CN110028471B - 一种香豆素类席夫碱Cu2+荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种香豆素类席夫碱Cu²⁺荧光探针及其制备方法与应用，涉及荧光分子探针领域。本发明的香豆素类席夫碱Cu²⁺荧光探针用于在自来水或河水等环境水体中识别Cu²⁺；本发发明的制备方法包括以7‑羟基香豆素为原料合成中间体7‑羟基‑8‑香豆素醛，在以中间体7‑羟基‑8‑香豆素醛为原料合成香豆素荧光探针。本发明荧光探针对Cu²⁺有专一的选择性，与其他常见离子作用荧光信号基本没有变化，高灵敏度，检测限低。

Description

一种香豆素类席夫碱Cu2+荧光探针及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于荧光分子探针领域，特别是涉及一种香豆素类席夫碱Cu²⁺荧光探针及其制备方法与应用。

背景技术

对大多数生物体而言，Cu²⁺作为一种催化辅助因子对各种金属酶具有重要的作用，如超氧化物歧化酶，细胞色素c氧化酶和络氨酸酶。然而当铜离子的含量超过一定的量，将会表现出铜中毒，导致神经退行性疾病(如老年痴呆症和威尔逊疾病)，产生此病症可能是由于Cu²⁺参与到了活性氧的生产。因此对于环境和生命体中铜离子的检测成为国内外研究人员十分关注的领域。

目前很多分析方法已被用来测定Cu²⁺，如原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法、冷原子荧光光度法、电感耦合等离子体原子发射光谱法、电化学方法以及紫外可见分光光度法等。尽管这些方法的灵敏度比较高，但都具有检测成本高、样品前处理复杂、费时，不适用于实时和现场检测等缺点。由于荧光探针在选择性、检测成本等方面具有绝对的优势，目前设计和使用荧光探针来检测Cu²⁺引起了分析工作者的广泛关注，但现有技术公开的一些Cu²⁺荧光探针具有响应速度慢、PH范围窄、选择性差等缺点。因此，发展一种具有高选择性、高灵敏度且响应速度快的Cu²⁺荧光探针是非常必要的。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种香豆素类席夫碱Cu²⁺荧光探针及其制备方法与应用，该荧光探针结构新颖，应用于检测河水或自来水等环境水体中的Cu^{2 +}，具有灵敏度高、选择性好、响应速度快，且制备简单、成本低廉的优点。

本发明提供了一种香豆素类席夫碱Cu²⁺荧光探针，式I所示结构：

在本发明的实施例中，在缓冲溶液里，加入香豆素类席夫碱Cu2+荧光探针为式I所示化合物溶解二甲亚砜溶剂中配成二甲亚砜标准液(浓度为1mmol/L)以及Cu2+水溶液(浓度为10mmol/L)即可测定荧光光谱，其中，缓冲液为乙醇(EtOH)和羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)水溶液配制而成的，其中EtOH/HEPES (V/V,80:20)。

式I所示化合物在溶剂中的浓度为1.0×10^-5mol/L。

本发明提供了上述香豆素类席夫碱Cu²⁺荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

S1.将化合物2加入乙醇溶剂中，然后缓慢加入水合肼，反应，得到化合物3；

S2.将化合物4与六次甲基四胺在乙酸溶剂中反应，得到化合物5；

S3.将化合物3和化合物5在乙醇溶剂中进行反应，得到式I所示化合物；

上述反应的路线如下式所示：

其中，优选的反应条件如下：

a.水合肼(85％)，乙醇，室温，20～24h；b.六次甲基四胺，乙酸，70～100℃，6～8h；c.乙醇，70～ 90℃，3～5h。

更优选的，步骤S1中化合物2和水合肼的摩尔添加比为1：(4～6)，反应时间为24h。

更优选的，步骤S2中化合物4和六次甲基四胺的摩尔添加比为1：(0.55～0.7)，反应温度为90℃，反应时间为8h。

更优选的，步骤S3中化合物3和化合物5的摩尔添加比为1:(1～1.5)，反应温度为85℃，反应时间为5h。

本发明提供的上述香豆素类席夫碱Cu²⁺荧光探针或上述制备方法制备的香豆素类席夫碱Cu²⁺荧光探针可以应用在环境水体的Cu²⁺荧光检测中，检测的PH为5～10。

检测中，Cu²⁺的检测下限是6.14×10^-7M。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明荧光探针具有香豆素荧光团，分子中C＝N中的N原子和酚羟基上的O原子与Cu²⁺配位络合，实现了PET机理的阻断，出现荧光off-on信号，实现了对Cu²⁺的荧光识别，检测灵敏度高。

2.本发明荧光探针对Cu²⁺有专一的选择性，与其他常见离子作用荧光信号基本没有变化，较高的抗干扰能力，检测限低。

附图说明

图1为实施例1中化合物3的1H-NMR谱图；

图2为实施例1中化合物5的1H-NMR谱图；

图3为实施例1中香豆素类席夫碱荧光探针的1H-NMR谱图；

图4为实施例2中荧光探针对Cu²⁺选择性识别的荧光发射光谱图；

图5为实施例3中荧光探针在不同浓度Cu²⁺存在下荧光发射光谱变化图；

图6为实施例4中荧光探针在Cu²⁺及其他金属离子存在下的荧光发射强度变化图；

图7为实施例5中荧光探针对Cu²⁺的检测限计算图。

图8为实施例6中香豆素类席夫碱Cu2+荧光探针在不同pH下的荧光发射强度变化图

具体实施方式

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的香豆素类席夫碱Cu²⁺荧光探针及其制备方法与应用进行详细描述。

仪器与试剂：

以下所有的荧光测量在Hitachi F-7000荧光光度计上进行；紫外可见光谱的测定是在TU-1901双光束紫外-可见分光光度计上进行；核磁共振光谱在Bruker DRX-400光谱仪上获得(用氘代氯仿和氘代二甲亚砜作溶剂)，溶液的pH值用Mettler toledodelta 320pH计测定。

2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮(化合物2)从上海迈瑞尔化学技术有限公司购得。

水合肼(85％)在上海国药集团有限公司购得。

六次甲基四胺从上海迈瑞尔化学技术有限公购得。

实验过程中所用的水均为去离子水。

除非特别指明外，其它的化学试剂都是分析纯，不需要进一步的纯化和处理，可以直接使用。

实施例1

香豆素类席夫碱Cu²⁺荧光探针的制备：

化合物3的合成：将4.79g(或写成10mmol)的2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮(化合物2)加入到干燥的 100mL单口烧瓶中，并加入50mL乙醇溶解，在磁力搅拌下逐滴加入9mL的水合肼(85％)，继续磁力搅拌 24h后停止反应，过滤得到白色固体，用乙醇彻底洗涤后得到化合物3的白色固体0.55g，产率为24％。

化合物5的合成：将10g(61.6mmol)的7-羟基香豆素(化合物4)和4.8g(33.88mmol)的六次甲基四胺放入100mL的圆底烧瓶中，加入30mL乙酸溶解，加热至90℃，搅拌反应8h后停止反应；降温至70℃，加入50mL的1mol/L的盐酸溶液搅拌调至PH值为2～5；加入冰水，加入乙酸乙酯溶剂萃取，萃取三次，每次加入30mL，再用无水硫酸钠干燥有机相，减压抽滤，滤液减压旋蒸除去溶剂乙酸乙酯，得黄色固体；然后用无水乙醇重结晶黄色固体得1.8g的7-羟基-8-香豆素醛(化合物5)，产率为18％。

式I所示化合物的合成：于50mL乙醇溶液中，加入化合物3(0.456g，2mmol)和化合物5(0.380g， 2mmol)，加热至85℃，搅拌5小时，过滤分离固体产物，用乙醚洗涤以去除杂质，在干燥器中干燥得到式I所示化合物的淡黄色固体0.2g，产率为50％。

分别对化合物3、化合物5和式1所示化合物(香豆素类席夫碱Cu²⁺荧光探针)进行1H-NMR谱图测定，测试结果分别如图1，图2和图3所示。

实施例2

香豆素类席夫碱Cu²⁺荧光探针对Cu²⁺的选择性检测：

配置摩尔浓度为1mmol/L的香豆素类席夫碱荧光探针二甲亚砜标准液；并向其中加入摩尔浓度为10 mmol/L的金属离子溶液；搅拌均匀后15s内检测溶液的荧光发射光谱变化；

其中，金属离子包括：Zn²⁺，Pb²⁺，Ni⁺，Na⁺，Mn²⁺，Zn²⁺，Li⁺，K⁺，Hg²⁺，Fe³⁺，Fe²⁺，Cu²⁺，Cr^{3 +}， Co²⁺，Cd²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Al³⁺，Ag⁺；

如图4所示，荧光探针在548nm处出现了强的发射峰，当加入Cu²⁺后，荧光探针溶液在548nm处几乎没有发射峰，然而加入其他离子，如Al³⁺，Pb²⁺，Ni⁺，Na⁺，Mn²⁺，Zn²⁺，Li⁺，K⁺，Hg^{2 +}，Fe³⁺，Fe²⁺， Mg²⁺，Cr³⁺，Co²⁺，Cd²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Ag⁺后，荧光探针溶液在548nm的发射峰也出现了较强的发射峰，故实验结果表明，只有加入Cu²⁺，才能引起荧光探针溶液在548nm处出现明显的荧光淬灭，该香豆素类席夫碱Cu²⁺荧光探针在EtOH/HEPES(EtOH/HEPES(V/V,80:20)溶液中对Cu²⁺有良好的选择性。

实施例3

香豆素类席夫碱Cu²⁺荧光探针对Cu²⁺的荧光滴定实验：

配置摩尔浓度为1mmol/L的香豆素类席夫碱Cu²⁺荧光探针二甲亚砜标准液3100ml；平均分成31等份，在第1至第31等份中分别加入等当量为0eq、0.05eq、0.1eq、0.15eq、0.2eq、0.25eq、0.3eq、0.35eq、 0.4eq、0.45eq、0.5eq、0.55eq、0.6eq、0.65eq、0.7eq、0.75eq、0.8eq、0.85eq、0.9eq、0.95eq、1.0eq 1.05eq、1.1eq、1.15eq、1.2eq、1.25eq、1.3eq、1.35eq、1.4eq、1.45eq、1.5eq的Cu²⁺，搅拌均匀15s 内检测各试样的荧光发射光谱，结果如图5所示；由图5所知，随着Cu²⁺浓度的逐步增大，探针溶液在548 nm处的荧光强度也逐步降低，当Cu²⁺的浓度达到探针浓度的1.5倍，即1.5mmol/L时，此时荧光强度基本不再降低，滴定达到饱和，故实验结果表明，该香豆素类席夫碱Cu²⁺荧光探针对Cu²⁺具有良好的传感性质。

实施例4

香豆素类席夫碱Cu²⁺荧光探针对Cu2+的识别的竞争实验：

配置摩尔浓度为1mmol/L的香豆素类席夫碱Cu²⁺荧光探针的二甲亚砜标准液；分别加入10mmol/L 的其他金属离子(Pb²⁺，Ni⁺，Na⁺，Mn²⁺，Zn²⁺，Li⁺，K⁺，Hg²⁺，Fe³⁺，Fe²⁺，Mg²⁺，Cr³⁺，Co²⁺，Ca²⁺， Ba²⁺，Cd²⁺，Ag⁺)，搅拌均匀后15s内检测溶液的荧光发射光谱，然后向以上各个含有金属离子的溶液中加入10mmol/L的Cu²⁺，搅拌均匀后15s内检测溶液的荧光发射光谱分别取548nm处的荧光发射强度，作图结果如图6所示。由图6所知，除了一些Al³⁺，Fe³⁺,Fe²⁺和Cr^{3 +}，共存的其他金属离子对Cu²⁺的荧光识别基本没有显著干扰。

实施例5

香豆素类席夫碱Cu²⁺荧光探针对对Cu²⁺的检测限的计算：

检测限根据荧光光谱滴定数据计算。以荧光滴定强度为纵坐标，Cu²⁺的浓度作为横坐标作图，如图7 所示。在Cu²⁺浓度在0×10^-3mmol/L到10×10^-3mmol/L的浓度范围内，运用公式D＝3Sb1/k(Sb1是空白溶液的标准方差，k是拟合直线的斜率)，其中D为检测下限，K＝3，Sb1＝空白溶液的标准偏差，S是校准曲线的斜率。经计算检测下限为6.14×10^-7M。

实施例6

对不同pH值(2.0-12.0)对香豆素类席夫碱Cu²⁺荧光探针荧光强度的影响进行检测，结果见图8，图8 为香豆素类席夫碱Cu2+荧光探针在不同pH下的荧光发射强度变化图；从图8中可以看出，当pH在5到 10之间时香豆素类席夫碱Cu²⁺荧光探针的荧光强度基本保持不变，这表明荧光探针在pH为4.5-12.0时不受pH的影响并且可用于实际样品的检测。当pH小于5时，香豆素类席夫碱Cu2+荧光探针的荧光强度值随着pH的减小而增加，说明此探针在强酸性条件下不适用，这可能是由于酸性条件下羟基不容易去质子化而导致的。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种香豆素类席夫碱Cu²⁺荧光探针，其特征在于，具有式I所示结构：

2.一种权利要求1所述香豆素类席夫碱Cu²⁺荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.将化合物2加入乙醇溶剂中，然后缓慢加入水合肼，反应，得到化合物3；

S2.将化合物4与六次甲基四胺在乙酸溶剂中反应，得到化合物5；

S3.将化合物3和化合物5在乙醇溶剂中进行反应，得到式I所示化合物；

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述化合物2和所述水合肼的摩尔添加比为1：(4～6)。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述反应的温度为室温，反应时间为20～24h。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述化合物4和所述六次甲基四胺的摩尔添加比为1：(0.55～0.7)。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述反应的温度为70～100℃，反应时间为6～8h。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述化合物3和所述化合物5的摩尔添加比为1:(1～1.5)。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述反应的温度为70～90℃，反应时间为3～5h。

9.权利要求1所述的香豆素类席夫碱Cu²⁺荧光探针或权利要求2至8任意一项所述制备方法得到的香豆素类席夫碱Cu²⁺荧光探针在环境水体的Cu²⁺荧光检测中的应用，所述检测的p H为5～10。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述检测中，检测下限是6.14×10^-7mol/L。

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