CN114381258A - 一种比率型铜离子荧光传感体系、双管检测瓶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种比率型铜离子荧光传感体系、双管检测瓶及其应用，主要目的在于解决现有铜离子检测方法检测时间长、设备昂贵、不利于即时可视化检测等问题，所述比率型铜离子荧光传感体系包括探针1和探针2，所述探针1的分子式为C₂₂H₂₄N₄O₅，结构式为：

所述探针2为7‑(二乙氨基)香豆素，该比率型铜离子荧光传感体系可以与铜离子发生快速识别反应，对于铜离子的识别可以实现比色和荧光双模式信号输出，选择性好，检测线低，可以对铜离子进行定性和定量检测；基于上述识别反应还设计了一种便携的双管检测瓶，能实现铜离子的快速可视化检测，准确度高，探针损耗小，操作简单，即挤即测，不受检测条件和检测人员专业知识的限制。

Description

一种比率型铜离子荧光传感体系、双管检测瓶及其应用

技术领域

本发明涉及铜离子快速检测领域，具体涉及一种比率型铜离子荧光传感体系、双管检测瓶及其应用。

技术背景

铜离子与人的身体健康息息相关，其作为蛋白质和多种酶的催化辅助因子在各种生理过程中发挥着至关重要的作用，正常水平的铜离子对健康至关重要，但过量的铜离子将会导致癌症，神经退行性疾病，阿尔茨海默氏症，帕金森病，胃肠道紊乱等多种疾病。因此，开发一种简单快速，可视化检测铜离子的方法至关重要。

目前，铜离子含量的测定方法主要有：电感耦合等离子体发射光谱法，电感耦合等离子体质谱法，原子吸收光谱法等方法。然而，这些方法都需要昂贵的大型仪器设备，对操作人员要求较高，检测时间较长，不利于现场即时可视化检测等问题。

荧光检测方法因其具有选择性好、灵敏度高、可视化的优点而备受关注，而目前使用荧光方法检测铜离子的探针大多是猝灭型的，猝灭型荧光探针是指利用单一发射波长的荧光信号对检测物进行检测，一般存在背景干扰，可视化分析效果单一，且测定结果受环境因素影响较大，检测结果的重复性较差，具有一定的局限性；比率型荧光探针是一种通过两个荧光信号强度比值的变化实现对目标物的检测的方法，检测结果受环境因素影响小，方法重复性更好、准确度更高，因而更受欢迎。

本发明构建了一种新型的可以实现铜离子比色和荧光检测的高灵敏比率型铜离子荧光传感体系，该传感体系可以与铜离子发生特异性反应，可实现对铜离子的特异性检测；并且对于铜离子的识别可以实现比色和荧光双模式信号输出，具有双模式检测的特点；本发明基于该传感体系还设计了一种便携双管检测瓶，相对于试纸条、聚合物膜等固相检测，双管检测瓶具有以下优点：(1)双管检测瓶装置制备简单，只需将传感体系以及待测液转移至管内按压即可；(2)双管检测瓶小巧便携，“即挤即测”不受检测条件及检测人员技术认知水平限制；(3)双管检测瓶在使用时不需将探针负载在任何基质上，避免了探针负载不均匀的情况；(4)该方法是在液相的基础上进行检测，探针耗损小，且结果更加明显，更利于可视化观察。综上，本发明构建了一种比率型铜离子荧光传感体系，并基于该传感体系设计了一种新型双管检测瓶装置，在实现铜离子的快速、实时可视化检测方面具有一定的应用价值。

发明内容

本发明针对现有铜离子检测方法存在的检测时间长、设备昂贵、对操作人员要求较高、不利于现场即时可视化检测等不足，公开了一种比率型铜离子荧光传感体系、双管检测瓶及其应用，本发明的传感体系一方面能实现铜离子的快速可视化检测，另一方面在进行定量检测时受环境因素影响小，重复性好、准确度高。

实现本发明的技术方案是：

一种比率型铜离子荧光传感体系，包括探针1和探针2，所述探针1的分子式为C₂₂H₂₄N₄O₅，结构式为：

所述探针2为7-(二乙氨基)香豆素，所述探针2的分子式为C₁₃H₁₅NO₂，结构式为：

所述探针1的制备方法包括如下步骤：

S1.将4-(二乙氨基)水杨醛和丙二酸二乙酯溶解在由甲苯和乙腈按体积比1∶2组成的混合溶剂中，加入哌啶作为催化剂，加热至90℃回流10h，旋转蒸发去除溶剂，得到7-(二乙氨基)香豆素-3-甲酸乙脂；

S2.将7-(二乙氨基)香豆素-3-甲酸乙脂和水合肼加入到乙醇中，在冰水浴中冷却15min，室温下搅拌12min，反应后的粗产物经柱层析纯化得7-(二乙氨基)香豆素-3-甲酰肼；

S3.将7-(二乙氨基)香豆素-3-甲酰肼和吡哆醛溶解于乙醇中，在氮气环境下加热至85℃回流12h，冷却至室温后过滤、洗涤、干燥得到探针1。

所述步骤S1中4-(二乙氨基)水杨醛和丙二酸二乙酯的物质的量比为1∶1.57，步骤S2中7-(二乙氨基)香豆素-3-甲酸乙脂和水合肼的物质的量比为1∶4，步骤S3中7-(二乙氨基)香豆素-3-甲酰肼和吡哆醛的物质的量比为2.75∶1。

所述探针1的合成路线如下：

所述比率型铜离子荧光传感体系的制备方法包括如下步骤：

(1)将探针1溶解在DMSO中，制备储备液1，所述储备液1的浓度为2mM；

(2)将探针2溶解在DMSO中，制备储备液2，所述储备液2的浓度为0.2mM；

(3)将储备液1和储备液2加入到浓度为10mM，pH为7.4的PBS溶液中，制得比率型铜离子荧光传感体系，所述比率型铜离子荧光传感体系中探针1和探针2的物质的量浓度比为10∶1。

所述比率型铜离子荧光传感体系在铜离子检测中的应用，步骤如下：

1)以水为溶剂配制浓度为2mM的铜离子溶液。

2)在浓度为10mM，pH为7.4的PBS溶液中加入储备液1和储备液2，再分别加入不同量的铜离子溶液，使得探针1的终浓度为10μM，探针2的终浓度为1μM，铜离子的终浓度分别为0μM、0.4μM、0.8μM、1.2μM、1.6μM、2μM、2.4μM、2.8μM、3.2μM、3.6μM、4μM、4.5μM、5μM、6μM、7μM、8μM，分别在日光下和365nm紫外灯下观察加入不同量铜离子溶液后溶液的荧光颜色变化；并测定各溶液的荧光光谱，观察荧光强度与铜离子浓度之间的变化关系，荧光光谱测定条件为：激发狭缝5nm，发射狭缝5nm，电压700V，激发波长390nm，发射波长480nm和550nm。

荧光颜色变化为：随着铜离子浓度不断增大，日光下溶液颜色由黄色不断加深，365nm紫外灯下溶液由黄色荧光变为强烈的蓝色荧光，通过365nm紫外灯下荧光颜色的变化可以实现溶液中铜离子的可视化检测。

荧光光谱变化为：随着铜离子浓度不断增大，溶液在550nm处的荧光强度逐渐降低，而480nm处的荧光强度基本不变，并且铜离子浓度在0-4μM范围内时，溶液在550nm处的荧光强度和480nm处的荧光强度的比值I₅₅₀/I₄₈₀与铜离子的浓度呈现良好的线性关系，可以通过荧光强度变化对铜离子进行定量检测。

根据上述应用检测葡萄酒中铜离子的含量，步骤如下：

a)绘制标准工作曲线：按上述应用中获得的I₅₅₀/I₄₈₀和铜离子浓度之间的线性关系绘制标准工作曲线；

b)样品处理：对稀释后的葡萄酒进行加热挥去乙醇，采用浓硝酸消解有机物，加热挥去浓酸，加超纯水定容。

c)测试：对经步骤b)处理后的样品溶液进行荧光测试，根据I₅₅₀/I₄₈₀的值和步骤a)中获得的标准工作曲线计算葡萄酒中的铜离子浓度。

一种双管检测瓶，瓶体内设有第一管和第二管，所述第一管内装有上述比率型铜离子荧光传感体系，所述第二管用于盛放待测溶液，瓶体上还设有泵头，按压泵头，第一管和第二管内的溶液同时被挤出，且两个管中挤出的溶液体积相同。

所述第一管内探针1的终浓度为100μM，探针2的终浓度为10μM。

所述双管检测瓶在快速可视化检测铜离子中的应用，具体方法为：按压泵头，挤出溶液于容器中，所述容器优选为透明容器，在日光下或365nm紫外灯下观察溶液荧光颜色的变化。

本发明的有益效果是：(1)本发明提出的比率型铜离子荧光传感体系可以与铜离子发生快速识别反应，对于铜离子的识别可以实现比色和荧光双模式信号输出，选择性好，检测线低；(2)本发明基于上述比率型铜离子荧光传感体系设计了一种便携的双管检测瓶，能实现铜离子的快速可视化检测，并且不需要将探针负载在任何基质上，避免了负载不均匀的情况；相对于试纸条，聚合物膜等固相检测，该方法是在液相的基础上进行检测，探针损耗小，且结果更加明显；该双管检测瓶小巧便捷，操作简单，即挤即测，不受检测条件和检测人员专业知识的限制。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1(a)为在PBS溶液(10mM，pH＝7.4)中，加入10μL储备液1、10μL储备液2和不同量铜离子溶液后的荧光发射光谱图(铜离子终浓度0-8μM，终体积2mL)；图1(b)为365nm紫外灯下溶液的荧光颜色变化图。

图2为在PBS溶液(10mM，pH＝7.4)中，加入10μL储备液1、10μL储备液2和不同量铜离子溶液后(铜离子终浓度0-10μM，终体积均为2mL)，溶液I₅₅₀/I₄₈₀和铜离子浓度之间的关系图；

图3(a)为在PBS溶液(10mM，pH＝7.4)中，加入10μL储备液1、10μL储备液2，再分别加入10μL铜离子溶液和20μL不同干扰离子溶液后(干扰离子溶液浓度均为10mM，溶液终体积均为2m1)，各溶液在550nm处荧光强度和480nm处荧光强的比值变化图；图3(b)为各溶液在365nm紫外灯下的荧光颜色变化图；

图4(a)为双管检测瓶的制作简图，其中左侧管为第一管，右侧管为第二管；图4(b)为将不同浓度铜离子溶液装入第二管中(第二管中铜离子浓度0-80μM)，按压泵头，将挤出的溶液盛放到离心管盖子中(离心管盖子中铜离子终浓度0-40μM)，离心管盖子中各溶液在365nm紫外灯照射下的图片；

图5为本发明制备的探针1的核磁共振氢谱图；

图6为本发明制备的探针1的高分辨质谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

探针1的制备，包括如下步骤：

S1.将2.96g的4-(二乙氨基)水杨醛(15mmol)和3.81g丙二酸二乙酯(23.5mmol)溶解在105mL甲苯和乙腈按体积比1∶2组成的混合溶剂中，并加入4.5ml哌啶作为催化剂，90℃加热回流10h，旋转蒸发去除溶剂，得到7-(二乙氨基)香豆素-3-甲酸乙脂。

S2.将2.17g的7-(二乙氨基)香豆素-3-甲酸乙脂(7.5mmol)和1.82mL水合肼(30mmol，质量分数为80％的水合肼溶液)加入到20mL乙醇溶液中，冰水浴中冷却15min，室温下搅拌12min，反应后的粗产物经柱层析纯化得7-(二乙氨基)香豆素-3-甲酰肼。

S3.将0.6056g的7-(二乙氨基)香豆素-3-甲酰肼(2.2mmol)和0.1352g吡哆醛(0.8mmol)溶解于60mL乙醇中，在氮气环境下加热至85℃回流12h，冷却至室温后过滤、洗涤、干燥得到黄色的探针1。

图5为实施例1制备的探针1的核磁共振氢谱，谱图中显示如下数据：1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：δ12.87(s，1H)，12.28(s，1H)，9.05(s，1H)，8.80(s，1H)，8.13(s，1H)，7.76(d，J＝9.3Hz，1H)，6.87(d，J＝11.0Hz，1H)，6.69(s，1H)，4.74(s，2H)，3.52(q，J＝7.0Hz，4H)，2.54(s，3H)，1.16(t，J＝7.2Hz，6H)，图谱中的检测数据与探针1相吻合；

图6为实施例1制备的探针1的高分辨质谱图，HRMS(ESI)：计算[M+H]⁺＝425.1819，在质谱图上找到425.1820的峰，表明探针1的成功合成。

实施例2

比率型铜离子荧光传感体系在铜离子检测中的应用，检测步骤如下：

(1)将实施例1制备的探针1溶解在DMSO中制备储备液1，所述储备液1的浓度为2mM；

(2)将探针2溶解在DMSO中制备储备液2，所述储备液2的浓度为0.2mM，本实验中探针2的CAS号为20571-42-0，购于百灵威官方网站；

(3)配制浓度为10mM，pH为7.4的PBS溶液，以水为溶剂配制2mM的铜离子溶液。

(4)在不同体积的PBS溶液中加入10μL储备液1和10μL储备液2，再分别加入不同体积的铜离子溶液，终体积均为2ml，使得探针1的终浓度为10μM，探针2的终浓度为1μM，铜离子的终浓度分别为0μM、0.4μM、0.8μM、1.2μM、1.6μM、2μM、2.4μM、2.8μM、3.2μM、3.6μM、4μM、4.5μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM，在365nm紫外灯下观察加入不同体积铜离子溶液后溶液的荧光颜色变化；使用荧光分光光度计测定室温下加入不同体积铜离子溶液后各溶液的荧光光谱，观察荧光光谱变化，绘制I₅₅₀/I₄₈₀与铜离子浓度的变化关系图；荧光光谱测定条件为：激发狭缝5nm，发射狭缝5nm，电压700V，激发波长390nm，发射波长480nm和550nm。

从图1(a)中可以看出加入不同体积铜离子溶液后(图中曲线代表铜离子终浓度分别为：从上至下0μM，0.4μM，0.8μM，1.2μM，1.6μM，2μM，2.4μM，2.8μM，3.2μM，3.6μM，4μM，4.5μM，5μM，6μM，7μM，8μM)，体系在480nm和550nm有两个荧光发射峰，其中480nm处的峰为探针2的荧光发射峰，550nm处的发射峰为实施例1合成的探针1的发射峰；当铜离子浓度从0μM逐渐增大到8μM时，550nm处的荧光强度逐渐降低，而480nm处的荧光强度基本保持不变；

从图1(b)可以看出加入铜离子溶液后荧光颜色由黄色逐渐变为蓝色(图中各溶液中铜离子终浓度分别为：从左至右0μM，0.4μM，0.8μM，1.2μM，3.2μM，3.6μM，4μM，6μM，7μM，8μM)；

从图2可以看出，铜离子浓度在0-4μM范围内时，溶液在550nm处的荧光强度和480nm处的荧光强度的比值I₅₅₀/I₄₈₀与铜离子的浓度呈现良好的线性关系，线性方程为y＝2.2181-0.3538x，其中R²＝0.9867，y表示I₅₅₀/I₄₈₀，x表示溶液中铜离子浓度，计算得到检测限为46.5nM。

上述现象表明，本发明构建的传感体系能够对溶液中的铜离子产生响应，通过365nm紫外灯下溶液荧光颜色由黄色变为蓝色可实现溶液中铜离子的可视化检测，通过荧光强度的变化可实现铜离子的定量检测。

实施例3

比率型铜离子荧光传感体系对铜离子的选择性：

以水为溶剂配制2mM铜离子溶液以及10mM其他干扰离子溶液，干扰离子溶液包括：钠离子溶液(Na⁺)，钾离子溶液(K⁺)，钙离子溶液(Ca²⁺)，钡离子溶液(Ba²⁺)，二价铁离子溶液(Fe²⁺)，锌离子溶液(Zn²⁺)，二价镉离子溶液(Cd²⁺)，镁离子溶液(Mg²⁺)，三价铁离子溶液(Fe^{3 +})，汞离子溶液(Hg²⁺)，二价铅离子溶液(Pb²⁺)，二价锰离子溶液(Mn²⁺)，铝离子溶液(Al³⁺)；

向PBS溶液(10mM，pH＝7.4)中加入10μL储备液1和10μL储备液2，然后再分别加入10μL铜离子溶液和20μL不同干扰离子溶液，各溶液总体积均为2ml，探针1的终浓度为10μM，探针2的终浓度为1μM，铜离子的终浓度为10μM，干扰离子的终浓度为100μM，测试各溶液的荧光发射光谱，并观察各溶液在365nm紫外灯下的荧光颜色变化，荧光光谱测定条件为：激发狭缝5nm，发射狭缝5nm，电压700V，激发波长390nm，发射波长480nm和550nm。

如图3(a)所示，传感体系只对铜离子有较强的响应；图3(b)显示，只有铜离子能使体系的荧光变为蓝色，加入大量干扰离子后的溶液的荧光依然为黄色；实验结果表明，本发明的比率型铜离子荧光传感体系对铜离子有较高的选择性，可以实现铜离子的特异性检测。

实施例4

利用比率型铜离子荧光传感体系检测葡萄酒中铜离子的含量：

选择三种葡萄酒，各取5mL于锥形瓶中，置于加热板上90℃加热挥去乙醇，加入5mL浓硝酸，置于加热板上加热至200℃消解有机物，后又继续加热挥去浓酸，至瓶内剩余大约1mL溶液时停止加热，用超纯水定容至30mL，用本发明方法和原子吸收光谱法(AAS)分别进行检测，测试结果见表1。在上述消解液中分别加入不同量的铜离子溶液进行检测验证(浓度增量分别为0.1mg/L和0.2mg/L)，测试结果见表1，表中所得结果均为葡萄酒稀释6倍后的结果。

表1 葡萄酒中铜离子的测定结果

由表1可知，采用本发明构建的比率型铜离子荧光传感体系检测葡萄酒中的铜离子含量与用原子吸收光谱法检测的结果相差不大，加标回收实验也证明了该方法的可行性，本发明构建的传感体系可以用来检测葡萄酒中的铜离子含量。

实施例5

采用双管检测瓶对铜离子进行快速可视化检测：

在双管检测瓶的第一管中加入9mL的PBS溶液(10mM，pH＝7.4)、500μL的储备液1以及500μL的储备液2，分别将不同浓度的待测溶液加入到第二管中，使得第一管中探针1的终浓度为100μM，探针2的终浓度为10μM，第二管中待测溶液浓度分别为0μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM，然后按压泵头，两个管中的溶液同时被挤出，且两个管中挤出的溶液体积相同，将挤出的溶液盛放于容器中(本实验将溶液挤于离心管盖子中)，在365nm紫外灯下观察容器中溶液荧光颜色的变化。

挤出到容器内的混合溶液中各物质的终浓度分别为：探针1的终浓度为50μM，探针2的终浓度为5μM，铜离子浓度为0-40μM(具体为：0μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM)。

如图4(b)所示，溶液混合均匀后，随着铜离子浓度的增加，365nm紫外灯下溶液的荧光颜色由黄色逐渐变为蓝色，实验结果表明，本发明设计的双管检测瓶可以简单快速地实现对溶液中铜离子的可视化检测，实际应用时只需将待测液装入管内，按压即可，具有一定的实际应用价值。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种比率型铜离子荧光传感体系，其特征在于：包括探针1和探针2，所述探针1的分子式为C₂₂H₂₄N₄O₅，结构式为：

所述探针2为7-(二乙氨基)香豆素。

2.根据权利要求1所述的比率型铜离子荧光传感体系，其特征在于制备方法包括如下步骤：

(1)将探针1溶解在DMSO中，制备储备液1；

(2)将探针2溶解在DMSO中，制备储备液2；

(3)将储备液1和储备液2加入到PBS溶液中，制得比率型铜离子荧光传感体系。

3.根据权利要求2所述的比率型铜离子荧光传感体系，其特征在于：所述步骤(1)中储备液1的浓度为2mM，所述步骤(2)中储备液2的浓度为0.2mM，所述步骤(3)中制得的比率型铜离子荧光传感体系中探针1和探针2的物质的量浓度比为10:1，所述PBS溶液的浓度为10mM，pH为7.4。

4.权利要求2或3任一项所述的比率型铜离子荧光传感体系在铜离子检测中的应用，其特征在于步骤如下：

1)配制浓度为2mM的铜离子溶液。

2)在PBS溶液中加入储备液1和储备液2，再分别加入不同量的铜离子溶液，使得探针1的终浓度为10μM，探针2的终浓度为1μM，铜离子的终浓度为0-8μM，分别在日光下和365nm紫外灯下观察加入不同量铜离子溶液后溶液的荧光颜色变化；并测定各溶液的荧光光谱。

5.根据权利要求4所述的比率型铜离子荧光传感体系在铜离子检测中的应用，其特征在于：所述铜离子的终浓度分别为0μM、0.4μM、0.8μM、1.2μM、1.6μM、2μM、2.4μM、2.8μM、3.2μM、3.6μM、4μM、4.5μM、5μM、6μM、7μM、8μM。

6.根据权利要求5所述的比率型铜离子荧光传感体系在铜离子检测中的应用，其特征在于：随着铜离子浓度不断增大，日光下溶液颜色由黄色不断加深；365nm紫外灯下溶液由黄色荧光变为强烈的蓝色荧光；溶液在550nm处的荧光强度逐渐降低，而480nm处的荧光强度基本不变，且溶液在550nm处的荧光强度和480nm处的荧光强度的比值I₅₅₀/I₄₈₀与铜离子的浓度呈现良好的线性关系。

7.根据权利要求6所述的比率型铜离子荧光传感体系在铜离子检测中的应用，其特征在于：检测葡萄酒中铜离子的含量，步骤如下：

a)绘制标准工作曲线：按所述I₅₅₀/I₄₈₀和铜离子浓度之间的线性关系绘制标准工作曲线；

b)样品处理：对稀释后的葡萄酒进行加热挥去乙醇，采用浓硝酸消解有机物，加热挥去浓酸，加超纯水定容。

c)测试：对经步骤b)处理后的样品溶液进行荧光测试，根据I₅₅₀/I₄₈₀的值和步骤a)中获得的标准工作曲线计算葡萄酒中的铜离子浓度。

8.一种双管检测瓶，瓶体内设有第一管和第二管，其特征在于：所述第一管内装有权利要求1-3任一项所述的比率型铜离子荧光传感体系，所述第二管用于盛放待测溶液，瓶体上设有泵头，按压泵头，第一管和第二管内的溶液同时被挤出，且两个管中挤出的溶液体积相同。

9.根据权利要求8所述的双管检测瓶，其特征在于：所述第一管内探针1的终浓度为100μM，探针2的终浓度为10μM。

10.权利要求8-9任一项所述的双管检测瓶在快速可视化检测铜离子中的应用，其特征在于：按压泵头，挤出溶液于容器中，在日光下或365nm紫外灯下观察溶液荧光颜色的变化。

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