CN109867611B

CN109867611B - 一种用于红酒和活体内硫化氢检测的水溶性双光子硫化氢荧光探针及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109867611B
Application number: CN201811471008.0A
Authority: CN
Inventors: 周礼义
Original assignee: Hunan University of Technology
Current assignee: Hunan University of Technology
Priority date: 2018-12-04
Filing date: 2018-12-04
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2038-12-04
Also published as: CN109867611A

Abstract

本发明属于化学分析检测领域，具体公开了一种可以直接用于红酒，癌细胞和组织内硫化氢检测的水溶性双光子荧光探针及其制备方法和应用。所述荧光探针以具有双光子性质的香豆素衍生物为信号基团，以2，4‑二硝基苯醚为硫化氢识别基团；其结构由式(Ⅰ)表示。该荧光探针水溶性好，选择性强，抗干扰能力优越，灵敏度高，可直接用于红酒，癌细胞和组织内硫化氢的快速检测，具有很好的应用前景。

Description

一种用于红酒和活体内硫化氢检测的水溶性双光子硫化氢荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于化学分析检测技术领域，更具体的，涉及一种用于红酒和活体内硫化氢检测的水溶性双光子硫化氢荧光探针及其制备方法和应用，本发明所述荧光探针尤其适用于在检测红酒，癌细胞和组织中硫化氢的应用。

背景技术

硫化氢（H₂S）是一种有毒的污染物，具有强烈的“臭鸡蛋”香气，是酵母发酵产生的一种常见的葡萄酒成分，是世界葡萄酒生产和贮藏过程中的典型问题。

近年来，作为卓越的检测技术，荧光探针因为它的高选择性、高敏感性及实时成像性，已经越来越引起人们的高度关注，被广泛应用于各种物质的检测。最近的研究表明，H₂S是一种内源性气体信号分子，是由合成半胱氨酸和同型半胱氨酸从哺乳动物组织通过酶如胱硫醚β-合成酶（CBS）和胱硫醚γ行动-裂解酶（CSE）生成的，在许多生理和病理过程中起着关键作用，如阿尔茨海默氏病、高血压、唐氏综合征，心脏缺血性疾病，动脉粥样硬化。为了加深理解化学和H₂S的生物特性，高灵敏度、高选择性的方法在活体内源性H₂S检测的迫切需要和重要意义。

目前检测硫化氢的荧光探针很少，合成一种高灵敏度，高选择性，能够快速便捷的检测红酒，癌细胞和组织中的硫化氢荧光探针具有重要的意义和实用价值。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种用于红酒和活体内硫化氢检测的水溶性双光子硫化氢荧光探针。该荧光探针分子合成简单、反应条件温和、合成成本低，对硫化氢具有高灵敏度，高选择性，且能实现用荧光法快速便捷的检测红酒，癌细胞和组织中的硫化氢。

本发明还提供了该荧光探针的制备方法。

本发明还提供了该荧光探针的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

一种水溶性双光子硫化氢荧光探针，以具有双光子性质的香豆素衍生物为信号基团，以2，4-二硝基苯醚为硫化氢识别基团；其结构由式（Ⅰ）表示：

（Ⅰ）。

本发明还提供了一种水溶性双光子硫化氢荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

S1. 将4-（二乙氨基）水杨醛、2，4-二硝基卤苯和碳酸钾加入反应器中，加入适量的乙腈做溶媒，60~80℃下反应，反应至4-（二乙氨基）水杨醛完全消失为止，把反应体系冷却到室温后倒入冰水中，待固体析出后，过滤、洗涤后得到的黄色固体，干燥后得到粗产物，其结构式由式（Ⅱ）表示：

（Ⅱ）；

S2. 将步骤S1所得粗产物、氰基乙酸溶解在无水乙醇中，同时加入适量的哌啶作为催化剂，加热回流，在惰性气氛下反应至步骤S1所得粗产物完全消失为止；把反应体系冷却到室温后倒入冰水中，待固体析出后，过滤、洗涤后得到的黄色固体，干燥后得式（Ⅰ）所述化合物。

本发明荧光探针的合成路线如图1所示。

本发明的荧光探针使用方法为：将探针分子溶解在pH=7.4的PBS缓冲溶剂中，在室温下进行测试。当加入Na₂S时，2，4-二硝基苯醚基团可以在硫化氢的诱导下裂解，使荧光得以恢复，探针与硫化氢的响应机理如图2所示。

本发明的荧光探针的具体特征为：探针本身无明显的发射峰，但是与硫化氢作用后，探针分子在485nm处有明显的发射峰，荧光强度增强了85倍。

优选地，步骤S1中，所述强极性溶剂为四氢呋喃，DMF，DMSO或乙腈中的一种；进一步优选为乙腈。

优选地，步骤S1中，4-（二乙氨基）水杨醛、2，4-二硝基卤苯和碳酸钾的摩尔比为1：1~2：2~4。

优选地，步骤S2中，所述有机溶剂为甲苯，苯，甲醇，无水乙醇中的一种；进一步优选为无水乙醇。

优选地，步骤S2中，所述粗产物与氰基乙酸的摩尔比为1：1~4。

优选地，步骤S1或S2中，在反应过程中均采用薄层色谱法跟踪反应。

优选地，步骤S1或S2中，待固体析出后，抽滤并用冷水洗涤3次，得到的固体用恒温干燥箱干燥。

本发明还提供了水溶性双光子硫化氢荧光探针的应用，所述应用是将水溶性双光子硫化氢荧光探针用于红酒，癌细胞和组织中硫化氢的荧光检测和成像分析。

相对现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明所述的一种用于红酒和活体内硫化氢检测的水溶性双光子硫化氢荧光探针具有合成简单，合成成本低，对硫化氢具有高灵敏度，高选择性，且能实现用荧光法快速便捷的检测红酒，癌细胞和组织中的硫化氢，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。

附图说明

附图1为本发明可溶性双光子硫化氢荧光探针的合成路线图。

附图2为本发明可溶性双光子硫化氢荧光探针与硫化氢的响应机理示意图。

附图3：（a）为CM-H₂S（表示式Ⅰ所述可溶性双光子硫化氢荧光探针分子，下同）和CM-H₂S+Na₂S归一化的紫外-可见吸收谱图；（b）为探针分子（1μM）对硫化氢的响应的荧光谱图，硫化氢（0~35μM）；（c）为校准曲线；（d）为线性响应。

附图4：（a）为选择性实验，1微摩尔探针分子加入35微摩尔硫化氢或者100微摩尔其它分析物，数字1到16分别代表空白（探针分子），S₂O₃ ^2-，S₂O₄ ^2-，S₂O₅ ^2-，SO₃ ^-，GSH，Cys，Hcy，Na₂S，Ca²⁺，Mg²⁺，Na⁺，K⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，和Fe³⁺；（b）为pH（4~9）对探针分子在加入硫化氢前后的影响。

附图5为双光子荧光显微镜对HeLa细胞的成像研究：（a）为明场成像；（b）为HeLa细胞与探针分子一起哺育30分钟；（c）为（b）和明场（a）的叠加成像图；（d）为明场成像；（e）为HeLa细胞与30微摩尔Na₂S哺育15分钟，再加探针分子一起哺育30分钟的成像谱图；（f）为（e）和明场（d）的叠加成像图；

其中：双光子成像：激发波长=800纳米，发射波长范围=470~550纳米。所有的成像用40×的油镜，比例尺：10微米。

附图6为组织成像研究：1微摩尔探针分子与大鼠的肝组织在37度下哺育60分钟，接着加入30微摩尔Na₂S哺育60分钟；（a）为在74微米深处的成像图.TPimages：λ_ex=800nm，λ_em=470~550nm；

其中：双光子成像：激发波长=800纳米，发射波长范围=470~550纳米。所有的成像用10×的油镜，比例尺：10微米。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明。下述实施例仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的原材料和设备为本领域常规使用的原材料和设备。

实施例1

本实施例提供一种用于红酒和活体内硫化氢检测的水溶性双光子硫化氢荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

S1.粗产品的合成：将0.193g （1.00mmol） 4-（二乙氨基）-水杨醛， 0.186g 2，4-二硝基氟苯（1.00mmol）， 0.294g （3mmol） K₂CO₃和40mL CH₃CN 加入到一个100毫升的圆底烧瓶中，装上循环冷凝装置，混合物在65℃搅拌，用薄层色谱法跟踪反应，直到4-（二乙氨基）-水杨醛完全反应为止；最后混合物倒入适量的冰水中，抽滤得到黄色固体，固体用冷水洗涤3次，固体在恒温干燥箱中干燥，得到固体粗产品直接用于下步反应，该粗产品的结构如式（Ⅱ）所示；收率90%。

核磁共振碳谱：¹H NMR（400MHz，d ₆-DMSO）δ:8.55（s，1H），8.24-8.22（d，J=8Hz，1H），7.73-7.71（d，J=8Hz，1H），7.49-7.47（d，J=8Hz，1H），6.52-6.50（d，J=8Hz，1H），6.26（s，1H），5.30（s，1H），3.55-3.43（q，J=26Hz，4H），1.11-1.08（t，J=6Hz，6H）；¹³C NMR（100MHz，d6-DMSO）δ:164.92，161.57，154.19，147.16，140.75，135.00，130.41，126.71，118.48，115.12，109.03，106.24，95.26，90.38，83.99，70.23，62.58，61.71，44.87，12.78；高分辨质谱：ESI-MS:[M]⁺，m/z，calcd:359.3，found:360.1.

S2.探针分子的合成：在氮气保护下，将步骤S1所得粗产物（0.180g， 0.5mmol）、氰基乙酸（0.085g， 1mmol）溶解在40mL无水乙醇中，同时加入0.2mL哌啶和0.2mL乙酸，50℃反应12小时，用薄层色谱法跟踪反应，直到粗产物完全反应为止，最后溶液导入冰水混合物中，黄色固体减压抽滤，固体用冷水洗涤三次，然后固体在恒温干燥箱中干燥得到式（Ⅰ）所述化合物；收率为90%。

核磁共振碳谱：¹H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ:9.67(s，1H)，8.88(s，1H)，8.43-8.40(d，J=12Hz，1H)，7.76-7.74(d，J=12Hz，1H)，7.15-7.12(d，J=12Hz，1H)，6.80-6.77(d，J=12Hz，1H)，6.59(s，1H)，3.48-3.43(q，J=6Hz，4H)，1.14-1.10(t，J=8Hz，6H)；¹³C NMR(100MHz，d6-DMSO)δ:185.94，156.60，156.25，154.00，141.47，139.18，134.13，130.17，122.29，118.72，115.31，109.83，103.55，44.71，12.71；高分辨质谱：ESI-MS:[M]-，m/z，calcd:426.4，found:426.8.

本实施例水溶性双光子硫化氢荧光探针合成路线如图1所示；水溶性双光子硫化氢荧光探针与硫化氢的响应机理如图2所示。

实施例2

本实施例为探针分子检测试验，结果如图3所示。

其中：（a）为CM-H2S和CM-H2S+Na2S归一化的紫外-可见吸收谱图。

（b）为探针分子（1μM）对硫化氢的响应的荧光谱图，硫化氢（0~35μM），硫化氢荧光探针与硫化氢的滴定实验。用荧光光谱仪测试不同浓度硫化氢条件下的荧光光谱，荧光光谱的激发波长为380nm，发射波长为500nm，检测波长为400~650nm，随着硫化钠的浓度的增加，在500nm波长下的荧光强度逐渐增强，说明本发明制备的荧光探针能够对硫化氢进行响应。

（c）为校准曲线。

（d）为线性响应。

实施例3

本实施例为荧光探针检测硫化氢的选择性测试，结果如附图4所示。

在同样的测试条件下，为1微摩尔探针分子加入35微摩尔硫化氢或者100微摩尔其它分析物后的荧光光谱。其中：荧光光谱的激发波长380nm，发射波长500nm，检测波长400~650nm，结果如附图4中（a）所示。

由附图4中（a）可知，数字1~16分别代表空白（探针分子），S₂O₃ ^2-，S₂O₄ ^2-，S₂O₅ ^2-，SO^3-，GSH，Cys，Hcy，Na₂S，Ca²⁺，Mg²⁺，Na⁺，K⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，和Fe³⁺。荧光强度只有硫化氢明显增强，其他生物活性小分子等分析物不对检测结果产生干扰，说明本发明制备的荧光探针对硫化氢具有较高的选择性。

（b）为pH（4~9）对探针分子在加入硫化氢前后的影响。

实施例4

本实施例为双光子荧光显微镜对HeLa细胞的成像研究试验，结果如附图5所示。

附图5为双光子荧光显微镜对HeLa细胞的成像研究：（a）为明场成像；（b）为HeLa细胞与探针分子一起哺育30分钟；（c）为（b）和明场（a）的叠加成像图；（d）为明场成像；（e）为HeLa细胞与30微摩尔Na2S哺育15分钟，再加探针分子一起哺育30分钟的成像谱图；（f）为（e）和明场（d）的叠加成像图；

实施例5

本实施例为组织成像研究试验，结果参见附图6。

附图6为组织成像研究：1微摩尔探针分子与大鼠的肝组织在37度下哺育60分钟，接着加入30微摩尔Na2S哺育60分钟；（a）为在74微米深处的成像图.TPimages：λex=800nm，λem=470~550nm；

实施例6

本实施例为红酒样品硫化氢检测试验，试验结果如表1所示。

表 1.红酒样品中硫化氢的检测

^a三次测定的结果。^bSD: 标准偏差。

Claims

1.一种水溶性双光子硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，所述水溶性双光子硫化氢荧光探针以具有双光子性质的香豆素衍生物为信号基团，以2，4-二硝基苯醚为硫化氢识别基团；该方法包括以下步骤：

S1. 将4-（二乙氨基）水杨醛、2，4-二硝基卤苯和碳酸钾加入反应器中，加入适量的强极性溶剂做溶媒，60~80℃下反应，反应至4-（二乙氨基）水杨醛完全消失为止，把反应体系冷却到室温后倒入冰水中，待固体析出后，过滤、洗涤后得到的黄色固体，干燥后得到粗产物，其结构式由式（Ⅱ）表示：

（Ⅱ）；

S2. 将步骤S1所得粗产物、氰基乙酸溶解在有机溶剂中，同时加入适量的哌啶作为催化剂，加热回流，80~95℃在惰性气氛下反应至步骤S1所得粗产物完全消失为止；把反应体系冷却到室温后倒入冰水中，待固体析出后，过滤、洗涤后得到的黄色固体，干燥后得式（Ⅰ）所示化合物；

（Ⅰ）。

2.根据权利要求1所述的水溶性双光子硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述强极性溶剂为四氢呋喃，DMF，DMSO或乙腈中的一种。

3.根据权利要求2所述的水溶性双光子硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述强极性溶剂为乙腈。

4.根据权利要求1所述的水溶性双光子硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S1中，4-（二乙氨基）水杨醛、2，4-二硝基卤苯和碳酸钾的摩尔比为1：1~2：2~4。

5.根据权利要求1所述的水溶性双光子硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述有机溶剂为甲苯，苯，甲醇，无水乙醇中的一种。

6.根据权利要求5所述的水溶性双光子硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述有机溶剂为无水乙醇。

7.根据权利要求1所述的水溶性双光子硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述粗产物与氰基乙酸的摩尔比为1:1~4。

8.根据权利要求1所述的水溶性双光子硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S1或S2中，在反应过程中均采用薄层色谱法跟踪反应。

9.根据权利要求1所述的水溶性双光子硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S1或S2中，待固体析出后，抽滤并用冷水洗涤3次，得到的固体用恒温干燥箱干燥。

10.一种权利要求1所述的水溶性双光子硫化氢荧光探针的应用，其特征在于，所述应用是将水溶性双光子硫化氢荧光探针用于红酒中硫化氢的荧光检测和成像分析。