CN114790200B - 一种荧光增强型锌离子检测荧光探针eno及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种荧光增强型锌离子检测荧光探针ENO及其制备方法和应用，该荧光增强型锌离子检测荧光探针ENO以色酮‑3‑甲醛和异喹啉酰肼为荧光基团，其结构如下式I所示。本发明的荧光增强型锌离子检测荧光探针ENO对锌离子拥有很强的选择性，响应时间快，低检出限以及肉眼可见的颜色变化，而且在环境水溶液和细胞锌离子检测中具有良好的应用。本发明以色酮‑3‑甲醛和异喹啉酰肼为荧光基团，通过缩合反应制备希夫碱型荧光探针ENO，该荧光探针制备方法简单，原料易得，所得产品为淡黄色固体粉末，易于存储。

Description

一种荧光增强型锌离子检测荧光探针ENO及其制备方法与 应用

技术领域

本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种基于色酮-异喹啉为母体的荧光增强型锌离子检测荧光探针ENO及其制备方法和应用。

背景技术

有机小分子荧光探针由于其选择性好，灵敏度高，检测时间短，操作简单，检测成本低，毒性低以及可视化等优点在检测环境和生物中微量重金属的研究中引起了广泛的关注。在各类金属中，锌离子(Zn²⁺)作为人体内第二丰富的过渡金属离子，广泛分布于人体细胞和体液中。但是，不均衡的锌离子摄入也会导致一系列不良反应，尤其在免疫力调节和神经系统控制方面。此外，过量的锌离子在土壤中积累也会影响植物的生长。因此，设计与制备新型有机小分子荧光探针定性和定量检测锌离子至关重要。近年来，虽然，一系列检测和识别Zn²⁺的荧光探针已被不同研究团队设计并制备，但其中很多只能应用于有机溶液中，这限制了它们在环境和生物系统中的潜在应用。同时，还有一些报道Zn²⁺荧光探针显示出相对较低的选择性，并且受到其他金属离子的干扰，尤其是与Zn²⁺同主族的Cd²⁺，具有与Zn²⁺相似的光谱性质.更重要的是，由于Zn²⁺独特的外层电子构型(3d⁰)不会产生光谱或磁信号。因此，设计和合成一种在绿色溶液中具有高选择性和灵敏度的荧光探针来检测和监测Zn²⁺是一个巨大的挑战。

色酮衍生物是存在于几种植物中的天然含氧杂环化合物。由于其高抗氧化活性，它们表现出多种健康益处和多种医学应用，例如抗炎、抗真菌、抗血小板、抗菌活性和抗癌。希夫碱荧光探针作为一种常见的荧光传感器，由于其具有很强的金属识别能力和一步合成工艺而受到越来越多的关注。为了确保希夫碱传感器的优异性能，引入强荧光团是必要的。色酮衍生物，作为一类含氧的杂环有机小分子，具有良好的光谱性质，是一种优良的荧光母体。综上所述，设计开发具有高灵敏度、高选择性，低检出限以及溶解性好的具有色酮骨架的席夫碱荧光探针检测环境和生命中痕量锌离子具有重要的使用价值。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种荧光增强型锌离子检测荧光探针ENO，该荧光探针ENO对锌离子具有很高的选择性，低检出限，响应时间短，可以快速地检测环境和生物系统中微量的锌离子。

本发明还提供了荧光增强型锌离子检测荧光探针ENO的制备方法和应用。

技术方案：为实现上述发明目的，本发明所述一种荧光增强型锌离子检测荧光探针ENO，以具有生物活性的色酮和异喹啉为荧光母体，其结构式如下式Ⅰ所示：

作为优选，所述荧光增强型锌离子检测荧光探针ENO以色酮-3-甲醛和异喹啉酰肼为荧光基团，具有大π共轭体系和较强的金属络合能力。

本发明所述的荧光增强型锌离子检测荧光探针ENO的制备方法，包括如下步骤：

将异喹啉羧酸通过酯化反应得到中间体异喹啉羧酸甲酯，然后以异喹啉羧酸甲酯为原料和水合肼通过取代反应得到异喹啉酰肼，以异喹啉酰肼和化合物色酮-3-甲醛通过缩合反应得到荧光探针ENO。

其中，所述异喹啉羧酸加入并溶解到有机溶剂甲醇中，然后加入浓硫酸，回流搅拌，待反应完全后，除去有机溶剂，得到的中间体异喹啉羧酸甲酯粗品，直接加入水合肼，加热回流搅拌，待反应完全后将反应液冷却至室温后，减压蒸馏除去有机溶剂，萃取，分液，干燥，除去溶剂后，通过柱层析得到最终目标原料A异喹啉酰肼。

其中，所述异喹啉酰肼和色酮-3-甲醛溶解于有机溶剂甲醇中，将混合物料回流搅拌，反应完成后，将反应物料冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，将粗产物通过重结晶纯化，得到荧光探针ENO。

作为优选，所述将异喹啉酰肼和色酮-3-甲醛溶解于甲醇溶剂中，在N₂保护下，将反应体系于70-80℃下回流搅拌3-4个小时，反应完成后，将反应体系冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，将粗产物通过重结晶纯化，得到荧光探针分子ENO。

作为优选，所述荧光增强型锌离子检测荧光探针ENO制备的反应路线如下所示：

所述反应路线中：中间体为异喹啉酰肼(A)；色酮-3-甲醛(B)；(E)-N'-((4-氧代-4-氢-色-3-基)亚甲基)异喹啉-1-碳酰肼(ENO)为本发明所述检测锌离子荧光探针分子。

作为优选，所述ENO的制备过程包括：

(1)异喹啉酰肼(A)的制备

将异喹啉羧酸溶解于甲醇溶剂中，加入浓硫酸作为催化剂，将混合物料加热回流搅拌，反应完成后，将反应物料冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，将粗产物通过用二氯甲烷进行萃取，分液，无水硫酸镁干燥，减压蒸馏除去溶剂，得到粗产物1-异喹啉羧酸甲酯。然后，将粗产品异喹啉羧酸甲酯和水合肼溶于甲醇溶剂中，加热回流搅拌，反应完成后，将反应物料冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析(乙酸乙酯：石油醚＝1:3)得到目标原料异喹啉酰肼(A)。

(2)制备荧光增强型锌离子荧光探针ENO

将异喹啉酰肼(A)和色酮-3-甲醛(B)溶解于甲醇溶剂中，在N₂保护下，将反应体系于80℃下回流搅拌，反应完成后，将反应体系冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，将粗产物通过重结晶纯化，得到荧光探针分子ENO。

本发明所述的荧光增强型锌离子检测荧光探针ENO在痕量锌离子检测中的应用。

其中，所述荧光增强型锌离子检测荧光探针ENO在检测细胞中痕量锌离子的应用。

其中，所述荧光增强型锌离子检测荧光探针ENO通过荧光试纸在检测环境溶液中痕量锌离子中的应用。

本发明所述锌离子检测荧光探针ENO以色酮-3-甲醛和异喹啉酰肼为荧光基团，且通过一步希夫碱缩合而制备。本发明设计了一种全新结构的以基于色酮-3-甲醛为母体的席夫碱型荧光探ENO。该锌离子检测荧光探针母体结构中，色酮-3-甲醛衍生物存在于几种植物中的天然含氧杂环化合物。由于其高抗氧化活性，它们表现出多种健康益处和多种医学应用。异喹啉酰肼衍生物具有刚性平面结构和大π键共轭体系，同时具有细胞毒性低，结构可修饰等优点，是很好的发色团。本探针与现有技术中以嘌呤为母体的探针(PTAHN)以及以1,8-萘酰亚胺为母体的探针(NFP)相比，合成路线短，产率高，原料成本低，而且对Zn²⁺具有独特的灵敏度、检出限低，可以成功地制备固体荧光试纸检测水溶液中的微量Zn²⁺。其次，该荧光增强型荧光探针ENO由于毒性低以及广阔的pH适用范围，成功用于检测活性HeLa细胞中微量的锌离子。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明通过利用一步法通过色酮-3-甲醛和异喹啉酰肼缩合制备具有色酮-异喹啉为母体的荧光探针。该荧光探针对锌离子具有专一性识别，响应时间短，灵敏度高，对溶液中Zn²⁺表现出高灵敏度，高选择性以及低检出限(34nM)，更重要的是该探针制备方法简单，所得产品为固体粉末，易于存储，稳定性好。可以制备固体荧光试纸，随时可视化地定量检测环境水样中的微量锌离子。

本发明设计开发的荧光增强型荧光探针ENO是具有高灵敏度、高选择性，低检出限以及溶解性好的有色酮骨架的席夫碱荧光探针，对于检测环境和生命中痕量锌离子具有重要的使用价值。

附图说明

图1为实施例1中制得的锌离子荧光探针在(EtOH:H₂O:Hepes)(v/v/v＝9:1:0.1)溶液中对不同浓度锌离子(Zn²⁺)的紫外吸收光谱图以及颜色变化图(图1插图中左边为无色，右边淡黄色)；

图2为实施例1中制得的锌离子荧光探针在(EtOH:H₂O:Hepes)(v/v/v＝9:1:0.1)溶液中对不同金属离子选择性荧光光谱图以及颜色变化图(图2插图中左边为无色，右边金色)；

图3为实施例1中制得的荧光探针在(EtOH:H₂O:Hepes)(v/v/v＝9:1:0.1)溶液中对不同浓度锌离子(Zn²⁺)的荧光光谱响应图；

图4为实施例1中制得的荧光探针在(EtOH:H₂O:Hepes)(v/v/v＝9:1:0.1)溶液中对不同金属离子选择干扰性检测的荧光响应图；

图5为实施例1中制得的荧光探针在(EtOH:H₂O:Hepes)(v/v/v＝9:1:0.1)与锌离子(Zn²⁺)络合比的Job-plot曲线；

图6为实施例1中制得的荧光探针检测锌离子时的响应时间图；

图7为实施例1中制得的荧光探针在(EtOH:H₂O:Hepes)(v/v/v＝9:1:0.1)与锌离子(Zn²⁺)在不同pH值(2至12)范围内荧光响应图；

图8为实施例1制得的荧光探针以及荧光探针与锌离子络合后的最优构型图；

图9为实施例1制得的荧光探针制备的荧光试纸，在测试不同浓度锌离子的颜色变化图；

图10为实施例1中制得的荧光探针细胞毒性检测结果图；

图11为实施例1中制得的荧光探针在活性HeLa细胞中检测痕量锌离子的应用；

图12为实施例1中制得的荧光探针的质谱¹H NMR谱图；

图13为实施例1中制得的荧光探针的质谱Ms谱图；

图14为实施例1中制得的荧光探针的红外IR谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实验所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中所选用的以下所有试剂皆为市售分析纯或化学纯。

其中，实施例中各种属离子溶液是由纯度为99％以上的氯化盐化学试剂如无水氯化锌、无水氯化铁、氯化锌等加去离子水配置而成的。

实施例1

基于色酮-3-甲醛为母体的荧光探针ENO的具体合成路线：

(1)制备中间体1-异喹啉酰肼

将异喹啉-1-羧酸(1.73g,10mmol)溶解于甲醇溶剂(50mL)中，搅拌溶解的条件下，滴加市售浓硫酸(98％)(1mL)作为催化剂，然后将反应体系升温至70℃搅拌回流12个小时。将反应体系冷却至室温，减压蒸馏除去有机溶剂，得到粗产物异喹啉羧酸甲酯。向含有粗产品的圆底烧瓶加入水合肼(0.1g,20mmol)和有机溶剂甲醇(30mL)，继续升温至70℃搅拌回流3个小时。反应结束后，将反应体系冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，粗产物通过柱层析(乙酸乙酯：石油醚＝1:3)得到目标原料异喹啉酰肼(1.45g，78％)。

所得到的中间体异喹啉酰肼结构式为：

(2)制备基于色酮-3-甲醛为母体的锌离子荧光探针ENO

在50mL含有20ml有机溶剂甲醇的圆底烧瓶中，分别加入异喹啉酰肼(A)(0.187g,1mmol)和色酮-3-甲醛(B)(0.174g,1mmol)，搅拌溶解后，将反应体系升温至80℃回流搅拌3个小时。TLC跟踪反应检测，反应完成后，将反应体系冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，将粗产物通过重结晶(DMSO:H₂O＝1:20)纯化，得到淡黄色固体荧光探针分子ENO(0.29g,85％)。

所得到的荧光探针化合物结构式为：

本荧光探针的表征数据¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.43(s,1H),8.91(s,1H),8.80(d,J＝8.4Hz,1H),8.69(s,1H),8.63(d,J＝8.4Hz,1H),8.16–8.10(m,3H),7.92–7.86(m,2H),7.81–7.78(m,2H),7.58(t,J＝8.4Hz,1H)；ESI-MS m/z:[M+H]⁺calcd for C₂₀H₁₃N₃O₃343.1,found 344.0.IR(KBr cm^-1):3179,3039,1643,1557,1457,1316.

实施例1中制得的荧光探针的氢谱(¹H NMR)，质谱MS以及红外谱图分别如图12，图13，图14所示，说明本发明的荧光探针ENO制备成功。

实施例2

将实施例1制得的锌离子检测荧光探针ENO用EtOH配置成1mM的探针储备液，各金属离子用去离子水配置成3mM的金属离子储备液，向3mL的空白溶液(EtOH:H₂O)(v/v/v＝9:1:0.1)中加入30μL的探针储备液和50μL的金属离子储备液并用荧光光谱仪和紫外分光光度计进行检测，测试得知荧光探针的最大激发波长为450nm，最大发射波长为602nm，具体测试结果如下：

取两个比色皿，分别加入3mL含有探针储备液(30μL)的混合溶液(EtOH:H₂O)(v/v/v＝9:1)，向其中一个比色皿再加入50μL的锌离子储备液，进行紫外光谱测试。如图1所示，荧光探针本身在波长λ＝440nm处几乎无紫外吸收，一旦加入锌离子后，紫外吸收峰逐渐增强；而且，添加锌离子使探针溶液的颜色由无色变为淡黄色。结果表明探针对Zn²⁺具有很高的选择性和灵敏性。

如图2所示，锌离子检测荧光探针对各种常见金属离子选择性荧光光谱图。向3mL的空白溶液(EtOH:H₂O)(v/v/v＝9:1)中加入30μL的探针储备液和50μL的各个金属离子储备液，实验结果表明只有加入锌离子，荧光光谱在602nm处荧光强度才发生明显的增强。同时，该荧光探针在溶液中本身几乎无荧光，但随着锌离子加入，探针体系发生了明显的颜色变化，有无色变成金色，说明探针ENO是荧光增强型探针，可能原因是本发明实施例1制备的探针ENO与锌离子络合后，抑制了C＝N双键旋转，从而抑制了电子转移，荧光增强。除此之外，荧光强度明显优于加入其他金属离子时的荧光强度，说明本发明的荧光探针对锌离子有很好的选择性。

如图3所示，锌离子检测荧光探针对不同浓度锌离子(Zn²⁺)的荧光光谱响应图。向3mL的空白溶液(EtOH:H₂O)(v/v/v＝9:1)中加入30μL的探针储备液和0～100μL(0、1、2、3……10、15……50、60……100μL)的锌离子溶液(3mM的锌离子储备液)，荧光强度随着锌离子的加入逐渐增强。而且，ENO-Zn²⁺荧光强度变化与锌离子浓度增强呈直线关系，因此根据公式LOD＝3σ/k，ENO对锌离子的检出限是34nM.

如图4所示，锌离子检测荧光探针在不同干扰金属离子存在的情况下与锌离子反应后的荧光强度柱状图。向3mL的空白溶液(EtOH:H₂O)(v/v/v＝9:1)中加入30μL的探针储备液和50μL的其他任意一种金属离子(Al³⁺，Co²⁺，Pd²⁺，Ni²⁺，Cu²⁺，Cr³⁺，Cu⁺，Mn²⁺，Mg²⁺，Ba²⁺，Pd²⁺，Sn²⁺，Fe²⁺，K⁺，Sr²⁺，Ca²⁺，Sr²⁺，Na⁺，Ag⁺和Cd²⁺)储备液，最后向空白液加入50μL的Zn²⁺储备液，测试其荧光强度。结果表明，除了具有抗磁性的铜，其他金属离子对本发明锌离子荧光探针识别锌离子没有明显的干扰，说明本发明制备的探针具有抗干扰性。

如图5所示，通过Job's plot方法研究了探针与Zn²⁺的结合率，向3mL的空白溶液(EtOH:H₂O)(v/v/v＝9:1)中加入一定体积探针储备液(1mM)和Zn²⁺储备液(3mM)，使得锌离子检测荧光探针和锌离子的浓度总和为50μM，通过改变二者的浓度比(锌离子检测荧光探针和锌离子物质的量比依次为1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2，9∶1)得到602nm处的荧光强度与该浓度下锌离子荧光探针化合自身荧光强度的差值，与离子占总浓度的比例作图。通过此图5可知，当锌离子所占比例为0.5时纵坐标达到最高值，可以确定该荧光探针与锌离子之间以1∶1比例络合形成稳定的络合物[ENO-Zn²⁺]。

如图6所示，向3mL的空白缓冲液(EtOH:H₂O)(v/v/v＝9:1)中加入30μL的探针储备液和50μL的Zn²⁺储备液，探针的荧光强度迅速增强到最高，并在2min内达到稳定值。此外，探针的荧光强度在随后的10min内基本保持不变，这说明探针对于Zn²⁺检测足够稳定。

如图7所示，用1M HCl和1M NaOH调节分别含有探针ENO储备液(10μL)以及[ENO-Zn²⁺]储备液(10μL)的EtOH/H₂O溶液(1mL)，其中[ENO-Zn²⁺]储备液由探针、氯化锌溶于二次蒸馏水分别配成浓度10uM、50uM，使其具有不同的pH变化值。然后，测试这两个体系在不同pH值范围内的荧光强度。探针ENO本身在pH值从2到12的范围内几乎没有荧光强度，但是[ENO-Zn²⁺]体系在pH为5.0-8.0的范围内，荧光(602nm)强度明显增强，且在pH＝7时荧光强度达到最大值。[ENO-Zn²⁺]在强酸性条件下(pH<5.0)，荧光信号比较弱，可能原因是荧光探针ENO络合点被质子化，不容易与锌离子络合。[ENO-Zn²⁺]在强碱性条件下(pH>8.0)，荧光信号逐渐降低，可能原因是形成Zn(OH)₂沉淀，降低了[ENO-Zn²⁺]浓度。因此，ENO最适合的pH范围是6-8，ENO具有可在生物系统中具有检测痕量Zn²⁺的能力。

如图8所示，荧光探针以及[ENO-Zn²⁺]络合物的最优构型图以及其相应的能级图，DFT计算结果进一步证明了探针ENO与锌离子是通过-C＝N,-OH以及C＝O形成的四配位配合物。

如图9所示，将滤纸浸入含有荧光探针(10μM)的EtOH:H₂O(v/v/v＝9:1:0.1)储备液中，浸泡半小时，然后将测试条取出在空气中干燥，得到干燥的含有探针的试纸条。将试纸条分别浸泡在0mM、0.1mM以及1mM锌离子浓度溶液中，浸泡30分钟后，晾干，在紫外灯下，测定用荧光探针ENO溶液制备的荧光试纸以及其在测试不同浓度锌离子时的颜色变化，说明探针ENO的颜色随着锌离子浓度变化而变化，并且可以以固体状态定量检测环境中痕量锌离子。

如图10所示，将HeLa细胞以每孔约7000个细胞的密度接种到96孔培养板中，并在37℃下在5％CO₂的增湿空气中粘附12小时。然后，向每个孔中添加具有不同ENO浓度(0、2、4、6、8、10和20μM)的100μL新鲜培养基并37℃培养24小时。最后，向每个孔中添加10μL MTT试剂，37℃并再培养3小时。图10显示，ENO浓度范围为0-20μM时，细胞存活率大于95％，这表明ENO具有很低的细胞毒性和良好的生物相容性。在此基础上，进行细胞实验。如图11所示，将HeLa细胞在37℃下与ENO(10μM)在生长培养基中37℃孵育30分钟。然后用灭菌PBS缓冲液洗涤三次后，除去细胞表面过量的ENO。然后，将ENO孵育后的HeLa细胞进一步暴露于20μMZn²⁺溶液中放置另外的30分钟，然后用PBS清洗除去多余的Zn²⁺。最后，共聚焦荧光显微镜显示ENO孵育后的HeLa细胞浸入于Zn²⁺，细胞质中会有很强的蓝色荧光。而没有Zn²⁺处理的细胞没有明显的变化，这些结果说明ENO可以成功用于细胞中衡量锌离子的检测。

上述实验说明以异喹啉酰肼和色酮-3-甲醛为荧光基团，通过缩合反应制备具有色酮-异喹啉为母体荧光探针ENO，该探针对溶液中Zn²⁺表现出高灵敏度和高选择性。

Claims (2)

1.一种荧光增强型锌离子检测荧光探针ENO在制备痕量锌离子检测荧光试纸中的应用；所述荧光增强型锌离子检测荧光探针ENO，以色酮和异喹啉为荧光母体，其结构式如下式Ⅰ所示：

。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述荧光增强型锌离子检测荧光探针ENO在制备检测环境或者活细胞中痕量锌离子的荧光试纸中的应用。