CN111116564A - 检测次氯酸根离子的比率型荧光分子探针及其制备方法和应用 - Google Patents

检测次氯酸根离子的比率型荧光分子探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测次氯酸根离子的比率型荧光分子探针及其制备方法和应用，属于化学荧光材料技术领域；本发明采用化合物6‑溴‑2‑(2‑吗啉代乙基)‑1H‑苯并[异]喹啉‑1,3(2H)‑二酮与香豆素醛为原材料经过合成得到本发明所述的探针；本发明基于香豆素与萘酰亚胺两种荧光团构建了一种新型溶酶体定位的荧光探针，并将其用于ClO‑的比率检测，实现了对内源性或外源性ClO‑的荧光成像。

Description

检测次氯酸根离子的比率型荧光分子探针及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及一种检测次氯酸根离子的比率型荧光分子探针及其制备方法和应用，属于化学荧光材料技术领域。
背景技术
一定浓度的次氯酸根离子具有杀菌消毒的作用，但是异常浓度的次氯酸也会带来诸多问题，例如刺激性强而对人体呼吸系统产生伤害，使人体患上多种疾病或与其他物质结合产生致癌物质，严重危害到人体健康。
次氯酸根(ClO-)作为反应活性较高的活性氧，在环境中、水体重和生物机体的免疫防御系统中具有重要作用。内源性ClO-可通过过氧化物酶的催化反应而产生，可摧毁入侵的病原体，但若在人体内过量产生或过量摄入都会引发一系列的生理疾病，例如心血管疾病、关节炎、神经元退化与癌症等。为了在生物体内控制ClO-的生理浓度和检测水体中次氯酸跟浓度或含量，需要设计并构建高效选择与快速检测的ClO-荧光探针。
荧光探针由于其成本低、操作便捷与特异性识别能力强，已经成为离子监测的一项有力工具，尤其是针对生物学中，已经设计了很多荧光探针用于目标物的检测。但在反应时间、灵敏度、细胞器定位等方面仍有提高的空间。由文献可知，目前具有溶酶体靶向作用的小分子荧光探针对ClO-的特异性检测相对较少。溶酶体作为细胞内的一种主要器官，不仅可产生 ClO-，还具有调节分泌活性氧的功能。因此，设计具有溶酶体定位功能且性能优异的ClO-荧光探针对于目标离子的实时监控来说是意义非凡的，同时对自然环境或水体中的次氯酸跟检测都有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷之一，而提供一种对次氯酸根选择性高，抗干扰能力突出的比率型荧光探针。
本发明所述的比率型荧光探针的化学式为C29H16N4O6，结构式为：
Figure BDA0002312946360000021
本发明还提供所述比率型荧光探针的制备方法，该荧光探针的制备过程如下式所示：
Figure BDA0002312946360000022
探针1的合成
化合物1(香豆素醛)的合成：
将7-羟基-4-甲基香豆素与六次甲基四胺溶解在冰醋酸中，加热搅拌回流；随后在溶液中滴加盐酸，在一定温度下继续加热。反应冷却后，加入冷水(100mL)，用乙醚进行多次萃取，通过旋蒸干燥得粗产品，用Al2O3柱色谱将粗产品进行纯化；再次旋蒸干燥，得到淡黄色固体，即化合物1，化学式为C11H8O4。
其中，所述7-羟基-4-甲基香豆素加入量为1.0-10.0g(14.4-42.8mmol)；
所述六次甲基四胺加入量为7.2-11.2g(50-70mmol)；
所述加入的冰醋酸体积为40-70mL；
所述加入的盐酸体积为10-30mL；
所述加热搅拌回流具体条件为在80-100℃条件下搅拌回流4-6.5h；
所述在一定温度下继续加热的具体为在80-100℃条件下继续加热40-60min；
纯化时，所用洗脱液为石油醚和二氯甲烷的混合液，体积比为石油醚：二氯甲烷＝(10-20)： 1，优选体积比为10:1。
化合物2的合成：
化合物2的名称为：6-溴-2-(2-吗啉代乙基)-1H-苯并[异]喹啉-1,3(2H)-二酮，化学式为 C18H17BrN2O3。
称量4-溴-1,8-萘二甲酸酐和2-氨乙基吗啉溶解在无水乙醇里，加热并回流搅拌反应；反应结束后，室温中冷却，减压旋蒸用于除去反应中溶剂，干燥得粗制品，经柱层析分离将其进行纯化。经减压旋蒸干燥而得到灰白色的固体，即化合物2。
其中，所述4-溴-1,8-萘二甲酸酐的加入量为0.56-1.67g(2-8mmol)；
所述2-氨乙基吗啉加入量为0.35-0.95g(2-7mmol)；
加入的无水乙醇体积为10-30mL；
所述回流搅拌反应温度和时间分别为60-80℃，1-10h；
所述纯化时的洗脱液为二氯甲烷和甲醇的混合液，其中二氯甲烷和甲醇的体积比例为二氯甲烷：甲醇＝(100-200)：1。
化合物3的合成：
化合物3为：6-溴-2-(2-吗啉代乙基)-1H-苯并[异]喹啉-1,3(2H)-二酮，化学式为C18H20N4O3。
称取化合物2溶解在乙二醇甲醚中，在氮气保护下加热至40-60℃，当溶液变清澈，加入水合肼，将反应液加热至120-130℃，回流搅拌，反应完成后冷却至室温，加入冰水重结晶得到粗产物，冷乙醇润洗，经柱色谱分离将粗产物进行提纯。旋蒸干燥得橙黄色固体，即化合物3。
其中，所述化合物2的加入量为190-200mg(0.2-0.8mmol)；
所述水合肼加入量为0.5-1.1mL；
加入的乙二醇甲醚体积为5－15mL；
回流时间为3-5h；
所述提纯时的洗脱液为二氯甲烷和甲醇的混合液，其中二氯甲烷和甲醇的体积比为二氯甲烷：甲醇＝(30-50)：1。
探针1的合成：
称取化合物3与化合物1溶解于乙醇中，滴加少量冰醋酸于混合物之中，加热搅拌反应，反应液冷却至室温，加入冰水，使其冷却重结晶，过滤溶液得到粗产品，经柱色谱分离将粗产品进行提纯。旋蒸干燥得黄色固体，即探针1，化学式为C29H16N4O6，结构式为：
Figure BDA0002312946360000041
其中，所述化合物3的加入量为92-112mg(0.2-0.4mmol)，优选的，加入102mg；
所述化合物1的加入量为51-91mg(0.3-0.4mmol)，优选的，加入71mg；
所述乙醇加入量为2-7mL，优选的加入5mL；
所述冰醋酸加入量0.1-0.5mL；
所述加热至30-50℃搅拌1-3h，优选的，加热至40℃搅拌2h；
所述洗脱时的洗脱液为比例为二氯甲烷和甲醇的混合液，其中二氯甲烷和甲醇的体积比为二氯甲烷：甲醇＝(10-30)：1；优选的，二氯甲烷和甲醇的体积比为二氯甲烷：甲醇＝20:1。
本发明的另一目的是通过探针紫外吸收与荧光发射的光学性能变化既能进行“裸眼”鉴别，也可用于实际水样中目标离子的定量检测。此外，其细胞成像实验对探针溶酶体定位的生理功能进行了有效的验证，实现了对内源性ClO-的荧光成像。
本发明的有益效果如下：
本发明基于香豆素与萘酰亚胺两种荧光团构建了一种新型溶酶体定位的荧光探针，并将其用于ClO-的比率检测。吗啉环属于碱性基团，其对溶酶体具有很好的靶向作用，利用该定位基团可将探针引入溶酶体内部。实验采用香豆素与萘酰亚胺作为荧光团，主要因为这些结构具有较好的光学性质与生物相容性，并利用C＝N异构化来实现对ClO-的实时高效检测。通过本发明的探针紫外吸收与荧光发射的光学性能变化既能进行“裸眼”鉴别，也可用于实际水样中目标离子的定量检测。此外，其成像实验对探针溶酶体定位的生理功能进行了有效的验证，实现了对内源性ClO-的荧光成像。
(1)本发明中所合成的新型荧光探针分子中含有C＝N键，在加入次氯酸根对其氧化之后，C＝N键会氧化断裂并且生成新的C＝O键，进而实现了其对ClO-的荧光增强型识别，效果显著。
(2)本发明中设计并合成了一种具有溶酶体靶向作用的比率型荧光探针，可实现对内源性ClO-的荧光检测。对ClO-有很强的选择性，即使是在一些其他离子的干扰下，也能对次氯酸根进行十分有效的识别。
(3)本发明中荧光探针利用两种荧光团的荧光共振能量转移(FRET)发光机制使其产生黄绿色荧光，加入ClO-后，香豆素荧光团呈现出蓝色荧光，而萘酰亚胺由于结构的改变致使其几乎没有荧光，从而实现了荧光由绿色到蓝色的比率测定。
(4)本发明中荧光探针的光学性质研究发现其可利用紫外与荧光对ClO-进行“裸眼”识别。该探针由于选择性好，反应迅速等优点可被应用于多种实际体系的测试。且通过细胞实验发现了探针的溶酶体定位功能，外源性与内源性ClO-的检测进一步表明探针良好的应用前景。
附图说明
图1为化合物1的氢谱图。
图2为化合物2的氢谱图。
图3为化合物3的氢谱图。
图4为探针1的氢谱图。
图5为探针1的碳谱图。
图6为探针1的质谱图。
图7为探针中加入ClO-后荧光变化(插图)、以及加入ClO-和其他竞争离子后探针1(5 μM)的荧光光谱。
图8为探针1在474nm(a)和544nm(b)波长条件下，加入不同浓度的ClO-后荧光强度变化图。
图9为探针1对ClO-检测的竞争性实验结果。
图10为探针1对HeLa细胞毒性的验证结果。
图11为SW 480细胞培养过程中加入探针、加入探针和ClO-后的荧光成像。
图12为RAW 264.7细胞培养过程中加入探针、加入探针和LPS后的荧光成像。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图说明对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的实施例中涉及的到生物材料如细胞等，如无特别说明，均为公知公用，可常规购买的。
实施例1：
(1)化合物1的合成：
将5.0g(28.4mmol)7-羟基-4-甲基香豆素与9.2g(65mmol)六次甲基四胺的混合物溶解于冰醋酸(55mL)中，加热到90℃搅拌回流5.5h。随后在溶液中滴加盐酸(20mL)，在同等条件下使反应液继续加热50min。待反应冷却后，在溶液中加入冰冷水(100mL)，用乙醚多次萃取，经旋蒸干燥得到粗产品，经Al2O3柱色谱将粗产品纯化(石油醚：二氯甲烷＝10:1)。旋蒸干燥，得淡黄色固体，即化合物1(共0.84g)，产率为14.5％。
化合物1的1H NMR图如图1所示：1H NMR(400MHz,DMSO)δ(ppm):11.86(s,1H),10.38(s,1H),7.88(d,1H),6.92(d,1H),6.26(d,1H),2.33(d,3H).经验证，得到的化合物1为香豆素醛，化学式为C11H8O4，结构式为：
Figure BDA0002312946360000071
(2)化合物2的合成：
称量4-溴-1,8-萘二甲酸酐1.11g(4mmol)与2-氨乙基吗啉0.65g(5mmol)溶解于无水乙醇(20mL)中，然后将反应液加热至75℃回流搅拌5h。等待反应停止后，将反应液在室温中冷却，减压旋蒸去除反应溶剂，干燥得到粗品，经柱层析分离将其进行纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:1)。经减压旋蒸干燥而得到灰白色固体，即化合物4共1.34g，产率为86％。
化合物2的1H NMR图如图2所示：1H NMR(400MHz,DMSO)δ(ppm):8.53(d,2H),8.31(d,1H),8.20(d,1H),7.98(dd,1H),4.16(t,2H),3.57–3.51(m,4H),2.57(t,2H),2.47(s,4H).经验证，得到的化合物2为6-溴-2-(2-吗啉代乙基)-1H-苯并[异]喹啉-1,3(2H)-二酮，化学式为 C18H17BrN2O3，结构式为：
Figure BDA0002312946360000072
(3)化合物3的合成：
精密称取195mg(0.5mmol)化合物2溶解于10mL的乙二醇甲醚中，利用氮气保护，反应液加热至50℃，使溶液清澈，滴加0.8mL的水合肼，将反应液加热至125℃，回流搅拌4h，反应结束后冷却至室温，加入冰水重结晶得到粗产物，用冷乙醇润洗，经柱色谱分离将粗产物进行提纯(二氯甲烷：甲醇＝40:1)。旋蒸干燥得橙黄色固体，即化合物5共141mg，产率为83％。
化合物3的1H NMR图如图3所示：1H NMR(400MHz,DMSO)δ(ppm):9.14(s,1H), 8.63-8.60(m,1H),8.43-8.40(m,1H),8.29(d,J＝8.6Hz,1H),7.63(dd,J＝8.2,7.5Hz,1H),7.25(d,J＝8.6Hz,1H),4.68(s,2H),4.15(t,J＝7.0Hz,2H),3.56-3.51(m,4H),2.54(d,J＝7.3Hz, 2H),2.46(s,4H).C18H20N4O3(340.38),MS:341.34[M+H]+.经验证，得到的化合物3为6-溴 -2-(2-吗啉代乙基)-1H-苯并[异]喹啉-1,3(2H)-二酮，化学式为C18H20N4O3，结构式为：
Figure BDA0002312946360000081
(4)探针1的合成：
精密称取102mg(0.3mmol)化合物3与71mg(0.35mmol)化合物1溶解于5mL乙醇中，滴加少量冰醋酸于混合物之中，加热至40℃搅拌2h，反应液冷却至室温，加入冰水，使其冷却重结晶，过滤溶液得到粗产品，经柱色谱分离将粗产品进行提纯(二氯甲烷：甲醇＝ 20:1)。旋蒸干燥得黄色固体，即探针1共115mg，产率为73％。
探针1的1H NMR图，13C NMR图和MS图，如图4-6所示：
1H NMR(400MHz,TFA)δ(ppm):9.83(s,1H),9.15(s,1H),9.01(d,J＝7.0Hz,2H),8.28(d, J＝7.0Hz,2H),7.93(s,1H),7.63(s,1H),6.95(s,1H),5.31(s,2H),4.90(d,J＝12.2Hz,2H),4.58 (dd,J＝26.5,11.2Hz,4H),4.34(s,2H),3.99(s,2H),3.07(s,3H).
13C NMR(101MHz,TFA)δ(ppm):167.85–165.04,161.39,160.05,152.20,146.50,144.14, 136.74,134.08,130.01,128.85,126.79,120.73,115.55,113.68,110.79,110.55,109.88,107.67, 106.10,64.34,57.67,53.48,35.55,17.91.C29H26N4O6(526.54),MS:527.40[M+H]+。
经验证，得到的探针1为6-溴-2-(2-吗啉代乙基)-1H-苯并[异]喹啉-1,3(2H)-二酮，结构式为：
Figure BDA0002312946360000082
本发明所得到的探针是由萘酰亚胺及香豆素两个荧光团与吗啉构成的，探针中的双荧光团利用能量共振转移(FRET)的发光机制使其产生黄绿色荧光。通过目标物的识别响应后，利用ClO-的强氧化性使探针中的C＝N键断裂水解，形成了蓝色荧光的化合物1(香豆素醛) 与化合物3，由于萘酰亚胺荧光团两端都是吸电子基团，因此无法呈现出荧光效果，从而实现了对ClO-的比率型监控。通过反应后的质谱表征发现其分子量为203.00(m/z)与339.10 (m/z)，并分别对应于化合物1与化合物3的相对分子质量。利用上述的实验理论数据成功的证明了探针1对ClO-的识别机制。
实施例2：
(1)化合物1的合成：
将1.0g 7-羟基-4-甲基香豆素与7.2g六次甲基四胺的混合物溶解于冰醋酸(40mL)中，加热到80℃搅拌回流6.5h。随后在溶液中滴加盐酸(10mL)，在同等条件下使反应液继续加热60min。待反应冷却后，在溶液中加入冰冷水(100mL)，用乙醚多次萃取，经旋蒸干燥得到粗产品，经Al2O3柱色谱将粗产品纯化(石油醚：二氯甲烷＝10:1)。旋蒸干燥，得淡黄色固体，即化合物1(共0.84g)。
(2)化合物2的合成：
称量4-溴-1,8-萘二甲酸酐0.56g与2-氨乙基吗啉0.35g溶解于无水乙醇(10mL)中，然后将反应液加热至60℃回流搅拌10h。等待反应停止后，将反应液在室温中冷却，减压旋蒸去除反应溶剂，干燥得到粗品，经柱层析分离将其进行纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:1)。经减压旋蒸干燥而得到灰白色固体，即化合物4共1.34g。
(3)化合物3的合成：
精密称取190mg化合物2溶解于10mL的乙二醇甲醚中，利用氮气保护，反应液加热至60℃，使溶液清澈，滴加0.8mL的水合肼，将反应液加热至130℃，回流搅拌5h，反应结束后冷却至室温，加入冰水重结晶得到粗产物，用冷乙醇润洗，经柱色谱分离将粗产物进行提纯(二氯甲烷：甲醇＝40:1)。旋蒸干燥得橙黄色固体，即化合物5。
(4)探针1的合成：
精密称取92mg化合物3与51mg化合物1溶解于2mL乙醇中，滴加少量冰醋酸于混合物之中，加热至30℃搅拌3h，反应液冷却至室温，加入冰水，使其冷却重结晶，过滤溶液得到粗产品，经柱色谱分离将粗产品进行提纯(二氯甲烷：甲醇＝20:1)。旋蒸干燥得黄色固体，即探针1。
实施例3：
(1)化合物1的合成：
将10.0g 7-羟基-4-甲基香豆素与11.2g六次甲基四胺的混合物溶解于冰醋酸(70mL)中，加热到100℃搅拌回流4h。随后在溶液中滴加盐酸(30mL)，在同等条件下使反应液继续加热40min。待反应冷却后，在溶液中加入冰冷水(100mL)，用乙醚多次萃取，经旋蒸干燥得到粗产品，经Al2O3柱色谱将粗产品纯化(石油醚：二氯甲烷＝10:1)。旋蒸干燥，得淡黄色固体，即化合物1。
(2)化合物2的合成：
称量4-溴-1,8-萘二甲酸酐1.67g与2-氨乙基吗啉0.95g溶解于无水乙醇(30mL)中，然后将反应液加热至80℃回流搅拌3h。等待反应停止后，将反应液在室温中冷却，减压旋蒸去除反应溶剂，干燥得到粗品，经柱层析分离将其进行纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:1)。经减压旋蒸干燥而得到灰白色固体，即化合物4。
(3)化合物3的合成：
精密称取299mg化合物2溶解于15mL的乙二醇甲醚中，利用氮气保护，反应液加热至60℃，使溶液清澈，滴加0.8mL的水合肼，将反应液加热至130℃，回流搅拌4h，反应结束后冷却至室温，加入冰水重结晶得到粗产物，用冷乙醇润洗，经柱色谱分离将粗产物进行提纯(二氯甲烷：甲醇＝40:1)。旋蒸干燥得橙黄色固体，即化合物5。
(4)探针1的合成：
精密称取112mg化合物3与91mg化合物1溶解于7mL乙醇中，滴加少量冰醋酸于混合物之中，加热至50℃搅拌1.5h，反应液冷却至室温，加入冰水，使其冷却重结晶，过滤溶液得到粗产品，经柱色谱分离将粗产品进行提纯(二氯甲烷：甲醇＝20:1)。旋蒸干燥得黄色固体，即探针1。
实施例4：光谱滴定分析
为了考察探针1对ClO-的检测性能，本实施例测试了不同浓度的ClO-与探针识别响应后的荧光发射光谱与紫外吸收光谱，并分析了其光学性质与ClO-浓度的线性关系。如图8中a 和b所示，图a为在波长474nm时的荧光强度图，b为在波长544nm时的荧光强度图。
实验采用480nm进行激发，探针1(Ф31＝0.46)在波长544nm处的黄绿色荧光发射峰随着ClO-(0-40μM)的逐步滴加而有序降低。由于探针1结构中C＝N键的裂解生成了化合物3与香豆素醛类物质(Ф32＝0.59)。在375nm的激发波长下，同样的溶液体系随着ClO-浓度的逐渐增大，474nm处的一个新的荧光发射峰逐渐升高。当ClO-的浓度滴加到8倍量时，探针的荧光发射强度达到最大，表明该反应已达到饱和的状态。由此可知，ClO-在0-20μM 的浓度范围内，通过两种激发波长所得的荧光比率值(I474nm/I544nm)与ClO-浓度具有很好的线性关系Y＝0.059+0.3796X(R2＝0.9972)，经计算可得探针1对ClO-的检出限可低至14.6nM。
实施例5：环境水样中次氯酸根离子的检测
实验分别搜集了三种真实水样，包括实验室的自来水、河水以及长江水。将真实水样进行一定的预处理，除去实际样品中的固体杂质，实验采用同样的光谱测量体系来检测探针1 对真实水样的荧光比值的变化，利用荧光滴定所得的线性方程Y＝0.059+0.3796X(R2＝0.9972) 可完成对真实水样中ClO-的定量分析。如表1，在三种不同的真实水样中分别加入了0μM、 5μM、10μM与20μM的ClO-，通过荧光光谱测试进行加标实验。如表1所示，加标实验具有良好的回收率，其数值保持在96.6％-102.2％之间，证实了该探针荧光检测的准确性。实验说明了探针1的检测效果较好，可将其运用到真实环境水样中ClO-的实时定量检测。
表1 实际水样对ClO-的检测
Figure BDA0002312946360000111
实施例6：次氯酸根检测过程中抗干扰性验证
本实施例首先对探针的荧光光谱的选择性进行了验证，由图7可知，用480nm的激发波长可使探针的应该光谱在544nm处产生一个荧光发射峰，溶液荧光为黄绿色(如插图中a所示)。加入8倍当量的ClO-后，体系在同样激发波长下的荧光发射峰强度明显降低，溶液荧光也变为了蓝色(如插图中b所示)，恢复了香豆素的初始荧光。但加入同倍量其他竞争离子 (F-、Cl-、ClO4 -、HCO3 -、CO3 2-、H2PO4 -、HPO4 2-、SO4 2-、S2O3 2-、H2O2、·OH、ONOO-、 NO2 -、ROO·、NO·、Mg2+与Cu2+)后，探针1的荧光现象基本保持不变，也没有产生明显的光谱变化。由上述研究可知探针1对ClO-荧光选择性识别能力较强。
为了进一步探讨复杂体系对ClO-定量检测的干扰情况，本实施例又讨论了ClO-对其他离子(F-、Cl-、ClO4 -、HCO3 -、CO3 2-、H2PO4 -、HPO4 2-、SO4 2-、S2O3 2-、H2O2、·OH、ONOO-、 NO2 -、ROO·、NO·、Mg2+与Cu2+)的抗干扰能力。在上述其他离子和次氯酸根离子同时存在的情况下，进行次氯酸根离子的检测，由图9可知，在常见的阴、阳离子与活性氧的存在下，探针依旧能够实现对ClO-的快速识别检测，且竞争离子对ClO-的干扰因素相对较小。实验证明，探针1对ClO-具有较好的选择性与较强的抗干扰能力，可在复杂体系中实现对ClO-的定量检测。
实施例7：细胞毒性分析及成像实验
为了评估探针1的细胞毒性，本实施例采用CCK-8法进行测试。由图10可知，用不同浓度的探针1(0-20μM)处理HeLa细胞24h，细胞存活率均能达到90％以上。上述结果表明探针1分子对活细胞几乎没有毒性。因此，为了进一步考察探针的生物应用能力，实验对外源性与内源性的ClO-分别进行了荧光成像。
为了检测外源性ClO-，本实施例采用SW 480细胞对探针1进行了荧光成像。如图11所示，加入5μM探针1的细胞在绿色通道下呈现出绿色荧光，说明探针1具有较好的细胞通透性。加入ClO-(40μM)，经培养后呈现出蓝色荧光，而绿色荧光消失，与荧光光谱测试的识别响应效果基本一致。该细胞成像实验证实了探针1对外源性ClO-监测的合理性。
本实施例还利用RAW 264.7细胞对内源性ClO-进行了荧光成像，巨噬细胞能够在LPS 和PMA的刺激下产生内源性ClO-。
由图12可知，将5μM的探针1与RAW 264.7细胞培养0.5h，该细胞在绿色通道下呈现较强的绿色荧光，由于细胞内的ClO-浓度过低，其蓝色荧光几乎没有。但当细胞与LPS培养6h，再与PMA培养0.5h之后，再次加入5μM探针1培养0.5h，用于荧光成像，发现其绿色荧光减弱，而蓝色荧光得到了明显的加强。该实验表明LPS与PMA的双重作用可使巨噬细胞产生ClO-，初步实现了对细胞中内源性ClO-荧光检测，为生物体的目标离子检测提供了理论与实践基础。
综上，本发明的探针可以实现内源性或外源性次氯酸根离子是否存在这一信息的获取。

Claims (9)

1.一种比率型荧光探针，所述的比率型荧光探针化学式为C29H16N4O6，结构式如下：
Figure FDA0002312946350000011
2.权利要求1所述的比率型荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
称取化合物6-溴-2-(2-吗啉代乙基)-1H-苯并[异]喹啉-1,3(2H)-二酮与香豆素醛溶解于乙醇中，滴加少量冰醋酸于混合物之中，加热搅拌反应，反应液冷却至室温，加入冰水，使其冷却重结晶，过滤溶液得到粗产品，经柱色谱分离将粗产品进行提纯，旋蒸干燥得黄色固体，即比率型荧光探针。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述6-溴-2-(2-吗啉代乙基)-1H-苯并[异]喹啉-1,3(2H)-二酮的加入量为92-112mg，所述香豆素醛的加入量为51-91mg，所述乙醇加入量为2-7mL。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述6-溴-2-(2-吗啉代乙基)-1H-苯并[异]喹啉-1,3(2H)-二酮的加入量为102mg，所述香豆素醛的加入量为71mg，所述乙醇加入量为5mL。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述冰醋酸加入量0.1-0.5mL。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述加热至30-50℃搅拌1-3h。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述加热至40℃搅拌2h。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述洗脱时的洗脱液为比例为二氯甲烷和甲醇的混合液，其中二氯甲烷和甲醇的体积比为二氯甲烷：甲醇＝(10-30)：1。
9.权利要求1所述的比率型荧光探针在内源性、外源性或水环境中ClO-检测中的应用。
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