CN115521293A

CN115521293A - 一类酰肼类发光染料及其制备方法和应用

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Publication number: CN115521293A
Application number: CN202211239050.6A
Authority: CN
Inventors: 杨靓月; 汪磊; 王兴宗; 晋腾达; 顾涛
Original assignee: Yanshan University
Current assignee: Yanshan University
Priority date: 2022-10-11
Filing date: 2022-10-11
Publication date: 2022-12-27
Anticipated expiration: 2042-10-11
Also published as: CN115521293B

Abstract

本发明提供了一类酰肼类发光染料及其制备方法和应用，属于精细化工技术领域。本发明提供的酰肼类发光染料属于有机小分子共轭体系，易于通过廉价易得的原料简单合成，同时，其结构中包含的可修饰化学位点多，易于进行进一步功能性修饰；其在适当化学条件下会触发强劲的绿色或黄色化学发光，具有良好的抗干扰能力；对活性氧物种和特定金属离子具有优异的灵敏度和高选择性，可作为二者的灵敏化学发光检测；其还具有良好的荧光性能，荧光强度表现出对pH值和粘度的灵敏响应，使其兼具定性和定量分析的能力，可用于生物体内基于pH和粘度的特异性荧光成像，且因其化学发光无需外源性激发光源，可应用于生物体内的高分辨原位化学发光成像。

Description

一类酰肼类发光染料及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及精细化工技术领域，特别涉及一类酰肼类发光染料及其制备方法和应用。

背景技术

荧光染料具有高灵敏度、高信号强度、高特异性等特点，广泛应用于生物、食品药物分析及环境分析等领域。同时，因其无创及良好的生物相容性等特点在疾病诊断领域有着广泛应用。近年来，荧光染料特别是荧光探针的快速发展，使得具有监测生物内环境变化能力的荧光染料的小分子化合物进入人们的视野中。细胞内微环境参数与很多疾病过程紧密相关，可作为疾病诊断的有效指标。例如，pH、粘度等在包含代谢、信号转导、电子传递和细胞凋亡等的许多重要的生物过程中起着重要作用，在癌症等疾病中可观察到pH和粘度的异常。因此，响应型探针近年来引起了人们的广泛关注。

化学发光是在没有外界激发光的存在下，染料经过特定的化学反应从基态跃迁到激发态，在衰退到基态的过程中释放出荧光(即化学发光)的现象,具有灵敏度高、选择性好、线性范围广、分析速度快、便于实现自动化等优点化学发光不需要外界激发光，即在特定的化学条件下，化学发光底物被氧化剂等物种激发而产生化学发光。其中，鲁米诺(3-氨基邻苯二甲酰肼)是最经典的化学发光底物之一，自从1928年首次被发现在过氧化氢存在下可以产生化学发光以来，就被广泛应用于有关过氧化氢的分析检测和疾病诊断领域。然而，除了鲁米诺之外的化学发光探针并不多。因此，从化学发光分子本身出发，考虑在廉价易得的鲁米诺所包含的酰肼结构基础上，开发新型响应性发光探针，拓宽光学探针应用领域。

发明内容

为了能够解决上述问题，本发明目的在于提供一类新型酰肼类发光染料及其制备方法和应用，以较好的产率获得了具有更大π共轭体系的新型化学发光分子，相对鲁米诺实现了发光波长的红移。本发明提供的发光染料具有良好的荧光性质，其荧光强度对pH和粘度具有良好的响应和定量关系；本发明提供的发光染料具有良好的化学发光性质，在530nm附近具有良好的化学发光，且对特定活性氧和金属离子有良好的选择性响应。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一类酰肼类发光染料，具有式1或式2所示结构：

其中，R₁、R₂和R₃各自独立为烷基，A为芳基；

式1中，X选自C、N中的一种；

式2中，Y为芳基；

酰肼类发光染料为共轭体系。

优选的，R₁、R₂和R₃各自独立选自C₁～C₆烷基中的一种，A选自苯基、萘基、蒽基中的一种；

式1中，X选自C、N中的一种；

式2中，Y选自苯基、萘基、蒽基中的一种。

优选的，R₁、R₂和R₃各自独立选自-CH₃、-CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃中的一种；A为苯基或萘基

式1中，X为N；

式2中，Y为苯基或萘基。

优选的，酰肼类发光染料包括式3、式4、式5、式6、式7、式8、式9、式10、式11、式12、式13、式14、式15、式16、式17或式18所示结构：

本发明还提供了该酰肼类发光染料的制备方法，

①当X为N时，式1所示酰肼类发光染料具有式c-1所示结构；式c-1所示酰肼类发光染料的制备方法，包括以下步骤：

将式a-1所示化合物与式b所示化合物按照摩尔比1：(1～1.2)进行缩合反应，得到式c-1所示酰肼类发光染料；

②当Y为苯基时，式2所示酰肼类发光染料具有式f-1所示结构；式f-1所示酰肼类发光染料的制备方法，包括以下步骤：

将式d-1所示化合物与式e所示化合物进行缩合反应，得到式f-1所示酰肼类发光染料；

优选的，缩合反应的缩合剂为稀硫酸溶液或DMSO，缩合反应时间为20～26h。

优选的，式a-1所示化合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备式h-1所示化合物：

将式g-1所示化合物与烷基碘按照摩尔比1：(1.5～2.5)进行加成反应，得到式h-1所示化合物；加成反应的溶剂为无水乙腈；加成反应时间为2～3h，加成反应温度为80～90℃；

(2)制备式i-1所示化合物：

将式h-1所示化合物与氢氧化钠按照摩尔比1：(3～4)进行反应，得到式i-1所示化合物；反应的溶剂为甲苯和水；反应的时间为1～3h；

(3)制备式a-1所示化合物：

将三氯氧磷与N,N-二甲基甲酰胺按照体积比2：(3～5)混合进行反应，得到Vilsmeier-Haack弱亲核试剂，反应时间为0.5～1h，反应温度为-2～5℃；

再将Vilsmeier-Haack弱亲核试剂与式i-1所示化合物按照摩尔比(4～6)：1混合，进行Vilsmeier-Haack反应，然后与氢氧化钠水溶液反应，得到式a-1所示化合物；Vilsmeier-Haack反应的时间为10～12h。

优选的，式d-1所示化合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备式h-1所示化合物：

(2)制备式d-1所示化合物：

将式h-1所示结构的化合物和4-甲酰基苯硼酸按照摩尔比1：(1～2.0)进行缩合反应，得到式d-1所示结构化合物，缩合反应的缩合剂包括无水乙醇，缩合反应温度为80～100℃，缩合反应时间为20～28h；

(3)制备式e所示化合物：

将4-溴邻苯二甲酸酐与水合肼按照摩尔比1：(1～1.5)进行缩合反应，得到式e所示化合物；缩合反应的缩合剂为醋酸，缩合反应温度为120～130℃，缩合反应时间为1.5～2h；

本发明还提供了该酰肼类发光染料或该制备方法制备得到的酰肼类发光染料在生物标记、体内外荧光成像、荧光成像、定性及定量分析检测领域的应用，包含非响应型应用、基于pH和粘度的特异性响应型应用。

本发明还提供了该酰肼类发光染料或该制备方法制备得到的酰肼类发光染料在化学发光领域的应用，包含在体内化学发光成像、活性氧和特定金属离子的灵敏化学发光检测。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明提供的发光染料有着强烈的荧光和黄绿色化学发光，荧光波长优选为520～560nm，化学发光波长优选为520～560nm，发光波长相较于鲁米诺有100nm以上的红移，有更好的生物组织穿透性，且具有良好的抗干扰能力和光稳定性，对活性氧物种和特定金属离子具有优异的灵敏度和高选择性。同时，本发明提供的酰肼类发光染料具有良好的荧光性能，特别是，其荧光强度表现出对pH值和粘度的灵敏响应，使其同时具有定性和定量分析的能力。

(2)本发明提供的酰肼类发光染料属于有机小分子，易于通过廉价易得的原料简单合成；同时，其结构中包含的可修饰的化学位点多，易于进行进一步的功能性修饰。进一步的生物实验表明，该发光染料的细胞毒性低，生物相容性好；因此其不仅可以应用于生物体内基于pH和粘度的特异性荧光成像，还可以作为活性氧和特定金属离子的灵敏化学发光检测。值得一提的是，由于化学发光无需外源性的激发光源，因此可以应用于生物体内无背景荧光的高分辨原位化学发光成像，可实现多模成像。。

附图说明

图1为本发明实施例1中提供的具有式3所示结构的酰肼类发光染料CL-1的核磁共振氢谱图；

图2为本发明实施例1中提供的CL-1在不同溶剂中的紫外-可见吸收光谱图；

图3为本发明实施例1中提供的CL-1在不同pH中的紫外-可见吸收光谱图；

图4为本发明实施例1中提供的CL-1在不同溶剂中的荧光光谱图；

图5为本发明实施例1中提供的CL-1在不同pH中的荧光光谱图；

图6为本发明实施例1中提供的CL-1在不同粘度中的荧光光谱图；

图7为本发明实施例1中提供的CL-1在各种被分析物存在下不同溶剂体系中的荧光强度；

图8为本发明实施例1中提供的CL-1的化学发光照片；

图9为本发明实施例1中提供的CL-1对不同ROS的化学发光响应分析谱图；

图10为本发明实施例1中提供的CL-1对不同金属离子的化学发光响应。

具体实施方式

本发明提供了一类酰肼类发光染料及其制备方法和应用，具有式1或式2所示结构：

其中，R₁、R₂和R₃各自独立为烷基，A为芳基；式1中，X选自C、N中的一种；式2中，Y为芳基；该酰肼类发光染料的结构整体均为共轭体系。

优选的，R₁、R₂和R₃各自独立选自C₁～C₆烷基中的一种，A选自苯基萘基、蒽基中的一种；式1中，X选自C、N中的一种；式2中，Y选自苯基、萘基、蒽基中的一种。

优选的，R₁、R₂和R₃各自独立选自-CH₃、-CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃中的一种，A为苯基或萘基；式1中，X为N；式2中，Y为苯基或萘基。

优选的，在本发明中，该酰肼类发光染料包括具有式3、式4、式5、式6、式7、式8、式9、式10、式11、式12、式13、式14、式15、式16、式17或式18所示结构；将其分别命名为CL-1，CL-2、CL-3，CL-4，CL-5，CL-6，CL-7，CL-8，CL-9，CL-10，CL-11，CL-12，CL-13，CL-14，CL-15，CL-16。

本发明提供了上述酰肼类发光染料的制备方法，包括以下步骤：

①当X为N时，式1所示酰肼类发光染料具有式c-1所示结构；式c-1所示酰肼类发光染料的制备方法包括以下步骤：

(1)制备式h-1所示化合物：

用式g-1所示化合物与烷基碘进行加成反应，得到式h-1所示化合物；其中，式g-1所示化合物与烷基碘的摩尔比优选为1：(1.5～2.5)，加成反应的溶剂优选为无水乙腈，加成反应的温度优选为80～90℃，加成反应的反应时间优选为2～3h。加成反应后，对所得式h-1所示化合物进行后处理，后处理步骤包括：将反应体系过滤，用乙醚或乙酸乙酯洗涤固体，直至固体呈白色或黄绿色，然后干燥。

(2)制备式i-1所示化合物：

用制备得到的式h-1所示化合物与氢氧化钠进行反应，得到式i-1所示化合物；式h-1所示化合物与氢氧化钠的摩尔比优选为1：(3～4)，反应的溶剂优选为甲苯和水，甲苯和水的体积比优选为(4～5.5)：(3.5～4.5)，反应温度优选为室温，反应时间为1～3h。对所得式i-1所示化合物进行后处理和纯化，后处理和纯化步骤包括：用乙酸乙酯萃取所述反应有机相，分液，干燥，浓缩，得到粗产物，然后将粗产物进行硅胶柱层析分离，柱层析分离洗脱液优选为乙酸乙酯和石油醚，乙酸乙酯和石油醚的体积比优选为1：(4～5)。

(3)制备式a-1所示化合物：

将三氯氧磷与N,N-二甲基甲酰胺混合，得到Vilsmeier-Haack弱亲核试剂；该混合优选在高纯氩气保护下进行，三氯氧磷与N,N-二甲基甲酰胺的体积比优选为2：(3～5)，混合的温度优选为-2～5℃，混合时间优选为0.5～1h；然后，Vilsmeier-Haack弱亲核试剂与式i-1所示化合物混合，进行Vilsmeier-Haack反应；式i-1所示化合物与Vilsmeier-Haack弱亲核试剂的摩尔比优选为1：(4～6)，Vilsmeier-Haack反应的温度优选为室温，Vilsmeier-Haack反应的时间为10～12h；然后将上述反应体系倒入冰水，用饱和氢氧化钠水溶液调节其pH值，然后加热，最后冷却至室温，得到式a-1所示化合物；冰水体积优选为5～20mL，pH值优选为9～11，加热温度优选为50～60℃，加热时间优选为20～40min。在本发明中，对式a-1所示化合物进行纯化，纯化步骤包括：对式a-1所示化合物进行硅胶柱层析分离，柱层析分离的洗脱液优选为甲醇和二氯甲烷，甲醇和二氯甲烷体积比例优选为(2～5)：(95～98)。

(4)制备式c-1所示酰肼类发光染料：

式a-1所示化合物与式b所示化合物进行缩合反应，得到式c-1所示酰肼类发光染料；式a-1所示化合物与式b所示化合物的摩尔比优选为1：(1～1.2)，缩合反应的缩合剂优选为稀硫酸溶液，浓度优选为10％～30％，缩合反应的反应温度优选为室温，缩合反应的反应时间优选为20～26h。对所得产物进行后处理，后处理步骤包括：将反应体系过滤，并用去离子水洗涤固体，直至滤液pH显示为中性，然后干燥。

在本发明中，式c-1所示酰肼类发光染料的制备流程如式A-1所示：

②当Y为苯基时，式2所示酰肼类发光染料为式f-1所示酰肼类发光染料；式f-1所示酰肼类发光染料的制备方法包括以下步骤：

(1)制备式e所示化合物：

式e所示化合物可由4-溴邻苯二甲酸酐与醋酸及水合肼制备而得；4-溴邻苯二甲酸酐与水合肼摩尔比优选为1：(1～1.5)，缩合反应的缩合剂优选为醋酸，缩合反应的反应温度优选为120～130℃，缩合反应的反应时间优选为1.5～2h。对所得产物进行后处理，后处理步骤包括：将反应体系过滤，洗涤，然后干燥。

(2)制备式h-1所示化合物：

式h-1所示化合物如上述①步骤(1)中相关所示。

(3)制备式d-1所示化合物：

将制备得到的式h-1所示化合物与4-甲酰基苯硼酸进行缩合反应，得到式d-1所示化合物；式h-1所示化合物与4-甲酰基苯硼酸摩尔比优选为1：(1～2.0)，缩合反应的缩合剂优选为无水乙醇，缩合反应的反应温度优选为80～100℃，缩合反应的反应时间优选为20～28h。对所得产物进行后处理，后处理步骤包括：将反应体系过滤，重结晶，然后干燥。

(4)制备式f-1所示酰肼类发光染料：

将制备得到的式d-1所示化合物与式e所示化合物进行缩合反应，得到式f-1所示酰肼类发光染料；式d-1所示化合物与式e所示化合物摩尔比优选为1：(1～2.0)，缩合反应的缩合剂优选为DMSO，缩合反应的反应温度优选为80～100℃，缩合反应的反应时间优选为20～26h。对所得产物进行后处理，后处理步骤包括：用去离子水洗涤所述有机相，用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏得到粗产物，然后重结晶。

在本发明中，f-1所示酰肼类发光染料的制备流程如式A-2所示：

其中，式c-1或式f-1所示酰肼类发光染料中的R₁、R₂、R₃各自独立为烷基；A为芳基；该酰肼类发光染料的结构整体均为共轭体系。

优选的，R₁、R₂和R₃各自独立选自C₁～C₆烷基中的一种；A选自苯基、萘基、蒽基中的一种。

优选的，R₁、R₂、R₃各自独立选自-CH₃、-CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃中的任意一种；A为苯基或萘基。

本发明对洗涤、过滤和干燥的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的上述操作即可。

本发明还提供了上述酰肼类发光染料在生物标记、体内外荧光成像、基于pH和粘度的特异性荧光成像、基于pH和粘度的定量分析检测领域的应用。

本发明还提供了上述酰肼类发光染料在体内化学发光成像、活性氧和特定金属离子的灵敏化学发光检测领域的应用。

下面结合实施例对本发明提供的发光染料及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

A为萘基，X为N，R₁、R₂、R₃均为甲基时制备式3所示酰肼类发光染料的制备：

(1)式h-1所示化合物的制备：

200mg1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚和0.13mL碘甲烷在5mL无水乙腈中回流2h进行加成反应，反应温度为85℃，然后冷却至室温，过滤，洗涤，干燥后得到化合物，性状为白色固体，产率63％。

LCMS(ESI+)：计算[(M+H)+]：224.1，测到224.1。

合成路线如式B所示：

(2)式i-1所示化合物的制备：

室温下，将150mg式h-1所示化合物和70mg氢氧化钠在1mL水和1.5mL甲苯中剧烈搅拌2h，以TLC板监测反应进程。反应停止后，用乙酸乙酯萃取有机相，用去离子水将有机相洗涤至中性，然后用无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏出溶剂，得到墨绿色固体，即中间体粗产物。将此粗产品用硅胶柱层析法纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1/4)，浓缩，干燥后得到纯品i-1，性状为棕色针状晶体，产率84％。

LCMS(ESI+)：计算[(M+H)+]224.3，测到224.1。

合成路线如式C所示：

(3)式a-1所示化合物的合成：

在干燥的圆底烧瓶中充入高纯氩气(Ar)，向烧瓶中加入0.3mL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，然后将烧瓶置于冰水浴中，缓慢向DMF中加入0.14mL三氯氧磷，在0℃下反应1h。然后，将170mg溶于0.5mL无水DMF中的式i-1所示化合物缓慢加入上述反应体系，移除冰水浴，在室温下反应10h，以TLC板监测反应进程。10h后，停止反应，反应体系呈红色液体，将此液体倒入5mL冰水中，用饱和NaOH调节pH至10～11，然后在60℃下加热，析出红棕色固体。当反应体系中不再有刺激性气体逸出时，停止加热，冷却至室温，过滤，收集滤渣，干燥，得到式a-1所示化合物的粗产品。将此粗产品用柱层析法纯化(洗脱剂：甲醇/二氯甲烷＝(2～4)/(96～98))，得到纯品，性状为白色固体，产率64％。

LCMS(ESI+)：计算[(M+H)+]：252.1383，测到252.1。

合成路线如式D所示：

(4)式3所示酰肼类发光染料CL-1的合成

室温下，将100mg具有式a-1所示结构的化合物和70mg 3-氨基邻苯二甲酰肼置于干燥圆底烧瓶中，向瓶中加入2mL 20％ H₂SO₄水溶液，室温下搅拌24h，以TLC监测反应进程。24h后，反应体系呈橙黄色，过滤，用水洗涤滤渣，直至滤液pH＝7，干燥，即得到式2所示酰肼类化学发光染料CL-1，性状为橙黄色固体，产率94％。

HRMS(ESI+)：计算[(M+H)+]：411.1816，测到411.1830。

式3所示酰肼类发光染料CL-1的核磁共振氢谱如图1所示。

氢谱数据为：

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.88(s,2H),8.93(d,J＝12.0Hz,1H),8.24(d,J＝8.8Hz,1H),8.13(d,J＝8.0Hz,1H),8.11～8.04(m,2H),7.92(t,J＝7.6Hz,1H),7.86(d,J＝8.0Hz,1H),7.77(d,J＝8.8Hz,1H),7.67(t,J＝7.6Hz,1H)7.51(t,J＝7.2Hz,1H),6.34(s,1H),3.78(s,3H),1.96(s,6H)

合成路线如式E所示：

实施例2

A为萘基，Y为苯基，R₁、R₂、R₃均为甲基时制备式11所示酰肼类发光染料的制备：

(1)式e所示化合物的制备：

Ar气氛下，向干燥的双口瓶中加入590mg 4-溴邻苯二甲酸酐，加入乙酸6mL回流1.5h，然后冷却至室温，之后将双口瓶置于冰浴中，缓慢滴加0.13mL水合肼，升温至125℃，反应1.5h，期间析出白色固体。反应停止后，冷却至室温，过滤，用5％NaOH溶液将滤渣完全溶解，然后向其中加入冰乙酸以析出固体，过滤，用甲醇和水洗涤固体，干燥，即得到纯品4-溴邻苯二甲酰肼，性状为白色固体，产率65％。

LCMS(ESI-)：计算[(M-H)-]：240.0000,测到238.9000(99.63％),240.9000(100％)。

合成路线如式F所示：

(2)式d-1所示化合物的制备：

Ar气氛下，向双口瓶中加入176mg式h-1所示化合物和75mg 4-甲酰基苯硼酸，然后向其中加入无水乙醇5mL，在90℃下回流24h。以TLC监测反应进程。反应停止后，冷却至室温，减压旋蒸除去乙醇，得到棕色固体，即式d-1所示化合物。将此粗产物用甲醇和乙醚重结晶，得到纯式d-1所示化合物，性状为橙红色固体，产率56％。

LCMS(ESI+)：计算[(M+H)+]：356.1816,测到356.1807。

合成路线如式G所示：

(3)式11所示结构的酰肼类发光染料CL-9的合成

Ar气氛下，240mg具有式d-1所示结构化合物，180mg具有式e结构的化合物和18mgPd(PPh₃)₄，置于双口瓶中，向其中加入3mL超干二甲亚砜和1.5mL碳酸盐水溶液，加热到90℃，避光搅拌，以TLC监测反应进程。反应停止后，冷却至室温，用二氯甲烷萃取有机相，然后用去离子水洗涤有机相至中性，收集有机相，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，然后减压蒸馏得到粗产品，再用重结晶法(溶剂体系：甲醇/乙醚)纯化，得到所需的纯品CL-9，性状为橙色至红色固体，产率70％。

HRMS(ESI+)：计算[(M+H)+]：472.2020，测到472.2023。

氢谱数据为：

1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ11.79(s,2H),8.63(d,J＝16.4Hz,1H),8.51(d,J＝8.4Hz,2H),8.45(d,J＝7.6Hz,2H),8.36(d,J＝8.4Hz,1H),8.33(d,J＝8.8Hz,1H),8.25(d,J＝8.4Hz,1H),8.21(d,J＝9.2Hz,1H),8.07(d,J＝8.0Hz,1H),7.97(d,J＝9.2Hz,1H),7.95～7.70(m,3H),7.75(t,J＝7.6Hz,1H),4.43(s,3H),3.18(s,3H),2.06(s,6H)合成路线如式H所示：

下面为性能测试，以CL-1为例

(一)紫外-可见吸收光谱

①在不同溶剂中的紫外-可见吸收光谱

以DMSO为溶剂，将CL-1配制成浓度为10^-2mol·L^-1的母液，将母液分别用二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，二甲基亚砜(DMSO)，乙酸乙酯(EA)，水(water)，乙腈(MeCN)，甲醇(MeOH)，PBS缓冲溶液(pH＝7.4)、四氢呋喃(THF)稀释至浓度为10^-5mol·L^-1的稀溶液，测试其紫外-可见吸收光谱，所得结果如图2所示。从图2可以看出，CL-1在上述各溶剂中的最大吸收波长均在450nm左右，CL-1在各溶剂中的吸收强度接近，表明其性质在常见溶剂中具有良好的稳定性和一致性。

②在不同pH中的紫外-可见吸收光谱

以DMSO为溶剂，将CL-1配制成浓度为10^-2mol·L^-1的母液，将母液用不同pH值的HEPES溶液稀释至浓度为10^-5mol·L^-1的稀溶液，测试其紫外-可见吸收光谱，所得结果如图3所示。从图3可以看出，在pH≤10时，CL-1在HEPES缓冲液中的吸收主要集中在450nm附近，当pH＞10时，CL-1的UV-Vis吸收主要在400nm以下。且随着pH的升高，其在450nm附近的吸收逐渐降低，而在400nm以下的吸收则随着pH值升高而升高。

(二)荧光性能

①在不同溶剂中的荧光光谱

以DMSO为溶剂，将CL-1配制成浓度为10^-2mol·L^-1的母液，将母液分别用二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，二甲基亚砜(DMSO)，乙酸乙酯(EA)，水(water)，乙腈(MeCN)，甲醇(MeOH)，PBS缓冲溶液(pH＝7.4)、四氢呋喃(THF)稀释至浓度为10^-5mol·L^-1的稀溶液，测试其荧光光谱，所得结果如图4所示。从图4可以看出，在所有9种溶剂中其荧光发射峰均位于520～550nm，表现出良好的荧光性能。

②在不同pH中的荧光光谱

以DMSO为溶剂，将CL-1配制成浓度为10^-2mol·L^-1的母液，将母液用不同pH值的HEPES溶液稀释至浓度为10^-5mol·L^-1的稀溶液，测试其荧光光谱，所得结果如图5所示。从图5可以看出，在从pH＝2到pH＝13的广泛范围内，CL-1的荧光发射峰均位于540nm附近，且随着pH值的升高，荧光强度逐渐减弱。

③在不同粘度中的荧光光谱

以DMSO为溶剂，将CL-1配制成浓度为10^-2mol·L^-1的母液，将母液用不同体积比例的水-甘油作为溶剂稀释至浓度为10^-5mol·L^-1的稀溶液，然后测试其荧光光谱，所得结果如图6所示，水-甘油体系的具体体积比例和对应的粘度如表1所示。从图6可以看出，CL-1的荧光发射峰均位于520～540nm之间，且随着体系粘度增大，CL-1荧光强度显著增强。

表1不同体积比的水/甘油混合物的粘度

④对金属离子和特别分子的抗干扰能力

以DMSO为溶剂，将CL-1配制成浓度为10^-2mol·L^-1的母液，将母液用PBS缓冲液(pH＝7.4)和PBS+甘油混合液(VPBS:V甘油＝1:1)溶剂稀释至浓度为10^-5mol·L^-1的稀溶液，分别向上述稀溶液中添加Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、F^-、Cl^-、Br^-、NO₂ ^-、还原型谷胱甘肽(Gsh)、L-半胱氨酸(Cys)、L-精氨酸(Arg)、D-天冬氨酸(Asp)、L-丝氨酸(Ser)、L-脯氨酸(Pro)作为被分析物，其中被分析物的浓度为10^-4mol·L^-1。测试其荧光强度，结果如图7所示。从图7可以看出，在两种溶剂体系中，CL-1的荧光强度对所有被分析物均未表现出明显的变化，证明了CL-1在各种被分析物存在下其荧光强度的稳定性，保障了其在复杂生理条件下的温度应用。

由以上结果可以看出，本发明提供的发光染料CL-1具有良好的荧光性能，其在不同溶剂中具有良好的荧光稳定性，在不同pH和不同粘度中满足良好的定量关系，在不同金属离子和特别分子的存在下其荧光性能表现出良好的抗干扰能力。

(三)化学发光性能

①化学发光光谱

以DMSO为溶剂，将CL-1配制成浓度为10^-3mol·L^-1的待测液，在10mm×10mm的洁净石英比色皿中加入1mL待测液，然后先后向其中加入100μL浓度为10^-3mol·L^-1的H₂O₂和100μL浓度为10^-3mol·L^-1的CuSO₄水溶液，最后，向比色皿中加入500μL浓度为1mol·L^-1的NaOH溶液，在NaOH溶液加入的同时，采集化学发光。照相机记录的照片如图8所示，显示为黄绿色化学发光。

②对不同活性氧簇(ROS)的化学发光响应

以DMSO为溶剂，将CL-1配制成浓度为10^-3mol·L^-1的待测液。选择超氧阴离子(O₂ ^·-)、次氯酸根(ClO^-)、过氧化氢(H₂O₂)、羟基自由基(OH^·)、单线态氧(¹O₂)五种常见的活性氧为被分析物，以此激发CL-1的化学发光，具体条件如下：

(1)超氧阴离子(O₂ ^·-)

室温下，将0.1mL浓度为3.33×10^-3mol·L^-1的黄嘌呤溶液与0.1mL浓度为5U·mL^-1的黄嘌呤氧化酶均匀混合，反应1min。在10mm×10mm的石英比色皿中加入1mL浓度为10^- ³mol·L^-1的CL-1的DMSO溶液，然后先后向其中加入上述黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应后的混合液，在该混合液加入的同时，采集化学发光。

(2)次氯酸根(ClO^-)

在10mm×10mm的石英比色皿中加入1mL浓度为10^-3mol·L^-1的CL-1的DMSO溶液，然后向其中加入0.1mL浓度为0.1mol·L^-1的NaClO溶液，最后，向比色皿中加入500μL浓度为1mol·L^-1的NaOH溶液，在NaOH溶液加入的同时，采集化学发光。

(3)过氧化氢(H₂O₂)

在10mm×10mm的石英比色皿中加入1mL浓度为10^-3mol·L^-1的CL-1的DMSO溶液，然后向其中加入0.1mL浓度为0.1mol·L^-1的H₂O₂溶液，最后，向比色皿中加入500μL浓度为1mol·L^-1的NaOH溶液，在NaOH溶液加入的同时，采集化学发光。

(4)羟基自由基(OH^·)

在10mm×10mm的石英比色皿中加入1mL浓度为10^-3mol·L^-1的CL-1的DMSO溶液，然后向其中加入0.1mL浓度为0.1mol·L^-1的H₂O₂溶液和0.1mL浓度为0.1mol·L^-1的FeSO₄溶液的混合液，最后，向比色皿中加入500μL浓度为1mol·L^-1的NaOH溶液，在NaOH溶液加入的同时，采集化学发光。

(5)单线态氧(¹O₂)

在10mm×10mm的石英比色皿中加入1mL浓度为10^-3mol·L^-1的CL-1的DMSO溶液，然后向其中加入0.1mL浓度为0.1mol·L^-1的H₂O₂溶液，然后向其中加入500μL浓度为1mol·L^-1的NaOH溶液，最后，向比色皿中加入0.1mL浓度为0.1mol·L^-1的NaClO溶液，在NaClO溶液加入的同时，采集化学发光。

③对不同金属离子的化学发光响应

以DMSO为溶剂，将CL-1配制成浓度为10^-3mol·L^-1的待测液。测试K⁺、Na⁺、Mg²⁺、Ca² ⁺、Al³⁺、Zn²⁺、Cr³⁺、Fe³⁺、Cu²⁺共九种金属离子对CL-1化学发光强度的影响。具体发光条件及操作如下：在10mm×10mm的石英比色皿中加入1mL浓度为10^-3mol·L^-1的CL-1的DMSO溶液，然后先后向其中加入100μL浓度为10^-3mol·L^-1的H₂O₂和100μL浓度为0.1mol·L^-1的金属离子水溶液，最后，向比色皿中加入500μL浓度为1mol·L^-1的NaOH溶液，在NaOH溶液加入的同时，采集化学发光强度。

由图8、图9的结果可以看出，本发明提供的发光染料CL-1具有良好的化学发光性能，在527nm附近表现出强劲的黄绿色化学发光，且对单线态氧¹O₂和Cu²⁺表现出良好的选择性，可以作为单线态氧¹O₂和Cu²⁺的灵敏化学发光检测试剂。同时，由于化学发光无需外源性的激发光源，因此可以应用于生物体内无背景荧光的高分辨原位化学发光成像。

本发明提供的发光染料具有良好的荧光性质，其荧光强度对pH和粘度具有良好的响应和定量关系；本发明提供的发光染料具有良好的化学发光性质，在530nm附近具有良好的化学发光，且对特定活性氧和金属离子有良好的选择性响应。

本领域技术人员在考虑说明书及实践这里的发明后，将容易想到本发明的其它实施方案。本发明旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由权利要求指出。

应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。

Claims

1.一类酰肼类发光染料，具有式1或式2所示结构：

其中，R₁、R₂和R₃各自独立为烷基，A为芳基；

所述式1中，X选自C、N中的一种；

所述式2中，Y为芳基；

所述酰肼类发光染料为共轭体系。

2.根据权利要求1所述的酰肼类发光染料，其特征在于，

R₁、R₂和R₃各自独立选自C₁～C₆烷基中的一种，A选自苯基、萘基、蒽基中的一种；

所述式1中，X选自C、N中的一种；

所述式2中，Y选自苯基、萘基、蒽基中的一种。

3.根据权利要求2所述的酰肼类发光染料，其特征在于，

R₁、R₂和R₃各自独立选自-CH₃、-CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃中的一种；A为苯基或萘基；

所述式1中，X为N；

所述式2中，Y为苯基或萘基。

4.根据权利要求3所述的酰肼类发光染料，其特征在于，所述酰肼类发光染料包括式3、式4、式5、式6、式7、式8、式9、式10、式11、式12、式13、式14、式15、式16、式17或式18所示结构：

5.根据权利要求1～4任一项所述的酰肼类发光染料的制备方法，其特征在于，

将式a-1所示化合物与式b所示化合物按照摩尔比1：(1～1.2)进行缩合反应，得到所述式c-1所示酰肼类发光染料；

将式d-1所示化合物与式e所示化合物进行缩合反应，得到所述式f-1所示酰肼类发光染料；

6.根据权利要求5所述的酰肼类发光染料的制备方法，其特征在于，所述缩合反应的缩合剂为稀硫酸溶液或DMSO，所述缩合反应时间为20～26h。

7.根据权利要求5所述的酰肼类发光染料的制备方法，其特征在于，所述式a-1所示化合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备式h-1所示化合物：

将式g-1所示化合物与烷基碘按照摩尔比1：(1.5～2.5)进行加成反应，得到式h-1所示化合物；所述加成反应的溶剂为无水乙腈；所述加成反应时间为2～3h，所述加成反应温度为80～90℃；

(2)制备式i-1所示化合物：

将所述式h-1所示化合物与氢氧化钠按照摩尔比1：(3～4)进行反应，得到式i-1所示化合物；所述反应的溶剂为甲苯和水；所述反应的时间为1～3h；

(3)制备式a-1所示化合物：

将三氯氧磷与N,N-二甲基甲酰胺按照体积比2：(3～5)混合进行反应，得到Vilsmeier-Haack弱亲核试剂，所述反应时间为0.5～1h，所述反应温度为-2～5℃；

再将所述Vilsmeier-Haack弱亲核试剂与所述式i-1所示化合物按照摩尔比(4～6)：1混合，进行Vilsmeier-Haack反应，然后与氢氧化钠水溶液反应，得到所述式a-1所示化合物；所述Vilsmeier-Haack反应的时间为10～12h。

8.根据权利要求5所述的酰肼类发光染料的制备方法，其特征在于，所述式d-1所示化合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备式h-1所示化合物：

(2)制备式d-1所示化合物：

将所述式h-1所示结构的化合物和4-甲酰基苯硼酸按照摩尔比1：(1～2.0)进行缩合反应，得到所述式d-1所示结构化合物，所述缩合反应的缩合剂包括无水乙醇，所述缩合反应温度为80～100℃，所述缩合反应时间为20～28h；

(3)制备式e所示化合物：

将4-溴邻苯二甲酸酐与水合肼按照摩尔比1：(1～1.5)进行缩合反应，得到所述式e所示化合物；所述缩合反应的缩合剂为醋酸，所述缩合反应温度为120～130℃，所述缩合反应时间为1.5～2h；

9.根据权利要求1～4任一项所述的酰肼类发光染料或根据权利要求5～8任一项所述制备方法制备得到的所述酰肼类发光染料在生物标记、体内外荧光成像、荧光成像、定性及定量分析检测领域的应用，其特征在于，包含非响应型应用、基于pH和粘度的特异性响应型应用。

10.根据权利要求1～4任一项所述的酰肼类发光染料或根据权利要求5～8任一项所述制备方法制备得到的所述酰肼类发光染料在化学发光领域的应用，其特征在于，包含在体内化学发光成像、活性氧和特定金属离子的灵敏化学发光检测。