CN112094270B - 一种基于嘌呤母体的镉离子检测荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

一种基于嘌呤母体的镉离子检测荧光探针及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于嘌呤母体的镉离子检测荧光探针及其制备方法与应用，该荧光探针其结构式如下式Ⅰ所示。本发明以嘌呤衍生物和喹啉‑2‑甲醛为荧光基团，水合肼为连接基团，所制备的荧光探针对溶液中Cd2+表现出高度的选择性和灵敏性，同时由于其具有结构稳定、毒性低和细胞渗透能力强，又成功用于活体细胞中的痕量金属镉离子的检测；该荧光探针制备方法步骤简单，原料易得，所得产品为固体粉末，易于存储，具有广阔的应用前景，可以大规模生产应用。
Figure DDA0002655004500000011

Description

一种基于嘌呤母体的镉离子检测荧光探针及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种基于嘌呤母体的镉离子检测荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
随着国民经济的快速发展，工业化的程度的深化，重金属污染程度有日益严峻的趋势。金属镉作为最有毒金属之一，其污染主要来源于电镀、采矿、冶炼、染料、电池和化学工业等排放的废水。镉污染是一个严重的环境问题，具有高毒性和广泛影响性，即使较低的浓度也会对骨骼、脑、肝、肺、肾及生殖系统具有不可逆转的伤害。因此，设计开发一种高灵敏度、高选择性、速度快、低成本的能够用于环境中Cd2+的实时检测的方法是一项重要的任务。
目前常用的镉离子检测方法包括原子吸收光谱法(AAS)，原子发射光谱法 (AES)，电感耦合等离子体质量探针和电化学方法，但是这些方法测试有费用昂贵，需要严谨的实验条件，以及样品预处理比较复杂以及测量时间相对较长等缺点。然而，荧光探针由于其优异的选择性、高灵敏度、检测时间短、操作简单，以及检测成本低等优点而备受关注。至今为止，已有许多有关镉离子荧光探针的报道，然而设计与制备高选择性、高灵敏度以及低毒的绿色荧光探针来实时检测低浓度的Cd2+仍然是环境与生命科学研究热点。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于嘌呤母体的镉离子检测荧光探针，该荧光探针化合物一种以嘌呤为母体且能快速检测Cd2+的希夫碱型荧光探针，其对镉离子具有专一性识别，响应时间短以及灵敏度高等优点。
本发明还提供了基于嘌呤母体的镉离子检测荧光探针的制备方法和应用。
技术方案：为实现上述发明目的，本发明所述一种基于嘌呤母体的镉离子检测荧光探针，其结构式如下式Ⅰ所示：
Figure BDA0002655004480000011
本发明所述的基于嘌呤母体的镉离子检测荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
先将4,6-二氯-5-氨基嘧啶和1-萘胺通过取代反应得到中间体Ⅱ；再以中间体Ⅱ和乙酸为原料，于有机溶剂中进行合环反应，得到中间体Ⅲ；再将中间体Ⅲ溶于有机溶剂中与水合肼发生取代反应，得到中间体IV；最后将中间体IV和喹啉-2-甲醛通过缩合反应得到基于嘌呤母体的荧光探针化合物Ⅰ；
其反应路线如下所示：
Figure BDA0002655004480000021
其中，4,6-二氯-5-氨基嘧啶和1-萘胺加入到有机溶剂中，待固体溶解后加入浓盐酸，回流搅拌，待反应完全后，通过减压蒸馏除去有机溶剂，用NaOH溶解，然后用乙酸乙酯进行萃取，后用减压蒸馏的方法除去乙酸乙酯，用甲醇与水重结晶，得到Ⅱ式中间体。
其中，所述Ⅱ式中间体、乙酸、多聚磷酸和十二烷基三甲基氯化铵溶于三氯氧磷中，进行回流搅拌，待反应完全后将反应液完全冷却至室温后，通过减压蒸馏除去有机溶剂，在冰水浴的条件下向反应体系中加入冰水混合物，通过硅胶柱色谱法纯化，使用CH3OH/CH2Cl2(v/v，1/250)洗脱，减压蒸馏除去溶剂后得到式Ⅲ中间体。
其中，所述式Ⅲ中间体溶于乙醇后，待固体溶解后，加入水合肼，进行回流搅拌，待反应完全后，将反应物冷却至室温，抽滤，用有机溶剂洗固体，得到式IV中间体。
其中，所述式IV中间体和喹啉-2-甲醛溶解于乙醇中，在N2保护下，将混合物料进行回流搅拌，通过点板(TLC)跟踪反应完成后，将反应物料冷却至室温，减压除去溶剂，将粗产物通过重结晶纯化，得到荧光探针Ⅰ。
作为优选，合成路线如下式所示：
Figure BDA0002655004480000031
其中，式Ⅱ中间体为6-氯-N4-(萘-1-基)嘧啶-4,5-二胺,式Ⅲ中间体为6- 氯-9-(萘-1-基)-8-甲基-9H-嘌呤，式IV中间体为6-肼基-9-(萘-1-基)-8-甲基 -9H-嘌呤，式Ⅰ化合物3-((2-(8-甲基-9-(萘-1-基)-9H-嘌呤-6-基)肼基)甲基)喹啉为本发明所述检测镉离子荧光探针。
进一步地，所述制备过程包括：
(1)制备Ⅱ式中间体
将4,6-二氯-5-氨基嘧啶和1-萘胺加入到有机溶剂中，待溶解后加入12mol/L 浓盐酸，在65℃下回流搅拌，待反应完全后，减压除去有机溶剂，用1M NaOH 溶解，然后用乙酸乙酯进行萃取，后在45～55℃的条件下减压蒸馏除去乙酸乙酯，用甲醇与水重结晶，得到Ⅱ式中间体。
(2)制备Ⅲ式中间体
将所述Ⅱ式中间体、乙酸、多聚磷酸、十二烷基三甲基氯化铵溶于三氯氧磷中，在80℃下回流搅拌，待反应完全后将反应液冷却至室温后，减压蒸馏除去有机溶剂，在0～5℃冰水浴下向反应体系中加入冰水混合物，CH3OH/CH2Cl2 (v/v，1/250)洗脱，减压蒸馏除去溶剂后得到式Ⅲ中间体。
(3)制备IV式中间体
将所述式Ⅲ中间体溶于乙醇后，加入水合肼，在80℃回流搅拌，待反应完全后，将反应物冷却至室温，抽滤，用有机溶剂洗固体3次，得到式IV中间体。
(4)制备基于嘌呤母体的检测镉离子荧光探针Ⅰ
将式IV中间体和喹啉-2-甲醛溶解于有机溶剂中，在N2的保护下，将反应体系于80℃下回流搅拌，反应完成后，将反应体系冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，将粗产物通过重结晶纯化，得到荧光探针化合物Ⅰ。
本发明所述的基于嘌呤母体的镉离子检测荧光探针在检测溶液以及活体细胞中镉离子中的应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明以嘌呤环和喹啉-2-甲醛为荧光基团，水合肼为连接基团，合成了一种基于嘌呤母体的镉离子荧光探针，该制备方法原料易得，方法简单，所得产品为固体粉末，易于存储，稳定性好；选用嘌呤类衍生物为平面钢性平面，具有生物毒性低，氮原子与金属结合能力强等优点。该荧光探针对镉离子具有专一性识别，响应时间短，灵敏度高，对溶液中痕量Cd2+表现出高灵敏度和高选择性，同时由于其具有结构稳定、毒性低和细胞渗透能力强，又成功用于检测活体细胞中的痕量金属镉离子。
附图说明
图1为实施例1中制得的检测镉离子荧光探针在EtOH-H2O(v/v＝9:1)溶液中对荧光探针本身和加入镉离子(Cd2+)后的荧光探针的紫外吸收对比光谱图；
图2为实施例1中制得的检测镉离子荧光探针在EtOH-H2O(v/v＝9:1)溶液中对不同金属离子选择性荧光光谱图；
图3为实施例1中制得的检测镉离子荧光探针在EtOH-H2O(v/v＝9:1)溶液中对不同浓度镉离子(Cd2+)的荧光光谱响应图；
图4为实施例1中制得的检测镉离子荧光探针在EtOH-H2O(v/v＝9:1)溶液中对不同金属离子选择干扰性检测的荧光响应图；
图5为实施例1中制得的检测镉离子荧光探针检测镉离子时的响应时间图；
图6为实施例1中制得的检测镉离子荧光探针在EtOH-H2O(v/v＝9:1)与镉离子(Cd2 +)络合比的Job-plot曲线；
图7为实施例1中制得的检测镉离子荧光探针与镉离子(Cd2+)结合后在 MTT细胞中的毒性图；
图8实施例1中制得的检测镉离子荧光探针与镉离子(Cd2+)结合前后在活体细胞HeLa cells荧光检测图；
图9为实施例1中制得的检测镉离子荧光探针与不同浓度的镉离子(Cd2+) 所制备的探针试纸；
图10为实施例1中制得的检测镉离子荧光探针的质谱MS谱图；
图11为实施例1中制得的检测镉离子荧光探针的核磁共振1H-NMR谱图；
图12为实施例1中制得的检测镉离子荧光探针的核磁共振13C-NMR谱图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
本发明中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实验所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中所选用的以下所有试剂皆为市售分析纯或化学纯。
其中，实施例中各种属离子溶液是由纯度为99％以上的氯化盐化学试剂如无水氯化镉、无水氯化铁等加去离子水配置而成的。
实施例1
基于嘌呤母体的检测镉离子荧光探针，采用如下方法制备而成：
(1)制备中间体Ⅱ(6-氯-N4-(萘-1-基)嘧啶-4,5-二胺)
在100mL圆底烧瓶中，加入5-氨基-4、6-二氯嘧啶(5.00g，30mmol)和 1-萘胺(8.58g，60mmol)并溶于50mL甲醇，然后加入5mL的12mol/L HCl。将混合物在65℃下回流搅拌5天。待反应液冷却，通过减压蒸馏除去有机溶剂，。然后将得到的全部粗产品溶于50mL的1mol/L的NaOH溶液中，并将混合物用乙酸乙酯萃取3次，减压蒸馏的方法除去乙酸乙酯。有机相用1.2mol/L的HCl 洗涤，然后用饱和食盐水除水，干燥，得到粗产物。粗产物用CH3OH/H2O(v/v， 1∶5)重结晶，干燥后得到中间体Ⅱ，为浅紫色固体粉末(5.75g，收率71％)。
所得中间体Ⅱ的结构式为：
Figure BDA0002655004480000061
(2)制备中间体Ⅲ(6-氯-9-(萘-1-基)-8-甲基-9H-嘌呤)
将中间体Ⅱ(1.00g，3.70mmol)，乙酸(1.41g，18.50mmol)和DTAC(0.10 g，10％mmol)溶解在25mL POCl3中，待上述固体物质溶解后加入多聚磷酸(5.00 g，14.80mmol)。将反应混合物在80℃下回流搅拌72小时。待反应完成后，通过减压蒸馏除去有机溶剂，得到深褐色的油状物。冰水浴下向反应体系中加入 100mL冰水混合物，搅拌后析出大量固体，抽滤，得到粗产物，通过硅胶柱色谱法纯化，使用CH3OH/CH2Cl2(v/v，1/250)洗脱，减压蒸馏除去溶剂后得到中间体Ⅲ，为浅黄色固体(0.68g，收率56％)。
所得中间体Ⅲ的结构式为：
Figure BDA0002655004480000062
(3)制备中间体IV(6-肼基-9-(萘-1-基)-8-甲基-9H-嘌呤)
将中间体Ⅲ(0.25g，0.80mmol)溶解在20mL乙醇中，然后加入水合肼(0.25 g，4mmol)。将混合液在80℃下回流搅拌3小时。反应完成后，将反应液冷却至室温，有大量固体析出，抽滤，并用冰甲醇冲洗三遍，干燥后得到白色粉末(0.18 g，70％)。
所得中间体IV的结构式为：
Figure BDA0002655004480000063
(4)制备基于嘌呤母体的检测镉离子荧光探针Ⅰ
将中间体IV(100mg,0.28mmol)和喹啉-2-甲醛(65mg,0.40mmol)溶解在20mL甲醇中，在N2保护下，将反应液在80℃下回流搅拌5小时。点板(TLC) 跟踪反应完成后，将反应物料冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂。将粗产物通过石油醚-乙酸乙酯重结晶纯化，加入少量的乙酸乙酯溶解粗产物后，加入大量的石油醚至浑浊，放置冰箱里冷藏待晶体析出即可，过滤，干燥后得到基于嘌呤母体的镉离子荧光探针Ⅰ，为鹅黄色粉末(90mg，78％)。
所得到的荧光探针化合物结构式为：
Figure BDA0002655004480000071
本发明制得的检测镉离子荧光探针1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.91 (s,1H),8.52(s,1H),8.42(d,J＝8.7Hz,1H),8.37(s,1H),8.20(d,J＝10.1Hz,1H), 8.09(s,2H),8.00(d,J＝6.9Hz,1H),7.87–7.81(m,1H),7.72(d,J＝10.3Hz,1H), 7.69–7.62(m,1H),7.56(d,J＝9.7Hz,3H),7.51–7.45(m,1H),7.16(s,1H),2.41 (s,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ153.69,153.36,152.25,145.34,136.54, 134.66,130.76,130.28,130.14,129.98,129.30,128.84,128.15,127.87,128.15, 127.87,127.27,126.46,125.69,121.93,118.86,14.58.
实施例1中制得的荧光探针的质谱MS谱图、核磁共振1H-NMR谱图、核磁共振13C-NMR谱图分别如图10、图11和图12所示，说明本发明的荧光探针成功合成。
实施例2
将实施例1制得的检测镉离子荧光探针用EtOH配置成1mM的探针储备液，各金属离子用去离子水配置成3mM的金属离子储备液，向3mL的空白溶液 EtOH-H2O(v/v＝9：1)中加入30μL的探针储备液和50μL的金属离子储备液并用荧光光谱仪和紫外分光光度计进行检测，测试得知荧光探针的最大激发波长为 396nm，最大发射波长为532nm，具体测试结果如下：
取两个比色皿，分别加入3mL的空白溶液EtOH-H2O(v/v＝9：1)中和30μ L的探针储备液，向其中一个比色皿加入50μL的镉离子储备液，另外一个比色皿不加镉离子储备液，进行紫外光谱测试。实验结果如图1所示，荧光探针化合物本身在波长λ＝360nm处有较强的紫外吸收，当往溶液中加入镉离子后，360 nm处的紫外吸收峰渐渐的减弱，除此之外，在波长λ为370nm和425nm处的紫外吸收增强。此外，添加镉离子导致探针溶液的荧光颜色分别从无变为亮黄色。结果表明探针对Cd2+具有很高的灵敏度，肉眼可见的颜色变化是由于探针和Cd2+之间形成了新的配合物。
如图2所示，检测镉离子荧光探针加入各种金属离子后的荧光光谱图。向3 mL的空白溶液EtOH-H2O(v/v＝9：1)中分别加入30μL的探针储备液和50μL 的各种金属离子储备液，实验结果表明加入镉离子时，荧光光谱在532nm处荧光强度发生了明显的增强，在365nm紫外灯下为绿色荧光，而加入其他金属离子时，荧光无明显变化，即本发明的荧光探针对镉离子有很好的选择性。
如图3所示，为本发明的镉离子荧光探针对不同浓度镉离子(Cd2+)的荧光光谱响应图。向3mL的空白溶液EtOH-H2O(v/v＝9：1)中分别加入30μL的探针储备液和0～60μL(0、1、2、3……50、55、60μL)的镉离子溶液(3mM的镉离子储备液)，该荧光探针在溶液中本身几乎无荧光，但随着镉离子浓度的增加，在532nm处荧光也在不断的增强，说明荧光强度随着镉离子浓度的增加而增加。
如图4所示，检测镉离子荧光探针在不同干扰金属离子存在的情况下与镉离子反应后的荧光强度柱状图。向3mL的空白溶液EtOH-H2O(v/v＝9：1)中加入 30μL的探针储备液和50μL的其他任意一种金属离子(Co2+,Pd2+,Ni2+,Al3+, Mn2+,Mg2+,Ba2+,Pb2+,Fe2+,Cd2+,K+,Ca2+,Cs2+,Na+,Ag+和Cu2+等)储备液，最后向空白液加入50μL的Cd2+储备液，测试其荧光强度。结果表明，除了铜离子外，其它金属离子的存在对本发明检测镉离子荧光探针识别镉离子无明显干扰。
如图5，向3mL的空白缓冲液EtOH-H2O(v/v＝9：1)中加入30μL的探针储备液和50μL的Cd2+储备液，探针的荧光强度迅速增强到最高，并且在1分钟内达到荧光最大值。此外，在加入Cd2+响应60分钟后，探针的荧光强度几乎保持不变，这说明探针对于Cd2+检测足够稳定，而且响应速度快。
如图6所示，通过Job's plot方法研究了荧光探针与Cd2+的结合率，向3mL 的空白溶液EtOH-H2O(v/v＝9：1)中加入一定体积探针储备液(1mM)和Cd2+储备液(3mM)，检测镉离子荧光探针和镉离子的浓度总和为50μM，通过改变二者的浓度比(荧光探针和镉离子物质的量比依次为1∶9，2∶8，3∶7，4∶6， 5∶5，6∶4，7∶3，8∶2，9∶1)得到532nm处的荧光强度与该浓度下镉离子荧光探针化合自身荧光强度的差值，与离子占总浓度的比例作图。通过此图6可知，当镉离子所占比例为0.33时纵坐标达到最高值，可以确定该荧光探针与镉离子之间主要以1∶2形式结合形成稳定的络合物。
如图7所示，对不同浓度(0-18μM)的荧光探针进行了标准MTT分析，以确定本发明的荧光探针的细胞毒性。在96孔板中接种含有10μM的镉离子溶液 (100μL/孔)，并将10μL0-18μM(0、2、4、6、8、10、12、14、16、18μM) 的探针的细胞悬液接种到孔板中。将培养板放在培养箱预培养(在37℃，5％CO2的条件下)。然后向每孔注射10μL的MTT溶液，将培养板在培养箱内孵育2h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，所获得的细胞生存力结果表明24小时后有大于90％的细胞存活，这表明本发明的镉离子探针在实验环境中具有较低的细胞毒性。这可以说明探针在检测活细胞中的镉离子具有潜在应用。
如图8所示，荧光探针与镉离子结合前后在HeLa细胞中的成像图。将1× 105HeLa细胞接种到35毫米玻璃底组织培养皿中。当细胞密度达到60％时，将 DMEM培养基替换为包含20μM氯化镉的无血清培养基。在37℃下培育30分钟后，将细胞用PBS洗涤3次。然后，将探针加入新的DMEM培养基中(探针终浓度为10μM)。作为对照，将未经氯化镉处理的HeLa细胞与10μM探针直接孵育。进一步孵育30分钟后，将细胞用PBS洗涤3次，并立即通过激光共聚焦显微镜成像。结果显示，加入探针和Cd2+的细胞可以观察到细胞的蓝色荧光显着增加，归因于探针-Cd2+络合物的形成。因此，活细胞内部的细胞成像表明探针是可透过细胞膜的，可以有效地用于活细胞中Cd2+的细胞内成像，进一步表明该荧光探针可以应用于生物体实验。
如图9，将滤纸浸入含有荧光探针(1mM)的EtOH-H2O(v/v＝9：1)储备溶液中，浸泡半小时，然后将测试条取出在空气中干燥，得到干燥的含有探针的试纸条。将试验条分别浸泡在0mM、0.05mM、0.1mM、0.5mM、1mM镉离子浓度溶液中，浸泡几分钟后，晾干，在365nm紫外灯下观察到图8所示的快速变色的条带，说明本发明的探针可以以固体状态检测镉离子。

Claims (7)

1.一种基于嘌呤母体的镉离子检测荧光探针，其结构式如下式Ⅰ所示：
Figure FDA0003251627480000011
2.一种权利要求1所述的基于嘌呤母体的镉离子检测荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
先将4,6-二氯-5-氨基嘧啶和1-萘胺通过取代反应得到中间体Ⅱ；再以中间体Ⅱ和乙酸为原料，于有机溶剂中进行合环反应，得到中间体Ⅲ；再将中间体Ⅲ溶于有机溶剂中与水合肼发生取代反应，得到中间体IV；最后将中间体IV和喹啉-2-甲醛通过缩合反应得到式I所示的基于嘌呤母体的荧光探针；
其反应路线如下所示：
Figure FDA0003251627480000012
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述4,6-二氯-5-氨基嘧啶和1-萘胺加入到有机溶剂中，待固体溶解后加入浓盐酸，回流搅拌，待反应完全后，通过减压蒸馏除去有机溶剂，用NaOH溶解，然后用乙酸乙酯进行萃取，后用减压蒸馏的方法除去乙酸乙酯，用甲醇与水重结晶，得到中间体Ⅱ。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，将所述中间体Ⅱ、乙酸、多聚磷酸和十二烷基三甲基氯化铵溶于三氯氧磷中，进行回流搅拌，待反应完全后将反应液完全冷却至室温后，通过减压蒸馏除去有机溶剂，在冰水浴的条件下向反应体系中加入冰水混合物，纯化洗脱，减压蒸馏除去有机溶剂得到中间体Ⅲ。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述中间体Ⅲ溶于乙醇后，待固体溶解后，加入水合肼，进行回流搅拌，待反应完全后，将反应物冷却至室温，抽滤，用有机溶剂洗涤固体，得到中间体IV。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述中间体IV和喹啉-2-甲醛溶解于有机溶剂中，将混合物料进行回流搅拌，反应完成后，将反应物料冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，将粗产物通过重结晶纯化，得到式I所示的荧光探针。
7.一种权利要求1所述的基于嘌呤母体的镉离子检测荧光探针在检测溶液以及活体细胞中镉离子中的应用。
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