CN107602519A

CN107602519A - 基于香豆素染料比率型双功能荧光探针及其合成与应用

Info

Publication number: CN107602519A
Application number: CN201710831545.0A
Authority: CN
Inventors: 唐勇; 李媛媛; 唐帅; 王赟; 韩娟; 李春梅; 夏晋晨; 倪良
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2017-09-15
Filing date: 2017-09-15
Publication date: 2018-01-19
Anticipated expiration: 2037-09-15
Also published as: CN107602519B

Abstract

本发明属于化合物的制备及应用技术领域，具体涉及一种基于香豆素染料比率型双功能荧光探针及其合成与应用；本发明首次合成了一种香豆素的新型荧光比率型探针；本发明利用7‑羟基‑4‑甲基香豆素、乌洛托品溶于冰醋酸之中反应，此后再加入浓盐酸与之反应，通过提纯分离柱层析得到产物香豆素醛，再将香豆素醛与二氨基马来腈溶于乙腈之中，滴加少量浓盐酸，室温搅拌，分离提纯，得到最终的目标产物；此发明的离子探针可以对铜与次氯酸进行有效的快速识别，具有高效的选择性与离子竞争性，可以用于相关实际水样的识别。

Description

基于香豆素染料比率型双功能荧光探针及其合成与应用

技术领域

本实验属于化合物的之别及应用技术领域，具体涉及一种基香豆素染料比率型双功能荧光探针及其合成与应用。

背景技术

次氯酸作为生物体内的活性氧（ROS）中的重要成分，是自然防御体系中的抗菌剂，可以破坏入侵的病原体与细菌，但过量的次氯酸会引起组织的损伤以及一系列的疾病，例如关节炎，心血管疾病，动脉硬化，肾病与癌症等等。次氯酸也是生活中的强氧化剂，例如家用漂白粉，消毒剂，抗菌剂，次氯酸的浓度对日常生活也是承担着至关重要的作用，因此，对次氯酸进行高效灵敏的实时检测的发展也是至关重要的。

铜是人体内的含量第三高的过渡金属元素，仅次于锌与铁的含量，与多种细胞的代谢发展密切相关，在人体生理过程中承担着巨大的作用，铜的匮乏与过量会引起机体生理功能的紊乱，铜的缺失会引起门克斯病，而过量则会导致中枢神经系统的衰退与威尔逊病的发生。由此可知，铜的含量的多少与人们的健康生活密切相关，所以对铜离子的离子检测方法对健康生活的发展起着不可忽视的作用。

迄今为止，对次氯酸与铜离子的检测方法发展迅速，例如高效液相色谱法，原子吸收法，原子发射法等等，但因为设备相对昂贵，不适用于实时分析，为此荧光探针技术引起了广泛的关注。而随着荧光探针的高效发展，现如今，出现了一系列分别检测次氯酸与铜的荧光探针，其中绝大部分是利用次氯酸的强氧化性以及铜离子顺磁性的原理，从而实现了对相关目标离子的检测。一些荧光基团如萘酰亚胺，罗丹明，香豆素等都可以作为基本荧光团实现离子的监测。但与此同时，先前的探针的相关缺点也逐渐显现出来，比如较高的检测限，反应时间较长，较差的选择性与离子竞争性，荧光量子产率较低等，从而限制了这些探针的相关应用范围。因此，急需设计一种荧光探针克服这些不足，从而实现出对两种离子的检测。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种新型的对铜与次氯酸比率型双功能BODIPY荧光探针及其合成方法，并使用该新型的荧光探针去识别及测量实际水样中的次氯酸根与铜离子的相关浓度含量。

为了满足上述的目的，本发明所采用的技术方案为：

本发明首先提供一种香豆素类衍生物作为一种双功能的荧光探针，其分子式为C₁₅H₁₀N₄O₃,而其结构式则如下式所示：

本发明还提供该荧光探针的制备方法，如下式所示：

(1)中间体化合物1－香豆素醛的合成：

称取一定量的7-羟基-4-甲基香豆素与乌洛托品，将其溶于冰醋酸之中，溶液于90 ℃进行回流搅拌6小时，此后滴加盐酸(20mL)进入反应液，持续回流搅拌50分钟，冷却至室温，加入100mL冰水，用乙醚萃取三次(3×100mL)，用无水硫酸钠干燥有机相，减压旋蒸得粗品，用洗脱液(石油醚/二氯甲烷=10/1)过柱提纯得淡黄色固体，即化合物1。

其中,所述7-羟基-4-甲基香豆素加入量为5.0－10.0 g (28.4－56.8 mmol);

所述乌洛托品加入量为9.2－18.4 g (65－130 mmol);

加入的冰醋酸体积为40－80 mL;

在一定温度下继续反应的反应温度和时间分别为90－95 度,1－2h;

洗脱液比例为石油醚二氯甲烷=（10-20）：1；

所述合成过程中的中间产物化合物1的合成方法参照文献（G. Suresh, R. V. Nadh,N. Srinivasu, K. Kaushal, Novel coumarin isoxazoline derivatives: Synthesisand study of antibacterial activities, Synthetic Commun. 46 (2016) 1972-1980.）。

(2)探针的合成：

称取一定量的化合物1与二氨基马来腈溶解于无水乙醇/水溶液，滴加数滴浓盐酸，溶液于室温下搅拌。反应产物减压旋蒸，干燥得粗品，用洗脱液过柱提纯得到黄色固体，终产物即探针。

其中,所述二氨基马来睛和化合物1的加入量分别为108－216 mg (1.0－2.0mmol)：163－326 mg (0.8－1.6mmol);

所述溶剂乙醇/水溶液的量为15－30ml；

所述催化剂浓盐酸加入量为3－5滴;

所述搅拌反应时间为0.5－1 h;

所述柱层析洗脱液中石油醚和乙酸乙酯的体积比为(4－10):1。

本发明的目的是将上述探针用于分别检测实际水样的次氯酸根与铜离子的含量。

(1)用DMSO配制1mM的探针储备液，并将其置于-4℃的冰箱中保存，用0.01M 的PBS缓冲溶液(pH7.4，含10%DMSO，v/v)稀释储备液到最终浓度为5μM的测试溶液。10mM次氯酸钠，10mM二氯化铜与剩余其他离子的储备液则用蒸馏水配制而成，这些离子包含F^-, Cl^-,ClO₄ ^-, HCO₃ ^-, CO₃ ^2-, H₂PO₄ ^-, HPO₄ ^-, SO₄ ^2-, S₂O₃ ^2-, H₂O₂, •OH, ONOO^-, NO₂ ^-, ROO•, NO•和ClO^-、Na⁺, K⁺, Ag⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺, Sr²⁺, Ba²⁺, Fe²⁺, Cd²⁺, Pb²⁺, Hg²⁺, Cr³⁺, Fe³⁺,Al³⁺和 Cu²⁺。向已配的5μM探针溶液中添加各种浓度的次氯酸根离子与铜离子，分别去测定其荧光光谱与紫外光谱；

(2)分别向探针的待测溶液中添加各种稀释的离子储备液，使其最终的离子终浓度为0.1mM，分别用来测定各种离子与探针混合溶液的紫外光谱与荧光光谱。

(3)用发明的荧光探针通过测定其溶液的荧光光谱来检测生活中的实际水样，再在水样中加入一定浓度的次氯酸根离子与铜离子。使其浓度分别为5μM，10μM与20μM，分别测定荧光强度求得含量。

本发明与现有技术相比较，主要具有以下几个优点：

(1)本发明所设计的荧光探针中的C=N键所体现的异构化作用会使香豆素醛的荧光性质发生明显变换，呈现出红色荧光，而探针被次氯酸根氧化后，其原本的C=N键会被断裂，从而生成C=O键，从而香豆素醛的原本蓝色荧光会得到恢复，实现了对次氯酸根的荧光比率的识别。

(2)本发明所设计的荧光探针本身呈现红色荧光，由于与铜实现配位反应，从而荧光发生淬灭，最终没有荧光，实现了对铜离子的高效识别与测定。

(3)本发明的荧光探针不仅对次氯酸根与铜离子进行快速识别，其荧光强度随着目标离子的加入也会发生明显的变换，在五秒内能够达到稳定，从而可以对目标离子进行实时监控。

(4)本发明的荧光探针对次氯酸根离子与铜离子有着很强的选择性，即使在一些活性氧离子存在的条件下，也能够实现对次氯酸根与铜离子的高效定量识别。

(5)本发明所设计的针对次氯酸根与铜离子的双功能荧光探针不仅具有较高的灵敏度，并且其检测限可以分别低至24.62nM与0.393nM，其具有明显的优势。

(6)本发明的荧光探针可以裸眼对次氯酸根与铜离子实现了比色，由探针原本的黄色实现到次氯酸根的无色，再到铜离子检测的亮黄色，从而可以在可见光下对离子进行判断与监测。

(7)本发明的荧光探针可以运用于实际水样的识别与监测，通过加样回收率可以得到证明，说明了此探针可以应用于相关环境水样的目标离子监测。

附图说明

图1为化合物1的¹H NMR图；

图2为探针的¹H NMR图；

图3为探针的¹³C NMR图；

图4为探针的质谱图；

图5为探针溶液加入次氯酸根离子后的紫外光谱图；

图6为探针溶液加入铜离子后的紫外光谱图；

图7为探针溶液加入次氯酸根离子后的荧光光谱图；

图8为探针溶液的荧光强度随加入的次氯酸根离子浓度变化图；

图9为探针溶液加入铜离子后的荧光光谱图；

图10为探针溶液的荧光强度随加入的铜离子浓度变化图；

图11为探针溶液加入次氯酸根离子后荧光强度随时间变化曲线图；

图12为探针溶液加入铜离子后荧光强度随时间变化曲线图；

图13为探针溶液加入不同离子后的紫外曲线图（离子的顺序：1- F⁻, 2 -Cl⁻, 3 -ClO₄ ⁻, 4- HCO₃ ⁻, 5 -CO₃ ²⁻, 6 -H₂PO₄ ⁻, 7 -HPO₄ ²⁻, 8- SO₄ ²⁻, 9 -S₂O₃ ²⁻, 10 -H₂O₂, 11- •OH,12 -ONOO⁻, 13 -NO₂ ⁻, 14 -ROO•, 15- NO•, 16 -Na⁺, 17- K⁺, 18- Ag⁺, 19- Ca²⁺, 20 -Mg²⁺, 21 -ClO⁻, 22 -Cu²⁺, 23- Zn²⁺, 24- Sr²⁺, 25 -Ba²⁺, 26 -Fe²⁺, 27 -Cd²⁺, 28 -Pb²⁺, 29- Hg²⁺, 30- Cr³⁺, 31 -Fe³⁺,

32 -Al³⁺, 33- blank）；

图14为探针溶液加入不同离子后的荧光曲线图（离子的顺序：1 -F⁻, 2 -Cl⁻, 3- ClO₄ ⁻, 4 -HCO₃ ⁻, 5 -CO₃ ²⁻, 6 -H₂PO₄ ⁻, 7 -HPO₄ ²⁻, 8 -SO₄ ²⁻, 9- S₂O₃ ²⁻, 10 -H₂O₂, 11- •OH,12- Zn²⁺, 13 -Sr²⁺, 14- Ba²⁺, 15 -Fe²⁺, 16 -Cd²⁺, 17- Pb²⁺, 18-Hg²⁺, 19 -Cr³⁺, 20-Fe³⁺, 21 -Al³⁺, 22 -blank, 23 -ONOO⁻, 24 -NO₂ ⁻, 25 -ROO•, 26 -NO•, 27 -Na⁺, 28-K⁺, 29 -Ag⁺, 30 -Ca²⁺, 31- Mg²⁺,

32 -ClO⁻, 33- Cu²⁺）。

具体实施方式：

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图说明对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明中的一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

（1）中间体化合物1的合成

向250mL三口圆底烧瓶中加入10.0g(56.8mmol) 7-羟基-4-甲基香豆素与18.4g(130nmol)乌洛托品，再加入80mL的冰醋酸，超声溶解，反应液温度保持90 ℃回流搅拌6小时，然后用滴管滴加20mL盐酸，继续在相同温度下保持回流搅拌50分钟，然后将反应液冷却至室温，缓慢加入100mL冰水，用乙醚萃取三次(3×100mL)，用无水硫酸钠干燥有机相，减压旋蒸得粗品，用洗脱液(石油醚/二氯甲烷=10/1)过柱提纯得淡黄色固体。

（2）探针的合成

称取326mg(1.6mmol)化合物1与216mg(2mmol) 二氨基马来腈，溶解于30mL乙醇/水溶液里，用滴管滴加浓盐酸5滴，然后反应液在室温条件下搅拌60分钟，反应结束减压旋蒸得粗品，用洗脱液(石油醚/乙酸乙酯=10/1)过柱提纯得到黄色固体。

实施例2：

（1）中间体化合物1的合成

向250mL三口圆底烧瓶中加入8g 7-羟基-4-甲基香豆素与10g乌洛托品，再加入60mL的冰醋酸，超声溶解，反应液温度保持90 ℃回流搅拌6小时，然后用滴管滴加20mL盐酸，继续在相同温度下保持回流搅拌50分钟，然后将反应液冷却至室温，缓慢加入100mL冰水，用乙醚萃取三次(3×100mL)，用无水硫酸钠干燥有机相，减压旋蒸得粗品，用洗脱液(石油醚/二氯甲烷=10/1)过柱提纯得淡黄色固体。

（2）探针的合成

称取300mg化合物1与200mg 二氨基马来腈，溶解于25mL乙醇/水溶液里，用滴管滴加浓盐酸4滴，然后反应液在室温条件下搅拌45分钟，反应结束减压旋蒸得粗品，用洗脱液(石油醚/乙酸乙酯=8/1)过柱提纯得到黄色固体。

实施例3：

（1）中间体化合物1的合成

向250mL三口圆底烧瓶中加入5.0g(28.4mmol) 7-羟基-4-甲基香豆素与9.2g(65nmol)乌洛托品，再加入40mL的冰醋酸，超声溶解，反应液温度保持90 ℃回流搅拌6小时，然后用滴管滴加20mL盐酸，继续在相同温度下保持回流搅拌50分钟，然后将反应液冷却至室温，缓慢加入100mL冰水，用乙醚萃取三次(3×100mL)，用无水硫酸钠干燥有机相，减压旋蒸得粗品，用洗脱液(石油醚/二氯甲烷=10/1)过柱提纯得淡黄色固体，即化合物1为0.84mg，产率为14.5%。核磁氢谱图见图1。

化合物1的¹H NMR图如图1所示：¹H NMR (400 MHz, DMSO, ESI) δ = 11.86 (s,1H), 10.38 (s, 1H), 7.88 (d,1H), 6.92 (d, 1H), 6.26 (d, 1H), 2.33 (d, 3H)。

（2）探针的合成

称取163mg( 0.8mmol)所得的化合物1与108mg(1.0mmol) 二氨基马来腈，溶解于15mL乙醇/水（少量）溶液里，用滴管滴加浓盐酸3滴，然后反应液在室温条件下搅拌30分钟，反应结束减压旋蒸得粗品，用洗脱液(石油醚/乙酸乙酯=4/1)过柱提纯得到黄色固体，终产物即探针为204mg，其产率为87.2%。探针的核磁图与质谱图如下所示：

探针的¹H NMR图如图2所示：¹H NMR (400 MHz, DMF) δ 11.89 (s, 1H), 8.97 (s,1H), 8.33 (s, 2H), 7.82 (d, 1H), 6.91 (d, 1H), 6.27 (s, 1H), 2.47 (s, 3H).

探针的¹³C NMR图如图3所示：¹³C NMR (101 MHz,DMF) δ = 159.71, 154.41, 153.13,148.98, 131.69, 130.80, 129.51, 127.64,115.19, 114.15, 112.91, 111.90,107.61,104.07, 18.81.

探针的质谱图如图4所示：MS：295.19 [M+H] ⁺。

实施例4：探针加入目标离子后的光谱性质研究

(1)用DMSO配制1mM中的实施例3中合成的探针储备液，并将母液置于-4℃的冰箱中储存备用；在进行应用测试前用PBS缓冲液(pH=7.40)稀释母液至终浓度为5μM的探针溶液。而其余的目标离子的储备液则用去离子水配制而成。

(2)测定溶液的紫外光谱。图5是针对次氯酸离子的紫外吸收光谱图，由图中发现探针在382 nm 与464 nm 处有两个最强吸收峰，两个吸收峰值逐渐减弱至峰至峰值逐渐消失，而同时也伴随着波长290 nm 处的吸收迅速增强。而峰位置的蓝移也引起了溶液由深黄色到无色的变化。同理可得，图6则是针对铜离子的紫外吸收光谱图，其探针在382 nm 与464 nm 处有两个最强吸收峰也逐渐减弱，伴随着的是波长355 nm处的吸收也迅速增强，这一蓝移现象也引起了溶液颜色从深黄色到亮黄色的变化，这两种波长变化也说明了探针与次氯酸离子或铜离子分别产生了一种新的物质，对次氯酸或铜离子分别得到了反应的依据，从而可以实现对两者的检测研究。

(3)测量溶液的荧光光谱。首先向探针溶液中加入不同浓度的次氯酸根离子，使其终浓度为0 – 75μM, 分别测定溶液的荧光光谱。如图7所示次氯酸的加入使得体系荧光强度从 582 nm的发射强度逐渐减弱，而462 nm 处的发射强度也与此同时也明显增加，随着次氯酸根离子的浓度的逐渐增大，两处的荧光强度也逐渐变化至462 nm 处的峰值也保持稳定，当次氯酸的浓度达到探针浓度的10倍时，其荧光强度几乎也不会发生变化，证明了10当量的次氯酸根离子可以使探针的反应达到饱和并保持平衡。如图8所示，为了更好地对次氯酸实现定量分析，选取了次氯酸根离子浓度在0 – 5μM范围内的线性关系，体系在462 nm与582 nm处荧光强度的比值呈线性增强，其线性关系为I₄₆₂/I₅₈₂=0.6091 [ClO^-] +0.4134，线性关系R² = 0.9963，对次氯酸根离子的检出限为24.62nM。而在同等条件下，向探针溶液加入不同浓度的铜离子，使其终浓度为0 – 15μM，测定其溶液的荧光光谱。如图9所示铜离子的加入使得体系582 nm处的荧光强度发生的明显的淬灭，随着铜离子的加入，其探针的荧光强度会逐渐减弱，当铜离子的浓度达到探针1浓度的2.4倍时，其荧光几乎已经完全淬灭，说明了2.4当量的铜离子即可以使探针的反应达到饱和并保持平衡。如图10所示，实验选取了铜离子浓度在0 – 10μM范围内体系于582 nm处荧光强度逐渐淬灭的线性关系，其线性关系为(F₀ - F)/F₀ =0.08726 [ClO^-] + 0.03925，线性关系R² = 0.9974，对铜离子的检出限为0.393nM。

(4)探针溶液中加入不同浓度的次氯酸根离子，使次氯酸根浓度分别为0、7μM、25μM、40μM、50μM、80μM，分别在加入后的0、3s、30s、60s、90 s、120 s、150 s、180 s、240 s、300s、450 s、600 s、900 s时间测量并记录荧光强度值。结果如图11所示，发现探针溶液在加入次氯酸根后荧光强度急剧变化，且在5秒以内达到稳定的最大值，因此探针对次氯酸根离子有极快的响应，相对于现有的一般探针，能够明显的实行实时监测。同等条件下，使铜离子的浓度分别为0、3μM、6μM、10μM、15μM，分别在加入后的0、3s、30s、60s、90 s、120 s、150 s、180 s、240 s、300 s、450 s、600 s、900 s时间测量并记录荧光强度值，结果如图12所示，可在30秒以内完成识别与测量，并能达到荧光的稳定值，其检测的速度也是达到了明显的提升。

实施例5：探针对目标离子的选择性研究

用DMSO配制1mM的探针储备液，并将其置于-4℃的冰箱中保存，用0.01M 的PBS缓冲溶液(pH7.4，含10%DMSO，v/v)稀释储备液到最终浓度为5μM的测试溶液。10mM次氯酸钠，10mM二氯化铜与剩余其他离子的储备液则用蒸馏水配制而成，这些离子包含F^-, Cl^-, ClO₄ ^-,HCO₃ ^-, CO₃ ^2-, H₂PO₄ ^-, HPO₄ ^-, SO₄ ^2-, S₂O₃ ^2-, H₂O₂, •OH, ONOO^-, NO₂ ^-, ROO•, NO•与ClO^-、Na⁺, K⁺, Ag⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺, Sr²⁺, Ba²⁺, Fe²⁺, Cd²⁺, Pb²⁺, Hg²⁺, Cr³⁺, Fe³⁺, Al³⁺和Cu²⁺以及空白样品。将储备液用PBS缓冲液稀释到终浓度为5μM的溶液，并分别加入一定体积的离子储备液，使各离子的终浓度为100μM，分别测定其荧光与紫外光谱，结果如图13和14所示，探针对次氯酸根离子和铜离子有着不同的荧光与视觉响应，而对其余离子与空白离子的荧光强度与紫外的峰值保持一致，说明了探针在多个竞争离子干扰的环境里，可以对次氯酸根离子实现比率的检测，而对铜离子实现荧光淬灭过程的检测，其探针对次氯酸与铜的反应之后的颜色变化已经单独标于其紫外与荧光选择性图谱中，实现精确的定性分析，且互不干扰，以满足复杂水样的离子监测。

实施例6：探针用于检测环境水样中的次氯酸根离子与铜离子

向自来水中加入一定体积的标准浓度的次氯酸根离子，使其终浓度分别为5μM、10μM与15μM。分别测定荧光得到荧光强度值。通过其标准曲线得到其浓度，其加标浓度的次氯酸根离子回收率分别为98.6%，102.3%，97.5%；而对铜离子的加标回收率分别为99 %，102.5%，98.6%，由其回收率可得到该方法所得的结果准确度比较高，此法可以证明该探针可以用于实际水样中次氯酸根离子与铜离子的识别以及含量测定，其结果如表1所示，该探针可以实现在复杂水样中对次氯酸根离子和铜离子的双重监测，其方法的高回收率与较低的相对标准偏差，证明了该探针可以实现在复杂水样对次氯酸根离子与铜离子的双重监测。

表.1 实际水样目标离子浓度的测定

Claims

1.一种基于香豆素染料比率型双功能荧光探针，其特征在于，所述探针分子式为C₁₅H₁₀N₄O₃,而其结构式则如下式所示：

。

2.一种基于香豆素染料比率型双功能荧光探针的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：

称取一定量的香豆素醛与二氨基马来腈溶解于无水乙醇/水溶液中，滴加数滴浓盐酸，溶液于室温下搅拌混匀反应一定时间；反应产物减压旋蒸，干燥得粗品，用洗脱液过柱提纯得到黄色固体，终产物即为所述探针。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述二氨基马来睛和香豆素醛的加入量比例为108－216 mg：163－326 mg 。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，溶剂乙醇/水溶液的用量为15－30ml；所述催化剂浓盐酸加入量为3－5滴。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述搅拌反应时间为0.5－1 h;

所述洗脱液为石油醚和乙酸乙酯的混合溶液，其中石油醚和乙酸乙酯的体积比为(4－10):1。

6.一种基于香豆素染料比率型双功能荧光探针用于检测水样中次氯酸根离子与铜离子。