CN108250188B - 一种检测铜离子的长波长荧光探针及其合成方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种长波长检测铜离子的荧光探针及其合成方法和应用，属于化学分析检测技术领域。本发明探针由三氰呋喃大π体系与吡啶甲酸缩合得到，具有如下结构：

此探针的荧光团为三氰呋喃大π体系骨架结构，对铜离子的响应基团为吡啶甲酸酯单元。单独的探针在溶液中的紫外吸收峰位于~400nm，呈黄色，在红光波段无荧光发射。与铜离子反应后，其紫外吸收峰红移至~590 nm，溶液由黄色变为蓝色，在红光波段~610 nm处有强荧光发射。该探针分子对铜离子有高的选择性和灵敏度，检测范围为0.1–5μmol·L^‑1，检测限为54 nmol·L^‑1。该探针可用于水体中及细胞内铜离子的检测。

Description

一种检测铜离子的长波长荧光探针及其合成方法与应用

技术领域

本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及一种长波长检测铜离子的荧光探针及其合成方法和在检测铜离子方面的应用。

背景技术

铜是人体的第三大必须微量元素，在很多生理过程中起到非常重要的作用，如维持蛋白的功能结构，参与细胞呼吸作用、基因表达及相关金属酶催化反应。但另一方面，铜含量的异常及代谢的紊乱会导致与一系列神经退行性疾病(如阿尔茨海默病、帕金森病、朊病毒病等)相关的氧化应激反应。美国国家环境保护局规定了铜离子的安全限量值为1.3ppm(20μmol·L^-1)。鉴于铜离子的重要生理和病理功能，因此，开发高灵敏、高选择检测铜离子的方法是非常必要的。

传统检测铜离子的方法主要有原子吸收光谱法(GonzálesA.P.S.Anal.Chim.Acta 2009,636,198.)，原子发射光谱法(Liu Y.Talanta 2005,68,25.)，电感耦合等离子体质谱法(Wu J.Anal.Chem.1997,69,2464.)，比色法(ShiraishiY.ACS Appl.Mater.Interfaces 2013,5,3454.)及伏安法(Pathirathnap.PAnal.Chem.2012,84,6298.)。但这些方法一般都耗时较长、涉及复杂繁琐的样品处理过程或需要昂贵的精密仪器等。而利用分子探针荧光法检测铜离子具有样品处理简洁、成本低廉及操作简便快速等优点，近年来得到了快速发展与利用。但目前开发的用于检测铜离子的荧光探针分子其激发及发射波长大都在中短波段区域(ChenT.Biosens.Bioelectron.2015,66,259；Yang M.Sens.Actuators B 2014,204,710；ZhangL.Bioorg.Med.Chem.Lett.2013,23,3511.)，这样不利于复杂样品背景干扰的消除，由于波段的光生物穿透能力弱且存在生物损伤性，因此，不利于生物样品的检测。而长波长的荧光探针，特别是激发与发射波长均在长波长处的荧光探针能很好的克服上述问题。

发明内容

对于上述情况，本发明目的是提供一种新的易于制备、性能稳定，抗干扰强的长波长荧光分子探针，并提供该探针的合成方法，还在此基础开发出对铜离子进行高选择性和高灵敏度的检测方法。

为实现本发明目的，本发明利用铜离子特有的反应性质，能选择性地水解吡啶甲酸酯；另一方面基于三氰呋喃为吸电子基团，酚羟基为给电子基团的大π共轭推拉体系具有很好的长波长荧光发射性能，且通过在酚羟基位引入不同的吸电子基团能改变原荧光分子的推拉电子体系的特性从而改变其荧光性质。基于此，设计了一种吡啶甲酸酯为响应基团，大π共轭推拉体系骨架作为发光团的用于检测铜离子的荧光分子探针。

所述检测铜离子的荧光分子探针，其特征在于，结构通式如下：

其中R₁、R₂选自具有1至18个碳原子的烷基链中的任一种；n为具为1、2或3。优选：R₁、R₂选自具有1至6个碳原子的烷基链中的任一种；n为1、2。更优选：R₁、R₂选自具有1至4个碳原子的烷基链中的任一种；n为1。

进一步优选为：

其合成方法具体如下：

将三氰呋喃大π荧光团与吡啶甲酸或其衍生物在有机溶剂中溶解，加入催化剂，在室温下偶联反应，分离纯化后得到探针分子。

其中，R₁，R₂，n同上

吡啶甲酸或其衍生物为：

其中X为Cl、Br或OH；优选：X为Cl、Br。更优选：X为Cl。

所述有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮中的一种或几种。

所述催化剂为三乙胺，4-二甲氨基吡啶，二环己基碳二亚胺，N,N-二异丙基碳二亚胺，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺中的一种或几种。

上述方法中反应时间为0.5-24h。

优选其制备方法如下：

将三氰呋喃大π荧光团与卤代吡啶甲酰在二氯甲烷中溶解后加入三乙胺，室温反应1-4h，减压蒸馏，除去溶剂后分离纯化得到探针分子化合物。

化合物1合成方法如下：

将三氰呋喃大π荧光团与吡啶甲酰氯在二氯甲烷中溶解后加入三乙胺，室温反应，减压蒸馏，除去溶剂后分离纯化得到探针分子化合物。反应流程如下：

利用该分子探针对铜离子进行定性和定量测定，用于水体或生物体系中铜离子的检测。

采用比色法时，将本发明所述分子探针加入待测溶液中，溶液从黄色变蓝色，实现待测样品中铜离子的定性检测。

采用荧光检测时，将本发明所述分子探针溶解于水与二甲基亚砜的混合缓冲体系中，加入不同浓度Cu²⁺溶液，测试其在610nm处的荧光强度，然后以溶液在610nm处荧光发射强度对铜离子的浓度作标准图，根据标准图，定量检测Cu²⁺在待测溶液中的含量。

采用荧光法检测时，所述荧光分子探针对铜离子的检测浓度为0.1–5μmol·L^-1，检测限为54nmol·L^-1。

本发明所述检测铜离子的分子探针的另一种应用方式为通过将细胞生物样品与本发明所述分子探针培育，利用荧光成像的方法对细胞生物样品中的铜离子进行捡测。

本发明所述荧光法检测铜离子的分子探针，优选化合物1，三氰呋喃大π荧光团为荧光信号基团，吡啶甲酸酯为响应基团。将本发明荧光分子探针溶解于水与二甲基亚砜(DMSO)的混合缓冲溶液中，当加入铜离子后，铜离子能催化水解吡啶甲酸酯，从而释放有强ICT(分子内电荷转移)效应的三氰呋喃大π荧光团，使探针溶液紫外吸收发生显著红移(颜色由黄色变为红色)且荧光发射显著增强，室温下便可以对铜离子进行测试。

本发明荧光法检测铜离子的分子探针具体特征如下：

该荧光探针分子具有良好的稳定性和光学性质，反应前最大吸收波长为～400nm，无显著荧光发射；随着铜离子的加入，探针分子紫外光波红移至～590nm处，并在～610nm处呈现及强的荧光发射。

本发明优点：所述的探针分子原料易得，合成产率较高，达63％以上。光学性能稳定(探针可室温稳定存放六个月以上，其光谱性质保持不变)，灵敏度较高，对铜离子识别能力强，检测时溶液由黄色变为红色，可实现裸眼识别，且选择性好，响应速度较快(响应时间10min)，响应范围为0.1–5μmol·L^-1，检测限低(54nM，基于国际纯粹与应用化学联合会给出的3倍空白样品标准差的方法)，因此，该类型探针可用于水体及生物体系中铜离子的检测。

附图说明

图1为本发明合成的分子探针的核磁共振氢谱；

图2为本发明分子探针与铜离子反应前后的紫外谱图A与荧光光谱图B，其中，A图中，1-反应前，2-反应后；B图中，1-反应前，2-反应后；

图3为本发明5μmol·L^-1分子探针在加入不同浓度铜离子后荧光发射光谱图，从a至m，铜离子浓度分别为0、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μmol·L^-1，溶液体系为水与二甲基亚砜的混合缓冲溶液(H₂O/DMSO＝9/1,v/v,10mM磷酸缓冲液,pH 7.4)，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图4为铜离子的浓度标准曲线图，即10μmol·L^-1分子探针，反应前后在610nm处荧光发射强度和铜离子浓度的线性关系；横坐标为铜离子的浓度，纵坐标为荧光强度。

图5为本发明分子探针对铜离子选择性；即10μM本发明分子探针，加入10μmol·L^-1不同离子(Al³⁺、Ag⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Cr³⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Hg²⁺、K⁺、Li⁺、Mg²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Pb²⁺、Sn²⁺、Zn²⁺)后，在610nm处荧光发射强度的变化；横坐标为测试的干扰离子，纵坐标为荧光强度。

图6为本发明探针检测Hela细胞内Cu²⁺的成像图片。(A,B)分别是本发明荧光探针(10μmol·L^-1)培养的HeLa的明场图片和荧光图片；(C,D)分别是本发明荧光探针(10μmol·L^-1)和Cu²⁺(10μmol·L^-1)培养的Hela细胞的明场图片和荧光图片。标尺：50μm。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：荧光分子探针的合成

将三氰呋喃大π荧光团(式II)(200mg,0.66mmol)，吡啶甲酰氯(112mg,0.79mmol)与三乙胺(334mg,3.21mmol)置于容器中，加入溶剂二氯甲烷(20mL)，室温反应1h。待反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，柱层析分离(洗脱剂为二氯甲烷/乙酸乙酯＝3/1的混合溶液)得到产物黄色固体169mg(收率：63％)。产物结构式如下:

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.88(s,1H),8.29(t,J＝10.4Hz,1H),8.07–7.84(m,2H),7.79–7.70(m,2H),7.63(s,1H),7.44(d,J＝7.5Hz,2H),7.04(d,J＝16.4Hz,1H),1.82(s,6H)(see Fig.S1).MS[ESI]:m/z,calcd for[M+H]⁺409.1295；found 409.1287.。

实施例2：探针对铜离子的荧光检测

将上述制得分子探针溶解于水与二甲基亚砜的混合缓冲溶液中(H₂O/DMSO＝9/1,v/v,10mM磷酸缓冲液,pH 7.4))，配制成10μmol·L^-1的探针溶液。在3mL的比色皿中加入2mL配制的10μmol·L^-1的本发明探针溶液，然后分别加入不同浓度的铜离子后均匀混合，测试其荧光光谱，结果如图3所示。以溶液在610nm处荧光发射强度对Cu²⁺的浓度作图，Cu²⁺浓度在0.2–10μmol·L^-1范围内时，两者之间呈现良好的线性关系(图4)，能实现该浓度范围内Cu²⁺的定量检测，而且溶液由黄色变为红色，也适用于裸眼检测。并且此探针不受其它一些常见离子的影响，如：Al³⁺、Ag⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Cr³⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Hg²⁺、K⁺、Li⁺、Mg²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Pb²⁺、Sn²⁺、Zn²⁺。在上述干扰离子存在的条件下，探针对Cu²⁺仍具有良好的选择性和灵敏度(图5)。响应速度较快(时间)。

将细胞与含探针培养液培养后，再与含Cu²⁺的溶液培养。细胞荧光成像可观测到红色荧光(图6)。

可以看出，本发明能实现对铜离子的定性、定量检测，灵敏度高，检测限达54nmol·L^-1，且抗干扰强，并能实现细胞内的铜离子的检测。

Claims (2)

1.一种合成结构式如式II所示的检测铜离子的荧光分子探针的方法，其特征在于，通过如下方法实现：

式I 式II

将式I所述的三氰呋喃大π荧光团与吡啶甲酸或其衍生物在有机溶剂中溶解，加入催化剂，在室温下偶联反应，分离纯化后得到探针分子；

其中：中R₁、R₂选自具有1至18个碳原子的烷基链中的任一种；n为具为1、2或3；X为Cl、Br或OH；

所述有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮中的一种或几种；催化剂为三乙胺，4-二甲氨基吡啶，二环己基碳二亚胺，N,N-二异丙基碳二亚胺，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺中的一种或几种。

2.如权利要求1所述的检测铜离子的荧光分子探针的合成方法，其特征在于，通过如下方法实现：

式I

将式I 所示的三氰呋喃大π荧光团与吡啶甲酰氯在二氯甲烷中溶解后加入三乙胺，室温反应，减压蒸馏，除去溶剂后分离纯化得到探针分子化合物。

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