温度为50~120℃，优选80℃，反应时间为24h。罗丹明B和乙二胺的摩尔比为1:5；罗丹明-乙二胺和异硫氰酸苯酯的摩尔比为1:3。
本发明中，检测溶液中汞离子时，激发光的波长为655nm，发射光的波长为560~640nm。
本发明中，所述检测溶液中汞离子时，溶液为中性溶液，pH=7。
本发明在氮气氛和有机溶剂中，以罗丹明B为原料，先后与乙二胺、异硫氰酸苯酯进行回流反应，最终得到荧光探针分子RhB-NA。
上述技术方案中，在罗丹明-乙二胺与异硫氰酸苯酯反应结束后，旋转蒸发去除溶剂，通过柱层析和真空干燥得到荧光探针RhB-NA，为淡红色粉末。
本发明上转换荧光探针罗丹明衍生物RhB-NA具体合成方法为，以乙醇为溶剂，在氮气氛围下将摩尔比为1:5的罗丹明B（RhB）和乙二胺混合，搅拌反应得到RhB-乙二胺；然后在氮气氛围下，将摩尔比为1:3的RhB-乙二胺与异硫氰酸苯酯混合搅拌反应，最后得到淡红色RhB-NA探针分子。反应方程式可表示如下：
本发明至少具有如下技术效果和优点：
本发明的探针RhB-NA制备和提纯方法简单且产率较高；在中性介质中（水/乙醇，2/1，v/v）可高选择性地检测出Hg2+，检测限达4.27×10-7 mol·L-1；本发明采用单光子上转换（OPA-UC）荧光检测方法对汞离子进行检测，检测限达1.09×10-6 mol·L-1。OPA-UC具有长波长激发短波长发射的特点，若在生物体中检测能有效扣除生物体背景荧光且所需激发能量较低，具有对生物体细胞伤害小且检测分辨率强。，对活体的检测杀伤力小使其在生物成像、细胞环境检测具有潜在应用价值。OPA-UC检测所用仪器为小型半导体激光器和光纤光谱仪，无需常规的大型荧光光谱仪器，因此，OPA-UC检测显示出更加经济和便携。从而使得上转换检测技术更具实际应用价值。
附图说明
图1为中间体RhB-乙二胺的核磁氢谱（溶剂CD3Cl）；
图2为中间体RhB-乙二胺质谱图；
图3为探针分子（RhB-NA）的核磁氢谱（溶剂：氘代DMF）；
图4为探针分子（RhB-NA）的质谱图；
图5为探针（RhB-NA）吸收光谱(a)和荧光光谱(b) (浓度：10 μmol·L-1，缓冲水溶液/乙醇：2/1，v/v)；
图6为在pH=1~14时，RhB-NA下转换荧光光谱（a）和590 nm处荧光强度（b）（其中，探针浓度10 μmol·L-1，缓冲水溶液/乙醇：2/1，v/v，激发波长：313 nm）；
图7为加入15种金属阳离子后，探针（RhB-NA）的下转换荧光增强光谱（a）和相应的荧光响应变化柱状图（b，纵坐标I/I0为加入Hg2+前后探针在580 nm荧光强度比值）（其中，阳离子浓度100 μmol·L-1，探针浓度10 μmol·L-1，缓冲水溶液/乙醇：2/1，v/v）；
图8为加入15种金属阳离子后，探针（RhB-NA）的上转换荧光增强光谱（a）和相应的上转换增强响应柱状图（b，纵坐标IUC/I0为加入Hg2+前后探针在620 nm上转换荧光强度比值）（其中，阳离子浓度100 μmol·L-1，探针浓度100 μmol·L-1，缓冲水溶液/乙醇：2/1，v/v）；
图9为加入不同浓度的汞离子（0~10 μmol·L-1），RhB-NA下转换荧光光谱（a）与相应的工作曲线（b，纵坐标I/I0为加入Hg2+前后探针在580 nm荧光强度比值）（其中，探针浓度10 μmol·L-1，缓冲水溶液/乙醇：2/1，v/v，激发波长313 nm）；
图10为加入不同浓度的汞离子（0~100 μmol·L-1），RhB-NA上转换荧光光谱（a）与相应的工作曲线（b，纵坐标IUC/I0为加入Hg2+前后探针在600 nm荧光强度比值）（其中，探针浓度100 μmol·L-1，缓冲水溶液/乙醇：2/1，v/v，激发波长655 nm）；
图11为加入不同浓度的汞离子（a为0 μmol·L-1， b为50 μmol·L-1），Rh110-NA上转换荧光光谱（其中，探针浓度100 μmol·L-1，缓冲水溶液/乙醇：2/1，v/v，激发波长655nm）；
图12为加入50 μmol·L-1的汞离子RhB-TU上转换荧光光谱（其中，探针浓度100 μmol·L-1，缓冲水溶液/乙醇：2/1，v/v，激发波长655 nm）；
图13为加入汞离子（汞浓度折合为10 μmol·L-1），随着时间增加RhB-NA荧光光谱（其中，探针浓度10 μmol·L-1，缓冲水溶液/乙醇：2/1，v/v）。
具体实施方式
有机上转换发光（up-conversion, UC）通常是通过双光子吸收机制（TPA-UC）或三线态湮灭（TTA-UC）机制来实现的；本发明采用的是单光子吸收机制的上转换（OPA-UC）则是另一种独特的发光机制，鲜见报道。单光子吸收上转换（OPA-UC）机理是电子从基态的热活化振动-转动能级（St）跃迁到第一激发态（S1），然后回落至基态并发出荧光。与TPA-UC和TTA-UC相比，OPA-UC的优势在于，除了具有穿透深度大和对活体伤害小等优势外；OPA上转换所需的激发光源强度较小，所需上转换检测设备价格低廉便携；同时，所需探针的浓度较小，空气中即可检测，因而具有更强的实用性。
实施例一
在250 mL的三口烧瓶中加入罗丹明B（2 g，4.2 mmoL）、乙二胺（1 mL，21mmoL）和50mL无水乙醇，超声将其溶解；80℃加热回流，反应过程点板跟踪，展开剂为甲醇：二氯甲烷=10:1，反应进行至24h，停止反应，冷却至室温；减压蒸馏除去乙醇得到褐色固体混合物，通过柱层析方法提纯产物，展开剂为甲醇/二氯甲烷 (10/1，v/v)。得到褐色的中间产物罗丹明B-乙二胺1.5 g （产率：70%）。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.91 (dd, J = 5.6, 3.1Hz, 1H), 7.46 (dt, J = 7.2, 3.7 Hz, 2H), 7.10 (dd, J = 5.6, 3.0 Hz, 1H),6.51-6.24 (m, 6H), 3.35 (q, J = 7.2 Hz, 8H), 3.21 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.47(t, J = 6.5 Hz, 2H), 1.18 (t, J = 7.0 Hz, 12H) （见附图1）。MS，计算值：[M+] =484.26，测试值：[M++H] = 485.29 （见附图2）。
称取上述罗丹明B-乙二胺（1 g，2.1 mmoL）和异硫氰酸苯酯（0.85 g，6.3 mmoL）于100 mL三口烧瓶中，加入乙腈，超声使其溶解；在混合溶液中鼓入氮气15分钟，在氮气氛围下，80℃加热回流；反应过程点板跟踪，展开剂为乙酸乙酯/二氯甲烷（8/1，v/v）。反应进行至24h，停止反应，冷却至室温；加圧蒸留除去乙腈得到固体混合物，通过柱层析方法提纯产物，展开剂为乙酸乙酯/二氯甲烷（8/1，v/v）。得到0.5g淡红色的探针分子RhB-NA（产率：45%）。1H NMR (400 MHz, DMF-d) δ 9.74 (s, 1H), 8.09-7.93 (m, 1H), 7.84-7.15 (m,8H), 6.62 (q, J = 2.1 Hz, 6H), 4.30 (q, J = 5.3 Hz, 1H), 3.63-3.39 (m, 12H),1.31 (t, J = 7.0 Hz, 12H) （见附图3）。MS，计算值：[M+] = 619.27，测试值：[M++H] =620.30 （见附图4）。
实施例二
将探针分子RhB-NA加入乙醇中，配置RhB-NA乙醇母液，浓度为1mM。
在石英比色皿中加入3 mL乙醇/缓冲溶液（缓冲溶液为Na2HPO4/NaH2PO4水溶液，pH=7，1/2，v/v），再取30 μL RhB-NA乙醇母液（浓度：1mM）加入至上述石英比色皿中，超声使其溶解，即配制成了10 μM的探针RhB-NA溶液。
类似地，在石英比色皿中加入3 mL乙醇/缓冲溶液（Na2HPO4/NaH2PO4水溶液，pH=7，1/2，v/v），再取300 μL RhB-NA乙醇母液（浓度：1mM）加入至上述石英比色皿中，超声使其溶解，即配制成了100 μM的探针RhB-NA溶液。
测试仪器与条件
下转换测试：用爱丁堡荧光光谱仪器测试，激发波长313 nm。
上转换测试，选用655 nm半导体激光器作为激发光源，光纤光谱仪作为信号接收和处理设备。
探针（RhB-NA）溶液的吸收光谱和荧光光谱
图5 为探针（RhB-NA）吸收光谱(a)和荧光光谱(b) (浓度：10 μmol·L-1，缓冲液/乙醇：2/1，v/v)；在中性介质中测得探针的吸收光谱和荧光光谱。可见，探针的吸收峰位为313 nm （附图5a）；用313 nm波长的光激发探针溶液，其荧光光谱很弱，峰位在~524 nm（附图5b）。
对探针（RhB-NA）荧光光谱的影响
在盛有RhB-NA乙醇溶液（10 μmol·L-1）的14个比色皿中分别加入定量的pH为1~14的水溶液。测试加入前后体系（乙醇/水，1/2， v/v）的荧光光谱图（激发波长为313nm）。当体系pH=1~3强酸环境下，探针RhB-NA具有较强的荧光，这表明在强酸体系中探针RhB-NA打开内螺环发生开环，恢复大π共轭结构进而荧光增强；而体系pH在4~14时，体系荧光并没有发生明显变化，这说明探针RhB-NA在较宽的pH范围内能够稳定存在，见附图6（a, b）所示。
探针（RhB-NA）对Hg2+的上转换与下转换响应
下转换荧光响应：在15个盛有探针RhB-NA（10 μmol·L-1）的溶液（乙醇/缓冲液 1/2，pH=7）的比色皿中，分别加入15种金属阳离子水溶液（浓度为100 μM），它们是：Hg2+、Cu2+、Mn2+、NH4 +、Zn2+、Mg2+、Cd2+、Pb2+、Li+、Na+、K+、Ca2+、Ni2+、Co2+和Fe2+。然后测定下转换荧光光谱（激发波长为313 nm），见附图7（a, b）所示。可见，Hg2+的加入使探针RhB-NA的荧光强度显著增强近1个数量级（10倍），其余14种金属阳离子几乎不变化，显示出探针RhB-NA对Hg2+具有明显的选择性荧光响应。
上转换荧光响应：在15个盛有探针RhB-NA（100 μmol·L-1）的溶液（乙醇/缓冲液,1/2，pH=7）的比色皿中，分别加入15种金属阳离子水溶液（浓度为100 μM），它们是：Hg2+、Cu2 +、Mn2+、NH4 +、Zn2+、Mg2+、Cd2+、Pb2+、Li+、Na+、K+、Ca2+、Ni2+、Co2+和Fe2+。然后测定上转换荧光光谱（激发波长为655 nm），见附图8（a, b）所示。可见，Hg2+的加入使探针RhB-NA的荧光强度显著增强2个数量级（100倍），其余14种金属阳离子变化很小。显示出探针RhB-NA对Hg2+具有更高的选择性上转换荧光响应。
探针（RhB-NA）对Hg2+浓度的响应
下转换荧光响应：在探针RhB-NA（10 μmol·L-1）溶液（乙醇:缓冲液=1:2，PH=7）中加入不同浓度的Hg2+，观察探针RhB-NA下转换荧光光谱的变化（激发波长313 nm），见附图9a所示。可见，未加入Hg2+时探针RhB-NA的荧光很弱，当加入30 μLHg2+水溶液（10 mmol·L-1）于上述探针溶液中（Hg2+浓度折合为100 μmol·L-1）时，探针RhB-NA荧光强度急剧增强，荧光峰位红移至580 nm（见附图9a）。
按类似方法，分别加入3 μL~30 μL Hg2+水溶液（1 mmol·L-1）于上述探针溶液中（Hg2+浓度折合为1~10 μmol·L-1，其中，附图9a中曲线ⅰ的Hg2+浓度为1 μmol·L-1，曲线的ⅱHg2+浓度为2 μmol·L-1，曲线ⅲ~ⅹ的Hg2+浓度依次为3~10 μmol·L-1））时，探针RhB-NA荧光强度不断地增强（见附图9b）。由附图9b可见，在Hg2+浓度0~10 μmol·L-1范围内，其荧光强度与Hg2+浓度呈现出很好的线性关系，相关系数R2=0.994。根据公式“检测限=3δ/k”可计算出利用荧光光谱检测Hg2+的检测限为4.27×10-7 mol·L-1。
上转换荧光响应：在探针RhB-NA（100 μmol·L-1）溶液（乙醇:水=1:2，PH=7）中加入不同浓度的Hg2+，观察探针RhB-NA下转换荧光光谱的变化（激发波长655 nm），见附图10a所示。可见，未加入Hg2+时探针RhB-NA的荧光很弱，当加入30 μLHg2+水溶液（10 mmol·L-1）于上述探针溶液中（Hg2+浓度折合为100 μmol·L-1）时，探针RhB-NA荧光强度急剧增强，荧光峰位蓝移至600 nm（见附图10a）。
按类似方法，分别加入3 μL~30 μL Hg2+水溶液（10 mmol·L-1）于上述探针溶液中（Hg2+浓度折合为25~100 μmol·L-1，其中，附图10a中曲线ⅰ的Hg2+浓度为25 μmol·L-1，曲线ⅱ的Hg2+浓度为50 μmol·L-1，曲线ⅲ的Hg2+浓度为100 μmol·L-1，曲线ⅳ的Hg2+浓度为100μmol·L-1）时，探针RhB-NA荧光强度不断地增强（见附图10b）。由附图10b可见，在Hg2+浓度0~100 μmol·L-1范围内，其荧光强度与Hg2+浓度呈现出很好的线性关系，相关系数R2=0.991。根据公式“检测限=3δ/k”可计算出利用荧光光谱检测Hg2+的检测限为1.09×10-6 mol·L-1。
将实施例一的罗丹明B更换为罗丹明110，其余不变，得到如下结构式的探针：
采用上述下转换荧光响应、上转换荧光响应的方法对Rh110-NA进行检测，发现其对汞离子具有下转换荧光响应，而不具有上转换荧光响应见附图11。
将实施例一的乙二胺更换为三亚乙基四胺，其余不变，得到RhB-TU探针，为现有材料，具备下转换响应，经过测试发现其不具备上转换响应，见附图12。
探针RhB-NA对汞离子荧光响应时间
在探针RhB-NA（10 μmol·L-1）的溶液（乙醇:水=1:2，PH=7）中加入Hg2+（Hg2+浓度折合为10 μmol·L-1），每隔1min测试一次其荧光光谱，观察探针RhB-NA的荧光光谱变化。见附图13的时间响应谱图，随着时间增加探针RhB-NA的荧光逐渐增强，在0~2min其荧光强度迅速增加，2~13min其荧光强度增加缓慢，13min~其荧光强度基本不再发生变化。这表明探针RhB-NA可以对Hg2+实现快速响应。
Claims (3)
1.一种检测溶液中汞离子的方法，包括以下步骤：
（1）在氮气氛和有机溶剂中，将罗丹明B和乙二胺进行反应，得到罗丹明-乙二胺；再将罗丹明-乙二胺与异硫氰酸苯酯反应，得到上转换荧光探针罗丹明衍生物；
（2）将上转换荧光探针罗丹明衍生物加入溶液中，用激发光照射溶液，如果检测到发射光荧光增强响应，则溶液中含有汞离子；
所述上转换荧光探针罗丹明衍生物的分子结构式如下：
激发光的波长为655nm，发射光的波长为560~640 nm。
2.根据权利要求1所述检测溶液中汞离子的方法，其特征在于：溶液为中性溶液。
3.上转换荧光探针罗丹明衍生物在检测溶液中汞离子中的应用；所述上转换荧光探针罗丹明衍生物的分子结构式如下：
其特征在于，检测汞离子时，激发光的波长为655nm，发射光的波长为560~640 nm；检测汞离子时，溶液为中性溶液。
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