CN113121566B - 一种芘衍生物荧光分子及其制备方法和应用 - Google Patents

一种芘衍生物荧光分子及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种芘衍生物荧光分子及制备方法，本发明制备方法可经过一步迈克尔加成反应得到，所合成的荧光分子化合物有两种，荧光分子化合物1在380nm和400nm处有两个主要的宽吸收峰，其荧光发射最大波长位于530nm处，在紫外灯下可观察到强的绿色荧光。以溶解在0.1M的NaOH溶液中的荧光素量子产率ФF＝95％作为标准参考物，计算该荧光分子的荧光量子效率为ФF＝27.8％。合成的荧光分子化合物2在380nm和400nm处有两个主要的宽吸收峰，其荧光发射最大波长位于528nm处，在紫外灯下可观察到强的绿色荧光。本发明制备方法简单，所得荧光分子荧光量子产率高，适合于生物成像。

Description

一种芘衍生物荧光分子及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，具体涉及一种芘衍生物荧光分子及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，具有扩展π共轭体系的芳香族分子因其光电性质而受到广泛的关注，包括新型荧光团、光电器件中的染料敏化太阳能电池和光催化剂，由于芘具有较高的荧光量子产率和较长的激发态以及形成准分子。在过去的几十年里，芘具有诱人的光物理性质，使其成为有机材料合成中的重要组成部分。芘及其衍生物的功能化已引起广泛关注，其氧化产物4,5-芘二酮已被用于制备扩展的共轭体系，如大的多环芳烃(PAHs)。这种带有邻二酮的化合物使其成为与胺缩合的良好亲电试剂，从而得到具有新颖光电性质的化合物。由于质子-电子的快速转移，醌-氢醌结构显示出高电子导电性。醌类化合物的迈克尔加成反应是使共轭体系扩展功能化的一种有效方法，其中一个典型的例子就是制备黑色颜料聚多巴胺的级联反应。
近年来，荧光探针作为最有效的分子工具，由于其简单、灵敏、实时成像和无损检测的特点，可以实现生物系统中的微量靶向生物分子的可视化检测。其中结构新颖，光物理化学性能优异的荧光团的合成制备具有重要的意义和价值。
现有技术中，专利申请号为CN201910950412.4的发明专利公开一种力致荧光颜色可调碳点的制备方法。该方法包括如下步骤：(1)溶剂热反应：将1,3,6,8-四(4-羧基苯)芘和乙二胺加入到N，N-二甲基甲酰胺和蒸馏水混合溶液中，超声搅拌，反应后冷却至室温；(2)透析：将上一步得到的产物转移到透析袋中透；(3)离心：将产物转移到离心管中，离心后取上清液进行干燥，得到固体粉末；在365nm的紫外灯下荧光颜色为黄绿色；(4)研磨：将固体粉末在玛瑙研研钵中进行10～30min研磨；最后得到在紫外灯365nm发射下发蓝色荧光的粉末。该发明具有仅通过简单的研磨处理具有荧光变色，并且通过酸熏处理可恢复荧光颜色的特性。但是其制备方法复杂，过程繁杂，难以通过合成设计，引入具有特定空间和结构功能的配体，得到具有特定功能和结构修饰的目标化合物。
发明内容
本发明提供一种芘衍生物荧光分子及其制备方法，制备方法以及操作过程简单，本申请设计一种芘-1,6-二酮与乙二胺衍生物的迈克尔加成反应，使芘的共轭体系增大，从而得到一种新颖的荧光分子，本申请提供了一种合成芘衍生物荧光分子的方法，并同时提供了该荧光分子作为荧光团进一步进行荧光探针设计的潜在应用。
本发明提供了一种芘衍生物荧光分子，其化学结构式如下：
Figure BDA0003015957150000021
R＝Py、Ph中至少一种。
上述芘衍生物荧光分子，包括荧光分子化合物1和荧光分子化合物2，荧光分子化合物1的化学式为C30H22N4O2，荧光分子化合物2的化学式为C32H24N2O2。
优选的是，芘衍生物荧光分子，合成路线为
Figure BDA0003015957150000022
R＝Py、Ph中至少一种。
本发明还公开上述芘衍生物荧光分子的制备方法，包括如下步骤：
(1)将芘-1,6-二酮与乙二胺衍生物在溶剂中搅拌反应；
(2)反应完毕后，分离提纯，得到芘衍生物荧光分子。
优选的是，步骤(1)中，芘-1,6-二酮与乙二胺衍生物的质量比为1：1.5-3。
本申请中化合物芘-1,6-二酮具体制备过程可参考文献Eur.J.Org.Chem.2008,4120–4125。
本申请中化合物乙二胺衍生物N，N’-双苄基乙二胺是通过已知方法制备得到的，具体制备过程可参考文献Dalton Transactions,2017，46(37),12430-12433。
本申请中化合物乙二胺衍生物N，N’-双(吡啶-2-甲基)乙二胺或者N，N’-双苄基乙二胺是通过已知方法制备得到的，具体制备过程也可参考文献Dalton Transactions,2019，48(11),3743-3757。
上述任一方案中优选的是，步骤(1)中，芘-1,6-二酮与乙二胺衍生物的质量比为1：2.0-2.5。
上述任一方案中优选的是，步骤(1)中，芘-1,6-二酮与乙二胺衍生物的质量比为1：1.5。
上述任一方案中优选的是，步骤(1)中，芘-1,6-二酮与乙二胺衍生物的质量比为1：2.0。芘-1,6-二酮与乙二胺衍生物的质量比1：2.0时为最佳方案，越接近此配比效果越好。
上述任一方案中优选的是，步骤(1)中，芘-1,6-二酮与乙二胺衍生物的质量比为1：2.5。
上述任一方案中优选的是，步骤(1)中，乙二胺衍生物为N，N’-双(吡啶-2-甲基)乙二胺、N，N’-双苄基乙二胺中的至少一种。乙二胺衍生物苯环或吡啶环上有取代基也可以。
上述任一方案中优选的是，步骤(1)中，反应时间为12-18h。
上述任一方案中优选的是，步骤(1)中，反应时间为12h。
上述任一方案中优选的是，步骤(1)中，反应时间为14h。
上述任一方案中优选的是，步骤(1)中，反应时间为16h。
上述任一方案中优选的是，步骤(1)中，反应时间为18h。
上述任一方案中优选的是，步骤(1)中，反应温度为35-45℃。
上述任一方案中优选的是，步骤(1)中，反应温度为35℃。
上述任一方案中优选的是，步骤(1)中，反应温度为38℃。
上述任一方案中优选的是，步骤(1)中，反应温度为40℃。
上述任一方案中优选的是，步骤(1)中，反应温度为45℃。
上述任一方案中优选的是，步骤(2)中，反应完毕后，蒸除溶剂，得到的粗品经硅胶柱层析纯化，得到芘衍生物荧光分子。
上述任一方案中优选的是，步骤(2)中，分离提纯方法包括：反应完毕后，旋转蒸发除去溶剂，得到的固体混合物经硅胶柱层析纯化，得到目标化合物为黄色粉末。
上述任一方案中优选的是，硅胶柱层析纯化时EA:正己烷＝1:1，v/v。
本发明还提供一种所述的制备方法得到的芘衍生物荧光分子在荧光探针设计、生物成像、光电材料领域中的应用。
本发明还提供一种采用上述制备的芘衍生物荧光分子制备荧光增强型分子探针的方法，合成路线为：
Figure BDA0003015957150000041
R＝Py、Ph中至少一种，
优选的，可以的合成路线1如下：
优选的，可以的合成路线2如下：
Figure BDA0003015957150000042
优选的，荧光增强型分子探针的合成路线包括以下步骤：
(1)在氮气保护下，容器内加入荧光分子化合物1或荧光分子化合物2，然后加入二氯甲烷、三乙胺，混合物搅拌溶解；
(2)在冰浴条件下，向步骤(1)所得溶液中滴加烯丙酰氯，搅拌，反应液加入去离子水淬灭反应，加入二氯甲烷萃取分液，有机相洗涤后，合并得到的有机相并干燥；
(3)旋干溶剂，得到的粗产物进行柱层析分离提纯，得到最终产物荧光增强型分子探针。
上述任一方案中优选的是，步骤(1)中容器内加入0.09-0.10mmol荧光分子化合物1或荧光分子化合物2，然后加入10-50mL干燥的二氯甲烷，加入三乙胺80-200μL，混合物搅拌溶解。
上述任一方案中优选的是，步骤(1)中容器内加入0.09mmol荧光分子化合物1或荧光分子化合物2，然后加入10mL干燥的二氯甲烷，加入三乙胺80μL，混合物搅拌溶解。
上述任一方案中优选的是，步骤(1)中容器内加入0.095mmol荧光分子化合物1或荧光分子化合物2，然后加入30mL干燥的二氯甲烷，加入三乙胺120μL，混合物搅拌溶解。
上述任一方案中优选的是，步骤(1)中容器内加入0.10mmol荧光分子化合物1或荧光分子化合物2，然后加入50mL干燥的二氯甲烷，加入三乙胺200μL，混合物搅拌溶解。
上述任一方案中优选的是，荧光分子化合物1的化学式C30H22N4O2。
上述任一方案中优选的是，荧光分子化合物2的化学式为C32H24N2O2。
上述任一方案中优选的是，步骤(2)中烯丙酰氯8-12μL，得到的溶液缓慢升至室温，继续搅拌3-5h，反应液加入6-12mL的去离子水淬灭反应。
上述任一方案中优选的是，步骤(2)中烯丙酰氯8μL，得到的溶液缓慢升至室温，继续搅拌3h，反应液加入6mL的去离子水淬灭反应。
上述任一方案中优选的是，步骤(2)中烯丙酰氯10μL(1.3eq)，得到的溶液缓慢升至室温，继续搅拌4h，反应液加入10mL的去离子水淬灭反应。
上述任一方案中优选的是，步骤(2)中烯丙酰氯12μL，得到的溶液缓慢升至室温，继续搅拌5h，反应液加入12mL的去离子水淬灭反应。
上述任一方案中优选的是，步骤(2)中有机相依次用NaHCO3水溶液和饱和食盐水洗涤，合并得到的有机相用无水硫酸钠干燥。
上述任一方案中优选的是，步骤(3)中得到的粗产物以乙酸乙酯/正己烷为流动相进行柱层析分离提纯，得到最终产物PY-1或PY-2。PY-1的化学式可以为C33H24N4O3。PY-2的化学式可以为C35H26N4O3。
有益效果
(1)本发明提供一种芘衍生物荧光分子极其制备方法，包括如下步骤：将芘-1,6-二酮与乙二胺衍生物在溶剂中搅拌反应；反应完毕后，分离提纯，得到芘衍生物荧光分子。
(2)本发明的制备方法简单，可经过一步迈克尔加成反应得到，所合成的荧光分子化合物1在380nm和400nm处有两个主要的宽吸收峰，其荧光发射最大波长位于530nm处，展现出较宽的斯托克位移(Stokes shift＝130nm)nm，在紫外灯下可观察到强的绿色荧光。以溶解在0.1M的NaOH溶液中的荧光素(量子产率ФF＝95％)作为标准参考物，计算该荧光分子的荧光量子效率为ФF＝27.8％。
(3)合成的荧光分子化合物2在380nm和400nm处有两个主要的宽吸收峰，其荧光发射最大波长位于528nm处，展现出较宽的斯托克位移(Stokes shift＝128nm)nm，在紫外灯下可观察到强的绿色荧光。以溶解在0.1M的NaOH溶液中的荧光素(量子产率ФF＝95％)作为标准参考物，计算该荧光分子的荧光量子效率为ФF＝29.6％。本发明制备方法简单，所得荧光分子荧光量子产率适中，具有较宽的斯托克位移，适合于生物成像。
附图说明
图1是荧光分子化合物1的晶体结构图。
图2是荧光分子化合物2的晶体结构图。
图3是荧光分子化合物1的吸收光谱和发射光谱图。
图4是本发明荧光分子化合物1用来设计荧光增强型分子探针PY-1用来选择性高灵敏检测半胱氨酸示意图。
图5荧光增强型分子探针PY-1检测不同浓度半胱氨酸的荧光光谱变化图。图中曲线从下往上浓度渐增。
具体实施方式
一种芘衍生物荧光分子，其结构式为
Figure BDA0003015957150000071
R＝Py、Ph中至少一种。
芘衍生物荧光分子制备方法包括如下步骤：
(1)将芘-1,6-二酮与乙二胺衍生物在溶剂中搅拌反应；
(2)反应完毕后，蒸除溶剂，得到的粗品经纯化，得到芘衍生物荧光分子，芘衍生物荧光分子包括荧光分子化合物1和芘衍生物荧光分子化合物2。
荧光分子化合物1的化学式为C30H22N4O2，荧光分子化合物2的化学式为C32H24N2O2。具体的，本发明芘衍生物荧光分子的合成化学反应式为：
Figure BDA0003015957150000072
R＝Py、Ph中至少一种。
实施例1
芘衍生物荧光分子化合物1，化学式为C30H22N4O2，制备方法：芘-1,6-二酮(0.15g，0.65mmol)溶解于乙腈溶液(100mL)中，然后加入2.0倍量的N，N’-双(吡啶-2-甲基)乙二胺(0.31g，1.30mmol)(N，N’-双(吡啶-2-甲基)乙二胺是通过已知方法制备得到的，具体制备过程可以参考文献Dalton Transactions,2019，48(11),3743-3757)，将反应混合物在40℃搅拌12h，得到紫色溶液。粗品经硅胶柱层析(EA:正己烷＝1:1，v/v)纯化，得到目标荧光分子化合物1为黄色粉末(0.16g，53％)。将该黄色粉末置于一10mL圆底烧瓶中，室温下加入2mL二氯甲烷溶解。溶解后将该圆底烧瓶置于安静避光处，烧瓶口用棉花塞紧，使溶液缓慢挥发重结晶，得到适合晶体结构测试的单晶，荧光分子化合物1的晶体结构如图1所示。
1H NMR(300MHz，d-DMSO)δ10.22(s，1H)，8.62(dd，J＝15.4，4.1Hz，2H)，8.22(dd，J＝27.6，8.4Hz，2H)，8.04–7.76(m，5H)，7.47(m，5H)，6.11(s，1H)，5.76(s，2H)，4.33(dd，J＝58.2，15.5Hz，2H)，3.18(d，J＝63.3Hz，2H)。13C NMR(75MHz，d-DMSO)δ163.78、161.59、154.63、154.23、152.51、142.46、142.16、130.92、129.87、129.38、128.85、128.01、127.67、127.38、127.14、127.00、126.53、124.65、124.26、124.09、118.61、118.46、116.52、94.12、66.20、60.01、50.60。HRESI-MS:m/z C30H22N4O2[M-H]-：469.1660。
实施例2
芘衍生物荧光分子化合物2的制备方法：芘-1,6-二酮(0.15g，0.65mmol)(化合物芘-1,6-二酮具体制备过程可参考文献Eur.J.Org.Chem.2008,4120–4125)溶解于乙腈溶液(100mL)中，然后加入2.0倍量的N，N’-双苄基乙二胺(0.31g，1.30mmol)，(N，N’-双苄基乙二胺是通过已知方法制备得到的，具体制备过程参考文献Dalton Transactions,2017，46(37),12430-12433。)将反应混合物在40℃搅拌12h，得到棕色溶液。粗品经硅胶柱层析(EA:正己烷＝1:5，v/v)纯化，得到目标芘衍生物荧光分子化合物2为黄色粉末(0.20g，66％)。将该黄色粉末置于一10mL圆底烧瓶中，室温下加入2mL二氯甲烷溶解。溶解后将该圆底烧瓶置于安静避光处，烧瓶口用棉花塞紧，使溶液缓慢挥发重结晶得到适合晶体结构测试的单晶，荧光分子化合物2的化学式为C32H24N2O2，荧光分子化合物2的晶体结构，如图2所示。
1H NMR(300MHz,d-Acetone)δ9.17(s,1H),8.25(d,J＝7.4Hz,2H),7.70(d,J＝7.3Hz,4H),7.56–7.41(m,6H),7.37(d,J＝7.4Hz,1H),5.85(s,1H),4.61(s,1H),4.14(s,1H),3.26(s,2H).13C NMR(75MHz,DMSO)δ161.59,154.87,154.63,154.23,153.43,152.51,151.34,142.46,142.16,130.92,129.87,129.38,128.85,128.01,127.67,127.38,127.14,127.00,126.53,124.65,124.26,124.09,118.61,118.46,116.52,94.12,66.20,60.01,50.60.HRESI-MS:m/z cacld.C30H22N4O2[M-H]-；467.1838,found:467.1834.
实施例3
针对实施例1制备的荧光分子化合物1进行紫外可见和荧光光谱测试：
荧光分子化合物1储备液的配制(1mmol/L):称取23.5mg的荧光分子化合物1化合物放在10mL的圆底烧瓶中，用移液枪量取5mL无水乙醇，搅拌溶解得到储备液，放于冰箱中冷藏备用。
荧光分子化合物1测试溶液的配制:取4μL荧光分子化合物1储备液加入到1996μL的PBS 7.4的缓冲溶液中，混合均匀，然后测量其紫外－可见吸收和荧光光谱。荧光分光光度计的参数设置如下:激发波长为400nm；发射光谱扫描范围425-650nm；激发和发射光的狭缝宽度均为5nm，吸收光谱和发射光谱图如图3所示。
实施例4
采用实施例1制备的荧光分子化合物1进行荧光增强型分子探针设计，合成路线为：
具体方法包括以下步骤：
(1)在氮气保护下，向带有搅拌子的100mL单口烧瓶中加入荧光分子化合物1(0.095mmol)，然后加入20mL干燥的二氯甲烷，加入三乙胺100μL，混合物搅拌2min溶解，得到淡黄色透明溶液。
(2)在冰浴条件下，向上述溶液中通过注射器滴加烯丙酰氯10μL，1分钟内滴完。得到的溶液缓慢升至室温，继续搅拌4h。
(3)反应液加入10mL的去离子水淬灭反应，加入二氯甲烷20mL萃取分液，有机相依次用饱和NaHCO3水溶液(2×30mL)和饱和食盐水(2×30mL)洗涤，合并得到的有机相用无水硫酸钠15g干燥，于40℃旋干溶剂，得到的粗产物以乙酸乙酯/正己烷为流动相进行柱层析分离提纯，得到最终产物荧光增强型分子探针PY-1 45mg，PY-1的化学式为C33H24N4O3，产率90％。1H NMR(500MHz,CD2Cl2)δ8.79(d,J＝4.9Hz,1H),8.70(d,J＝4.5Hz,1H),8.57(s,1H),8.47(s,1H),8.10(t,J＝7.8Hz,2H),8.04(d,J＝9.1Hz,1H),7.95(d,J＝9.2Hz,1H),7.88–7.77(m,1H),7.70(dd,J＝19.5,8.1Hz,2H),7.60(d,J＝8.3Hz,1H),7.41–7.33(m,1H),6.85–6.74(m,1H),6.59(dd,J＝17.3,10.4Hz,2H),6.25(s,1H),6.19(dd,J＝10.5,1.1Hz,1H),5.05(d,J＝18.4Hz,1H),4.88(d,J＝18.7Hz,1H),3.54(s,2H),3.42(s,2H).ESI-MS:m/z C33H24N4O3[M+H]+:525.17。
实施例5
采用实施例4制备的荧光探针进行光谱测试：
荧光增强型分子探针PY-1储备液的配制(1mmol/L):称取19.3mg的荧光增强型分子探针PY-1化合物放在10mL的圆底烧瓶中，用移液枪量取5mL无水乙醇，搅拌溶解得到储备液，放于冰箱中冷藏备用。
荧光增强型分子探针PY-1测试溶液的配制:取4μL探针储备液加入到1996μL的PBS7.4的缓冲溶液中，混合均匀，然后测量其紫外－可见吸收和荧光光谱。荧光分光光度计的参数设置如下:激发波长为400nm；发射光谱扫描范围425-650nm；激发和发射光的狭缝宽度均为5nm。
实施例6
实施例4制备的荧光探针PY-1对半胱氨酸检测的荧光光谱变化测试：本实施例用荧光光谱法检测了实施例3制备的探针对半胱氨酸的响应。图4是荧光增强型分子探针PY-1用来选择性高灵敏检测半胱氨酸示意图。
具体的，取实施例4制备的4μL探针储备液加入到1996μL的PBS 7.4(50mM，pH7.4)的缓冲溶液中，混合均匀，向该溶液中加入最终浓度为0，2.5，5.0，7.5，10.0，12.5，15.0，17.5，20.0μM的半胱氨酸，然后记录其荧光光谱。在25℃的恒温条件下，使用400nm激发波长和500nm/min扫描速率记录425-650nm范围内的荧光光谱来进行溶液的测量，如图5所示。向该体系中加入半胱氨酸后，探针分子溶液荧光强度逐渐增强，溶液变为亮绿色荧光，当加入半胱氨酸浓度为20μM时，荧光强度相比探针自身增加20倍左右。
实施例7
一种芘衍生物荧光分子的制备方法，和实施例1相似，不同的是，芘-1,6-二酮与乙二胺衍生物N，N’-双(吡啶-2-甲基)乙二胺的质量比为1：1.5。
实施例8
一种芘衍生物荧光分子的制备方法，和实施例1相似，不同的是，芘-1,6-二酮与乙二胺衍生物N，N’-双(吡啶-2-甲基)乙二胺的质量比为1：2。
实施例9
一种芘衍生物荧光分子的制备方法，和实施例1相似，不同的是，芘-1,6-二酮与乙二胺衍生物N，N’-双(吡啶-2-甲基)乙二胺的质量比为1：2.2。
实施例10
一种芘衍生物荧光分子的制备方法，和实施例1相似，不同的是，芘-1,6-二酮与乙二胺衍生物N，N’-双(吡啶-2-甲基)乙二胺的质量比为1：2.5。
实施例11
一种芘衍生物荧光分子的制备方法，和实施例1相似，不同的是，反应时间为14h。
实施例12
一种芘衍生物荧光分子的制备方法，和实施例1相似，不同的是，反应时间为16h。
实施例13
一种芘衍生物荧光分子的制备方法，和实施例1相似，不同的是，反应时间为18h。
实施例14
一种芘衍生物荧光分子的制备方法，和实施例1相似，不同的是，反应温度为35℃。
实施例15
一种芘衍生物荧光分子的制备方法，和实施例1相似，不同的是，反应温度为38℃。
实施例16
一种芘衍生物荧光分子的制备方法，和实施例1相似，不同的是，反应温度为40℃。
实施例17
一种芘衍生物荧光分子的制备方法，和实施例1相似，不同的是，反应温度为45℃。
实施例18
一种芘衍生物荧光分子的制备方法，和实施例2相似，不同的是，芘-1,6-二酮与乙二胺衍生物N，N’-双苄基乙二胺的质量比为1：1.5。
实施例19
一种芘衍生物荧光分子的制备方法，和实施例2相似，不同的是，芘-1,6-二酮与乙二胺衍生物N，N’-双苄基乙二胺的质量比为1：2。
实施例20
一种芘衍生物荧光分子的制备方法，和实施例2相似，不同的是，芘-1,6-二酮与乙二胺衍生物N，N’-双苄基乙二胺的质量比为1：2.2。
实施例21
一种芘衍生物荧光分子的制备方法，和实施例2相似，不同的是，芘-1,6-二酮与乙二胺衍生物N，N’-双苄基乙二胺的质量比为1：2.5。
实施例22
一种芘衍生物荧光分子的制备方法，和实施例2相似，不同的是，反应时间为14h。
实施例23
一种芘衍生物荧光分子的制备方法，和实施例2相似，不同的是，反应时间为16h。
实施例24
一种芘衍生物荧光分子的制备方法，和实施例2相似，不同的是，反应时间为18h。
实施例25
一种芘衍生物荧光分子的制备方法，和实施例2相似，不同的是，反应温度为35℃。
实施例26
一种芘衍生物荧光分子的制备方法，和实施例2相似，不同的是，反应温度为38℃。
实施例27
一种芘衍生物荧光分子的制备方法，和实施例2相似，不同的是，反应温度为40℃。
实施例28
一种芘衍生物荧光分子的制备方法，和实施例2相似，不同的是，反应温度为45℃。
实施例29
采用实施例2制备的荧光分子化合物2进行荧光增强型分子探针设计，具体方法包括以下步骤：
(1)在氮气保护下，向带有搅拌子的100mL单口烧瓶中加入荧光分子化合物2(0.095mmol)，然后加入20mL干燥的二氯甲烷，加入三乙胺100μL，混合物搅拌2min溶解。
(2)在冰浴条件下，向上述溶液中通过注射器滴加烯丙酰氯10μL，1分钟内滴完。得到的溶液缓慢升至室温，继续搅拌4h。
反应液加入10mL的去离子水淬灭反应，加入二氯甲烷20mL萃取分液，有机相依次用饱和NaHCO3水溶液(2×30mL)和饱和食盐水((2×30mL)洗涤，合并得到的有机相用无水硫酸钠15g干燥，于40℃旋干溶剂，得到的粗产物以乙酸乙酯/正己烷为流动相进行柱层析分离提纯，得到最终产物荧光增强型分子探针PY-2 44mg，PY-2的化学式可以为C35H26N4O3,产率88％。
实施例30
采用实施例29制备的荧光增强型分子探针PY-2进行光谱测试：
具体的，荧光增强型分子探针PY-2储备液的配制(1mmol/L):称取19.3mg的荧光增强型分子探针PY-2化合物放在10mL的圆底烧瓶中，用移液枪量取5mL无水乙醇，搅拌溶解得到储备液，放于冰箱中冷藏备用。
荧光增强型分子探针PY-2测试溶液的配制:取4μL探针储备液加入到1996μL的PBS7.4的缓冲溶液中，混合均匀，然后测量其紫外－可见吸收和荧光光谱。荧光分光光度计的参数设置如下:激发波长为400nm；发射光谱扫描范围425-650nm；激发和发射光的狭缝宽度均为5nm。
实施例31
采用实施例29制备的荧光探针PY-2对半胱氨酸检测的荧光光谱变化测试：本实施例用荧光光谱法检测了实施例29制备的探针对半胱氨酸的响应。具体的，取实施例30制备的4μL探针储备液加入到1996μL的PBS 7.4(50mM，pH7.4)的缓冲溶液中，混合均匀，向该溶液中加入最终浓度为0，2.5，5.0，7.5，10.0，12.5，15.0，17.5，20.0μM的半胱氨酸，然后记录其荧光光谱。在25℃的恒温条件下，使用400nm激发波长和500nm/min扫描速率记录425-650nm范围内的荧光光谱来进行溶液的测量。向该体系中加入半胱氨酸后，探针分子溶液荧光强度逐渐增强，溶液变为亮绿色荧光，当加入半胱氨酸浓度为20μM时，荧光强度相比探针自身增加20倍左右。
以上实施例只对本发明具有示例性的作用，而不具有任何限制性的作用，本领域的技术人员在本发明的基础上做出的任何非实质性的修改，都应属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种芘衍生物荧光分子制备荧光增强型分子探针的方法，其特征在于，
制备方法包括如下步骤：
(1)将芘-1,6-二酮与乙二胺衍生物在溶剂乙腈中搅拌反应；
(2)反应完毕后，蒸除溶剂，得到的粗品经纯化，得到芘衍生物荧光分子，分离提纯方法包括：反应完毕后，旋转蒸发除去溶剂，得到的固体混合物经硅胶柱层析纯化，得到目标化合物为黄色粉末，硅胶柱层析纯化时EA:正己烷＝1:1，v/v；芘衍生物荧光分子结构式如下：
Figure FDA0003835441270000011
R＝Py、Ph中至少一种，合成路线为
Figure FDA0003835441270000012
(3)芘衍生物荧光分子制备荧光增强型分子探针合成路线为：
Figure FDA0003835441270000013
R＝Py、Ph中至少一种。
2.根据权利要求1所述的芘衍生物荧光分子制备荧光增强型分子探针的方法，其特征在于，步骤(1)中，芘-1,6-二酮与乙二胺衍生物的质量比为1：1.5-3。
3.根据权利要求1所述的芘衍生物荧光分子制备荧光增强型分子探针的方法，其特征在于，步骤(1)中，乙二胺衍生物为N，N’-双(吡啶-2-甲基)乙二胺、N，N’-双苄基乙二胺中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的芘衍生物荧光分子制备荧光增强型分子探针的方法，其特征在于，步骤(1)中，反应温度为35-45℃。
5.根据权利要求1所述的芘衍生物荧光分子制备荧光增强型分子探针的方法，其特征在于，步骤(2)中，反应完毕后，蒸除溶剂，得到的粗品经硅胶柱层析纯化，得到芘衍生物荧光分子。
6.根据权利要求1所述的芘衍生物荧光分子制备荧光增强型分子探针的方法，其特征在于，荧光增强型分子探针的合成路线包括以下步骤：
(1)在氮气保护下，容器内加入荧光分子化合物，然后加入二氯甲烷、三乙胺，混合物搅拌溶解；
(2)在冰浴条件下，向步骤(1)所得溶液中滴加烯丙酰氯，搅拌，反应液加入去离子水淬灭反应，加入二氯甲烷萃取分液，有机相洗涤后，合并得到的有机相并干燥；
(3)旋干溶剂，得到的粗产物进行柱层析分离提纯，得到最终产物荧光增强型分子探针。
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