CN107417675A - 一种新型香豆素类席夫碱衍生物，制备方法及其在铜离子荧光和细胞成像检测中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型香豆素类席夫碱衍生物，制备方法及其在铜离子荧光和细胞成像检测中的应用，属于铜离子荧光探针的合成技术领域。本发明的技术方案要点为：一种新型香豆素类席夫碱衍生物，其结构式为：。本发明还具体公开了该新型香豆素类席夫碱衍生物的制备方法及其在铜离子荧光和细胞成像检测中的应用。本发明的荧光探针能够高选择性地识别铜离子，并且在其它常见离子与铜离子共存时，对其检测几乎没有干扰。在此基础上，应用Leica DMI8倒置荧光显微镜，在肝癌HepG‑2细胞中实现了荧光探针对铜离子的细胞荧光成像，从而建立了一种快速、简便、灵敏且高选择性的铜离子检测方法。

Description

一种新型香豆素类席夫碱衍生物，制备方法及其在铜离子荧 光和细胞成像检测中的应用

技术领域

本发明属于铜离子荧光探针的合成技术领域，具体涉及一种新型香豆素类席夫碱衍生物，制备方法及其在铜离子荧光和细胞成像检测中的应用。

背景技术

铜作为生物体内重要的微量元素，其在细胞中的含量仅次于铁和锌，而铜离子是铜元素的重要存在形式，在机体的生理、生化代谢及多种酶的代谢活动过程均发挥着重要作用。如Cu²⁺常作为催化辅助因子参与线粒体呼吸、铁的吸收以及大量金属酶（包括超氧化歧化酶、多巴胺β-羟化酶、赖氨酰氧化酶、酪氨酸酶和细胞色素氧化酶等）的氧化还原过程。人体血液中铜离子的正常含量为100-150μg/dL（15.7-23.6μmol/L）。合适的Cu²⁺含量是机体维持正常工作的基本保证。如果机体内Cu²⁺浓度过高，会导致一些严重的神经退行性疾病，如阿尔茨海默氏早老性痴呆病（Alzheimer’s disease）、Menkes综合症、Wilaonm综合症、家族性肌萎缩症、家族遗传性脊侧索硬化和朊病毒疾病（Prion diseases）等。如果机体内Cu²⁺浓度过低，可导致生长和代谢的紊乱，易引发白化病、缺铜性贫血和冠心病等。近几年，由于环境污染问题，导致机体长期处于Cu²⁺高浓度状态而引起严重的铜代谢障碍疾病。因此，设计并开发一种快速、简便、灵敏和高选择性的铜离子检测方法，对检测机体及生物环境中Cu²⁺的水平具有重要意义，也使得铜离子荧光探针成为重要的研究课题。

一直以来，金属离子的识别对生命科学和环境科学发展具有重要意义。金属Cu²⁺目前常见的检测方法有电化学分析法、电感耦合等离子体质谱法、火焰原子吸收光谱法、荧光探针法、流动注射分析法和分光光度法等。荧光探针法具有灵敏度高（可实现单分子和单细胞检测）、高选择性、成本低、易操作、分析快速、试样量少及能实现实时原位检测等优点。此外，还可以通过荧光成像技术实现对机体内的铜离子检测，从而被广泛应用到生物化学、细胞生物学和环境科学等领域。目前，基于铜离子的荧光探针相继被报道，但设计并合成新型的探针用于铜离子的快速、简便、灵敏及高选择性测定，对分析工作者来说，还有待进一步研究。

香豆素分子由于具有荧光强度高、光稳定性强、溶解性好、易于制备、较大的摩尔吸光系数和较高的荧光量子产率等特点，在国内外常被用作为发色基团合成高效的荧光探针。本发明以香豆素荧光基团为基础制备铜离子荧光探针，以实现对铜离子的荧光和细胞成像检测。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种新型香豆素类席夫碱衍生物及其制备方法，该方法以香豆素类基团为基础制得铜离子荧光探针，以实现对铜离子的荧光和成像检测。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种新型香豆素类席夫碱衍生物，其特征在于该新型香豆素类席夫碱衍生物的结构式为：

。

本发明所述的新型香豆素类席夫碱衍生物的制备方法，其特征在于具体步骤为：将3-醛基吲唑溶于甲醇中得到溶液A，将香豆酰肼溶于甲醇中得到溶液B，将溶液A和溶液B滴加混合后再滴加乙酸，室温下先搅拌2小时，再在氮气保护下回流反应4小时形成黄色沉淀，点板监测反应，趁热抽滤，并用甲醇洗涤数次即得新型香豆素类席夫碱衍生物。

进一步优选，所述3-醛基吲唑与香豆酰肼的投料摩尔比为1:1，3-醛基吲唑与甲醇的投料配比为1mmol:10mL，香豆酰肼与甲醇的投料配比为1mmol:15mL。

进一步优选，所述香豆酰肼的具体合成过程为：将4-二乙基氨基水杨醛、丙二酸二乙酯和哌啶在无水乙醇中混和，混合液在搅拌条件下回流反应6小时，冷却至室温，旋蒸至乙醇溶剂不再蒸出得到油状液体7-N,N-二甲基氨基-2-氧-2H-3-香豆酸酯，将7-N,N-二甲基氨基-2-氧-2H-3-香豆酸酯溶于乙醇中，再加入质量浓度为80%的水合肼溶液，室温搅拌12分钟后，冰水中冷却15分钟，所得沉淀抽滤，粗产品用硅胶色谱柱提纯即得香豆酰肼。

进一步优选，所述4-二乙基氨基水杨醛、丙二酸二乙酯与哌啶的投料配比为0.04mmol:0.08mmol:4mL，7-N,N-二甲基氨基-2-氧-2H-3-香豆酸酯与水合肼的投料摩尔比为1:4。

本发明所述的新型香豆素类席夫碱衍生物作为荧光探针用于在CH₃CN/HEPES混合体系中从常见金属离子中高选择性识别检测铜离子，所述CH₃CN/HEPES混合体系中CH₃CN与HEPES缓冲溶液的体积比为3:2，CH₃CN/HEPES混合体系的pH优选为5.5-7.5，荧光强度测定条件为激发波长439nm，发射波长483nm。

本发明所述的新型香豆素类席夫碱衍生物作为荧光探针用于活细胞中铜离子的检测。

本发明的荧光探针能够高选择性地识别铜离子，并且在其它常见离子与铜离子共存时，对其检测几乎没有干扰。在此基础上，应用Leica DMI8倒置荧光显微镜，在肝癌HepG-2细胞中实现了荧光探针对铜离子的细胞荧光成像，从而建立了一种快速、简便、灵敏且高选择性的铜离子检测方法。

附图说明

图1是荧光探针1的氢谱图；

图2是荧光探针1的碳谱图；

图3是荧光探针1的高分辨质谱图；

图4是荧光探针1（10μmol/L）对各种金属离子的紫外-可见吸收光谱响应图；

图5是荧光探针1（10μmol/L）对铜离子的紫外-可见光谱滴定图；

图6是荧光探针1（10μmol/L）对各种金属离子的荧光光谱响应图；

图7是荧光探针1（10μmol/L）对铜离子的荧光光谱滴定图；

图8是其它金属离子对荧光探针1（10μmol/L）检测Cu²⁺的竞争性实验图；

图9是荧光探针1（10μmol/L）的水溶性荧光光谱图；

图10是荧光探针1（10μmol/L）的pH值依赖荧光光谱图；

图11是荧光探针1（10μmol/L）的job’s plot曲线图；

图12是荧光探针1对铜离子的细胞荧光成像图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

实施例

1 实验部分

1.1 材料与试剂

4-二乙基氨基水杨醛，丙二酸二乙酯，哌啶，80wt%水合肼，3-醛基吲哚，各种金属离子的高氯酸盐（Cr³⁺、Ag⁺、Fe³⁺、K⁺、Na⁺、Mg²⁺、Pb²⁺、Ca²⁺、Hg²⁺、Mn²⁺、Cd²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Cu²⁺）的水溶液（2.0×10⁻²M），无水甲醇（分析纯），乙腈（分析纯），二甲基亚砜（色谱纯），HEPES缓冲溶液（pH=7.4）等。

1.2 主要仪器

三用紫外分析仪（ZF₇，巩义市予华仪器有限公司）、紫外-可见分光光度计（UV-2600，日本岛津公司）、荧光分光光度计（Specorfluorometer FS5，Edingburgh Inshtruments）、高分辨质谱仪（Ascend^TM 400，美国Bruker公司）、核磁共振波谱仪（Microtof-QIII，美国Bruker公司）、循环水式真空泵（SHZ-D（III），巩义市予华仪器有限公司）、旋转蒸发仪（YRE-5299，巩义市予华仪器有限公司）、超声波清洗器（KQ3200B，昆山市超声仪器有限公司）、真空干燥箱（DZF-6020，上海精宏实验设备有限公司）、电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9246，上海精宏实验设备有限公司）、集热式恒温加热磁力搅拌器（DF-101S，巩义市予华仪器有限公司）、pH计（PHS-3E，郑州泰来仪器设备有限公司）、高速台式离心机（GT10-1，北京时代北利离心机有限公司），倒置荧光显微镜Leica DMI8（德国徕卡公司）。

1.3 方法

1.3.1 香豆素类席夫碱衍生物1（即荧光探针1）的制备

荧光探针1的合成路线及对铜离子的检测机理如下所示：

荧光探针1的合成过程及对铜离子的检测机理

将7.7297g的4-二乙基氨基水杨醛（0.04mol，M_w=193.2423）、12.8134g的丙二酸二乙酯（0.08mol，M_w=160.1678）和4mL哌啶在120mL无水乙醇中混和，混合液在搅拌条件下回流反应6小时，冷却到室温，旋蒸至乙醇溶剂不再蒸出得到少量油状液体化合物3（7-N,N-二甲基氨基-2-氧-2H-3-香豆酸酯）；将4.3399g的化合物3（15mmol，M_w=289.3264）溶于40mL乙醇中，加入3.64mL的质量浓度为80%的水合肼（60mmol），室温搅拌12分钟后，冰水中冷却15分钟，所得沉淀抽滤，粗产品用硅胶色谱柱提纯（流动相为乙酸乙酯）即得产物2（香豆酰肼）。

将3-醛基吲唑（0.1462g，1.0mmol，Mw=146.1460）溶于10mL的甲醇（最少量）中，将香豆酰肼（0.2753g，1.0mmol，Mw=275.3025）溶于15mL的甲醇（最少量）中，将上述两种溶液滴加混合后再加入2滴乙酸，室温下先搅拌2小时，再在氮气保护下回流反应4小时，形成黄色沉淀，点板监测反应，趁热抽滤，并用甲醇洗涤数次即得香豆素类席夫碱衍生物1（即荧光探针1），其氢谱、碳谱和质谱分别如图1、图2和图3所示。

荧光探针1的结构表征：¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ (ppm) 11.920 (s, 2H),8.857 (s, 2H), 8.599 (s, 2H), 7.768 (s, 2H), 7.514 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 6.728(d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.576 (s, 2H), 5.358 (s, 1H), 3.524-3.472 (q, 8H, J =6.8 Hz), 1.368 (s, 9H), 1.295-1.260 (t, 12H, J = 6.8 Hz). ¹³C NMR (100 MHz,CDCl₃): δ (ppm) 162.734, 159.559, 157.815, 155.680, 152.884, 149.100,142.128, 131.492, 110.373, 108.967, 108.719, 96.755, 45.311, 34.290, 31.428,12.440. ESI-MS: m/z: 721.3317, [L+H]⁺; m/z: 743.3145, [L+Na]⁺。

1.3.2 测试方法

称取一定量的荧光探针1配制成摩尔浓度为1.00×10^-3mol/L的DMSO溶液，移取1mL上述溶液加到100mL的容量瓶中，在电热板上蒸干（85-90℃），3分钟后稍冷，用CH₃CN/HEPES（3/2，V/V）混合体系定容。

荧光的测量：取3mL待测溶液于石英比色皿中，在激发波长439nm，发射波长483nm处测量。

2 结果

2.1 检测机理

通过对加入Cu²⁺前后的荧光光谱分析，可能的检测机理为：香豆素类席夫碱衍生物1（即荧光探针1）本身具有较强荧光。在加入Cu²⁺后，由于Cu²⁺的顺磁性及光诱导电子转移作用，使荧光探针1的荧光淬灭。而加入其它金属离子时，荧光强度没有明显变化。通过比较各种金属离子对荧光探针1的荧光淬灭情况，达到快速、简便、灵敏、高选择性检测铜离子的目的。

2.2 荧光探针1对各种金属离子的紫外-可见光谱吸收光谱选择性及荧光探针1对Cu²⁺的紫外-可见光谱吸收滴定

在CH₃CN/HEPES（3:2，V/V）混合体系中，1μmol/L的化合物1对各种金属离子的紫外-可见光谱吸收光谱如图4所示，最大紫外-可见光谱吸收在439nm处，只有Cu²⁺对化合物1的紫外-可见光谱响应最大，而其它金属离子几乎无干扰或响应很小，这表明荧光探针1对Cu²⁺具有较高的选择性识别能力。化合物1对Cu²⁺的紫外-可见光谱滴定如图5所示，随着Cu²⁺的加入，化合物1的紫外-可见光谱吸收逐渐发生变化。当加入6倍量的Cu²⁺后，化合物1的紫外-可见光谱滴定达到平衡。

2.3 荧光探针1对各种金属离子的荧光光谱选择性实验

在CH₃CN/HEPES（3:2，V/V）混合体系中，1μmol/L的化合物1对各种金属离子的荧光光谱选择性实验如图6所示。在相同的条件下，向1μmol/L的化合物1中分别加入等量的Mn²⁺、Fe^{3 +}、Fe²⁺、K⁺、Mg²⁺、Pb²⁺、Al³⁺、Zn²⁺、Ag⁺、Ni²⁺、Cd²⁺、Ca²⁺、Na⁺、Cr³⁺、Co²⁺、Hg²⁺、Cu²⁺等离子的溶液。结果表明，加入Cu²⁺时，化合物1的荧光被显著淬灭，荧光淬灭效率可达98.73%，而加入其它金属离子时，化合物1的荧光强度几乎无明显变化。因此，该荧光探针1在CH₃CN/HEPES（3:2，V/V）混合体系中，能够从常见的金属离子中高选择性地荧光检测铜离子。

2.4 荧光探针1对Cu²⁺的荧光光谱滴定

在CH₃CN/HEPES（3:2，V/V）混合体系中，随着Cu²⁺的加入，1μmol/L的化合物1荧光滴定光谱如图7所示。以439nm激发，化合物1在483nm处显示出很强的荧光发射峰。随着Cu²⁺的加入，荧光强度逐渐减弱。当加入4倍量Cu²⁺后，趋于平衡。

2.5 不同金属离子对荧光探针1检测Cu²⁺的竞争性实验

为了进一步探索化合物1检测Cu²⁺的抗干扰性，进行了不同金属离子对Cu²⁺的竞争性实验。如图8所示，先向化合物1（10μmol/L，CH₃CN:HEPES=3:2，V/V）中分别加入其它可能影响荧光强度的金属离子（即Mn²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、K⁺、Mg²⁺、Pb²⁺、Al³⁺、Zn²⁺、Ag⁺、Ni²⁺、Cd²⁺、Ca²⁺、Na⁺、Cr^{3 +}、Co²⁺、Hg²⁺），荧光强度没有产生明显变化。但是，再分别向该体系中加入Cu²⁺后，在483nm处，荧光强度明显减弱，这表明在其它金属离子存在下，荧光探针1对Cu²⁺的识别具有很强的抗干扰能力。

2.6 荧光探针1的水溶性和pH值依赖的荧光光谱实验

如图9所示，在乙腈含量不同的情况下进行了荧光探针1的水溶性测试。结果表明，在乙腈含量60%（体积分数）范围内，荧光探针1对Cu²⁺产生了较为显著的荧光响应，因此本实验选择乙腈与HEPES缓冲溶液体积比为6:4进行测试。

为了探究pH值对荧光探针1识别Cu²⁺的影响，进行了不同pH值条件下化合物1和1-Cu²⁺的荧光光谱实验。如图10所示，当pH为4-10之间时，化合物1的荧光强度相对稳定。当pH为4-5.5和8-10之间时，1-Cu²⁺的荧光强度有波动。而pH为5.5-7.5之间，1-Cu²⁺的荧光强度基本没有变化。因此在用该探针进行测试时，为了排除pH对体系可能造成的影响，减小误差，将pH控制在7.4。

2.7 荧光探针1（10μmol/L）与Cu²⁺的Job’s plot曲线图

为探究荧光探针1与Cu²⁺的结合比，进行了等物质的量连续变化法（Job’s Plot）实验。如图11所示，在CH₃CN:HEPES（3:2，V/V）混合体系中（pH 为7.4），固定荧光探针1与Cu²⁺总浓度为100μmol/L。分别测定荧光探针1与Cu²⁺的浓度比分别为1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1时，在 λ=480nm处的吸光度。测得Cu²⁺与荧光探针1在摩尔比为0.66处出现最大吸收值，即当C(荧光探针1):C(Cu²⁺)=1:2时吸光度最高。Job’s plot曲线表明荧光探针1与Cu^{2 +}的结合比为1:2。

2.9 荧光探针1对铜离子的细胞荧光成像

荧光探针能够对细胞进行显微荧光成像检测对于其生物应用是非常重要的。如图12所示，应用Leica DMI8倒置荧光显微镜，在肝癌HepG-2细胞中实现了荧光探针1对Cu²⁺离子的荧光成像。在荧光显微成像前，将HepG-2细胞在包含有10wt%牛血清蛋白的RPMI-1640培养基中培养24小时。然后，将荧光探针1（终浓度2μM）加到培养基里继续孵化3小时。在倒置荧光显微镜下观察，细胞显示明亮的绿色荧光（图12 a），这表明荧光探针1具有细胞渗透性。用PBS（磷酸盐缓冲溶液）淋洗三次后，向HepG-2细胞中加入含有5倍量Cu²⁺的培养基继续培养5分钟，观察到荧光显著淬灭（图12 b）。在整个实验过程中（约2小时），细胞仍然存活且具有可视化，表明荧光探针1没有明显的毒性和副作用。荧光成像实验表明荧光探针1可用于活细胞中Cu²⁺离子的检测。图12 c和图12 d分别为图12 a和图12 b对应的亮场。

本发明以香豆酰肼和3-醛基吲哚为原料，合成了一种新型香豆素类席夫碱衍生物1（即荧光探针1）。荧光探针1本身具有较强的荧光，在与铜离子配位后荧光减弱。并通过紫外-可见光谱法和荧光光谱法研究了荧光探针1在 CH₃CN/HEPES混合体系中对金属离子的识别检测。结果表明，该荧光探针在CH₃CN/HEPES（3:2，V/V）混合体系中能够从常见的金属离子中以98.73%的荧光淬灭效率高选择性地识别检测铜离子，并通过离子荧光滴定和竞争性实验对其进行了抗干扰能力研究。发现加入其它常见金属离子时，荧光探针1的荧光强度基本没有发生变化。并且在常见离子分别与铜离子共存时，对其没有干扰。从而建立了一种快速、简便、灵敏、高选择性的铜离子的检测方法。

以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

Claims (7)

1.一种新型香豆素类席夫碱衍生物，其特征在于该新型香豆素类席夫碱衍生物的结构式为：

。

2.一种权利要求1所述的新型香豆素类席夫碱衍生物的制备方法，其特征在于具体步骤为：将3-醛基吲唑溶于甲醇中得到溶液A，将香豆酰肼溶于甲醇中得到溶液B，将溶液A和溶液B滴加混合后再滴加乙酸，室温下先搅拌2小时，再在氮气保护下回流反应4小时形成黄色沉淀，点板监测反应，趁热抽滤，并用甲醇洗涤数次即得新型香豆素类席夫碱衍生物。

3.根据权利要求2所述的新型香豆素类席夫碱衍生物的制备方法，其特征在于：所述3-醛基吲唑与香豆酰肼的投料摩尔比为1:1，3-醛基吲唑与甲醇的投料配比为1mmol:10mL，香豆酰肼与甲醇的投料配比为1mmol:15mL。

4.根据权利要求2所述的新型香豆素类席夫碱衍生物的制备方法，其特征在于所述香豆酰肼的具体合成过程为：将4-二乙基氨基水杨醛、丙二酸二乙酯和哌啶在无水乙醇中混和，混合液在搅拌条件下回流反应6小时，冷却至室温，旋蒸至乙醇溶剂不再蒸出得到油状液体7-N,N-二甲基氨基-2-氧-2H-3-香豆酸酯，将7-N,N-二甲基氨基-2-氧-2H-3-香豆酸酯溶于乙醇中，再加入质量浓度为80%的水合肼溶液，室温搅拌12分钟后，冰水中冷却15分钟，所得沉淀抽滤，粗产品用硅胶色谱柱提纯即得香豆酰肼。

5.根据权利要求4所述的新型香豆素类席夫碱衍生物的制备方法，其特征在于：所述4-二乙基氨基水杨醛、丙二酸二乙酯与哌啶的投料配比为0.04mmol:0.08mmol:4mL，7-N,N-二甲基氨基-2-氧-2H-3-香豆酸酯与水合肼的投料摩尔比为1:4。

6.权利要求1所述的新型香豆素类席夫碱衍生物作为荧光探针用于在CH₃CN/HEPES混合体系中从常见金属离子中高选择性识别检测铜离子，所述CH₃CN/HEPES混合体系中CH₃CN与HEPES缓冲溶液的体积比为3:2，CH₃CN/HEPES混合体系的pH优选为5.5-7.5，荧光强度测定条件为激发波长439nm，发射波长483nm。

7.权利要求1所述的新型香豆素类席夫碱衍生物作为荧光探针用于活细胞中铜离子的检测。