CN112326852B - 一种1-芘甲醛的应用及生物小分子的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明适用于生物技术领域，提供了一种1‑芘甲醛的应用及生物小分子的检测方法，其通过以1‑芘甲醛作为标签，可以选择性地与半胱氨酸和高半胱氨酸进行反应，从而既扩大了分析物的分子量，使其远离干扰严重的低质量区，同时提高待测物的离子化效率，以实现半胱氨酸和高半胱氨酸的同时快速、高灵敏的定量检测，进而解决了在使用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测时，由于小分子基质的干扰而无法检测生物小分子化合物半胱氨酸和高半胱氨酸的局限性。

Description

一种1-芘甲醛的应用及生物小分子的检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种1-芘甲醛的应用及生物小分子的检测方法。

背景技术

基质辅助激光解析离子化质谱(MALDI-MS)目前已经被广泛应用于蛋白质组学，代谢组学以及临床中的微生物分析。它是一种快速，灵敏，高通量的分析方法。它的原理是通过特殊有机小分子化合物作为基质吸收激光能量，进行质子化传递，进而使分析物离子化，从而达到检测目的。这一特有的工作原理导致，在检测谱图的低质量区，有信号及强的基质信号峰，这就导致在传统MALDI检测中，人们很难进行小分子化合物的检测。

生物小分子是一类在生物体中扮演重要角色的化合物。它们在生物体的生长，调节，代谢，免疫，以及凋亡过程中起到重要作用。生物小分子半胱氨酸(C ys)和高半胱氨酸(Hcy)同样是重要的生物小分子，前者和许多疾病息息相关，例如半胱氨酸贮积症和肝损伤等；后者在阿兹海默症中表现出了高表达性。

现有针对生物小分子Cys和Hcy的分析方法主要是荧光方法，但是由于两者结构及其相似，所以在于荧光基团结合后，通常两者的荧光发射峰会互相干扰，对检测结构带来影响，因此现有荧光方法很难对两者的定性与定量分析同时兼顾；并且在复杂的生物体系中，也可能由于体系过于复杂，所以会出现假阳性的结果。另外，传统MALDI检测方法中对于小分子化合物的检查有局限性，因此建立一种快速，高通量的Cys和Hcy的定量分析方法是非常重要的。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种1-芘甲醛作为标签在基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测生物小分子中的应用，旨在解决背景技术中提出的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种1-芘甲醛作为标签在基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测生物小分子中的应用。

其中，1-芘甲醛的结构式如下：

作为本发明实施例的一个优选方案，所述生物小分子为半胱氨酸和/或高半胱氨酸。

本发明实施例的另一目的在于提供一种生物小分子的检测方法，其包括以下步骤：

将1-芘甲醛溶于溶剂中，得到1-芘甲醛溶液；

将待检测的生物小分子与缓冲溶液进行混合，得到待检测溶液；

将1-芘甲醛溶液与待检测溶液进行混合反应，得到反应液；

将基质2,5-二羟基苯甲醛溶于磷酸二氢铵与乙腈的混合溶液中，得到基质溶液；

将反应液与基质溶液进行混合后，再进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析。

其中，1-芘甲醛分别与Cys和Hcy的反应方程式如下：

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述生物小分子为半胱氨酸和/或高半胱氨酸。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述1-芘甲醛溶液中，1-芘甲醛的浓度为3～7mmol/L。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述缓冲溶液为磷酸缓冲盐溶液(P BS缓冲溶液)。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述缓冲溶液的pH为7～8.5。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述磷酸二氢铵与乙腈的混合溶液中，磷酸二氢铵与乙腈的体积比为(6～8):(2～4)。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述基质溶液中，2,5-二羟基苯甲醛的浓度为10～20mg/mL。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述溶剂为甲醇。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述步骤中，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析时，反应液与基质溶液的总体积为0.5～1μL。

本发明实施例提供的一种1-芘甲醛作为标签在基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测生物小分子中的应用，通过以1-芘甲醛(1-py)作为标签，可以选择性地与Cys和Hcy进行反应，从而既扩大了分析物的分子量，使其远离干扰严重的低质量区，同时提高待测物的离子化效率，以实现Cys和Hcy的同时快速、高灵敏的定量检测，进而解决了在使用MALDI-MS检测时，由于小分子基质的干扰而无法检测生物小分子化合物半胱氨酸(Cys)和高半胱氨酸(Hcy)的局限性。本发明在实际应用于MALDI-TOF-MS的Cys和Hcy的定量检测时，可以有效地降低待测物的检测限，使两者的最低检测限可以达到250amol/L，同时可以实现两者的同时的定量检测，定量范围可以从250nM～250μM，跨越3个数量级的定量检测。

具体的，本发明将1-芘甲醛作为标签，可以标记Cys和Hcy，以用于二者的MALDI-TOF-MS的定量分析中。其中，1-芘甲醛中的醛基可以和Cys和Hcy中的游离巯基发生反应，从而实现Cys和Hcy的衍生化。由于1-芘甲醛含有联苯的芘结构，所以其自身有良好的紫外吸收能力；并且在355nm处，紫外吸收能力同样良好，这样可以在衍生化后，提升待测物的离子化效率，提供检测灵敏度，降低检测限。同时，通过衍生化，可以提升待测物的分子量，使其远离基质干扰严重的低质量区，从而易于被检测出来。因此运用本发明方法，可以将检测限降低到10～16mol/L，实现了对Cys和Hcy的超高灵敏检测。同时，在浓度从高到低变化时，在衍生化后标签会逐渐的发生源内丢失一分子量氢气的现象，通过浓度变化与丢失氢气量的多少进行对比，发现在10^-4～10^-7mol/L浓度范围内，两者呈线性关系，由此，可以实现Cys和Hcy在10^-4～10^-7mol/L浓度范围内的定量分析。

综上所述，本发明相比于现有技术具有以下有益效果如下：

一、1-芘甲醛购置成本低，其具有共轭结构，在355nm处有良好的紫外吸收，因此其具有提高离子化效率的效果，并且该化合物含有一个醛基，能与含有游离巯基的Cys和Hcy进行高效率的反应，可将该化合物作为MALDI质谱的标签，提高Cys和Hcy的检测的灵敏度。

二、1-芘甲醛作为Cys和Hcy的衍生化试剂，其与Cys和Hcy发生的衍生化反应反应过程简单，反应效率高，该反应无需进行后续的分离纯化，操作简单高效，大大提高了Cys和Hcy在MALDI质谱中的离子化效率。

三、传统基质在小分子区域有较强的基质干扰，使得小分子区域的Cys和H cy测定困难，但1-芘甲醛作为标签时，小分子区域的Cys和Hcy的峰强大大提高，使得待测物的分子量被扩大，从而使其远离基质干扰严重的低质量区域，使得小分子区域Cys和Hcy的检测得到重大突破，检测限大大降低。

四、1-芘甲醛作为标签时，由于其自身的特殊结构，因此它在激光能量的激发下，自身会丢失一分子量的氢气，待测物中丢失氢气的量和其被检测的浓度在一定的浓度范围内呈线性关系，因此在无需外标物的情况下就可以分别对Cys和Hcy同时进行定量检测。

附图说明

图1为1-芘甲醛与Cys在不同pH环境下进行衍生化反应的吸光度对比图。

图2为1-芘甲醛与Hcy在不同pH环境下进行衍生化反应的吸光度对比图。

图3为1-芘甲醛与Cys在进行不同时间的衍生化反应的吸光度对比图。

图4为1-芘甲醛与Hcy在进行不同时间的衍生化反应的吸光度对比图。

图5为1-芘甲醛与Cys在不同温度环境下进行衍生化反应的吸光度对比图。

图6为1-芘甲醛与Hcy在不同温度环境下进行衍生化反应的吸光度对比图。

图7为检测1-芘甲醛分别与Cys和Hcy反应后产物质谱图。

图8为检测1-芘甲醛分别与Cys和Hcy反应后产物的检测限质谱图。

图9为Cys的定量关系曲线图。

图10为Hcy的定量关系曲线图。

图11为反应前的1-芘甲醛、1-芘甲醛分别与Cys和Hcy反应后产物的紫外吸收光谱图。

具体实施方式

为下面将结合本发明实施例中，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

其中，下述实施例中所用的容器、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。具体的，下述实施例所用的基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱仪的型号为Autoflexspeed TOF/TOF(Bruker Daltonics，Germany)，激光为355nm波长的Nd:YAG激光器。质谱测试参数：加速电压：20.000kv；延迟引出电压：18.000kv；延迟引出时间：150ns；反射器电压：20.000kv；透镜电压：6.000kv；频率：500Hz。下述实施例所用的紫外分光光度计的型号为UV-2550(SHIMADZU,Kyoto，Japan)，检测波长范围200～500nm，波长宽度为1nm。

实施例1

该实施例提供了1-芘甲醛作为标签衍生化生物小分子Cys和Hcy的最佳条件测试方法，其包括以下步骤：

S1、使用PBS缓冲溶液分别配制浓度为5mM的Cys和Hcy储备液，保存于4℃的冰箱中以备用；

S2、将1-芘甲醛溶于甲醇中，配制浓度为5mM的1-芘甲醛溶液。

S3、分别取500μL的1-芘甲醛溶液于1.5mL离心管中，然后分别加入250μL步骤S1得到的Cys和Hcy储备液，并进行反应，得到反应液。

S4、使用紫外分光光度计中测定反应液的吸光度。

作为对比：步骤S1中PBS缓冲溶液的pH分别为7、7.5和8，其测试结果如图1～2所示，从图中可以看出，反应后的Cys和Hcy在pH 7.5的情况下吸光度最强。

作为对比：步骤S3中的反应在不同的反应时间下得到得到反应液，其测试结果如图3～4所示，从图中可以看出，反应后的Cys和Hcy在反应时间为1h的情况下吸光度最强。

作为对比：步骤S3中的反应在不同的反应温度下得到得到反应液，其测试结果如图5～6所示，从图中可以看出，反应后的Cys和Hcy在不同的反应温度下吸光度变化不大。

实施例2

该实施例提供了1-芘甲醛在MALDI质谱中作为标签检测生物小分子Cys和Hcy的方法，其包括以下步骤：

S1、分别使用pH＝7.5的PBS缓冲溶液配制浓度为5mM的Cys和Hcy储备液，保存于4℃的冰箱中以备用。

S2、将1-芘甲醛溶于甲醇中，配制浓度为5mM的1-芘甲醛溶液。

S3、分别取500μL的1-芘甲醛溶液于1.5mL离心管中，然后分别加入250μL步骤S1得到的储备液，在室温下反应1小时，得到反应液。

S4、将基质2,5-二羟基苯甲醛(DHB)溶于磷酸二氢铵(ADP)与乙腈(ACN)体积比为7:3的混合溶液中，配制DHB浓度为10g/L的基质溶液。

S5、取等体积的反应液和基质溶液，预先混合均匀，得到混合液。

S6、取1μL的混合液点在与MALDI-MS配套的靶板上，在室温下自然冷却，待溶剂挥发结晶，送入MALDI-MS进行分析，其结果如附图7所示。

作为对比：步骤S1中Cys和Hcy储备液梯度稀释至10^-4M，分别取1μL的Cys和Hcy溶液与1μL常用基质2，5-二羟基苯甲酸混合，然后取1μL混合液点在anchorchip靶板上，室温自然干燥，送入MALDI-MS进行分析。

从图7中可以看出，1-芘甲醛作为Cys和Hcy的衍生化试剂，其与Cys和Hcy发生亲核加成反应过程简单，反应效率高，该反应无需进行后续的分离纯化，操作简单高效，提高了Cys和Hcy在MALDI质谱中的离子化效率，扩大了Cys和Hcy的分子量。

实施例3

该实施例提供了测定1-芘甲醛作为标签时Cys和Hcy的检测限的方法，其包括以下步骤：

S1、将实施例2中的Cys和Hcy储备液按浓度梯度分别稀释到浓度1mM，0.5mM，0.05mM，0.005mM和0.000000005mM的溶液，备用。

S2、将1-芘甲醛溶于甲醇中，配制浓度为5mM的1-芘甲醛溶液。

S3、取5个1.5mL离心管编号1、2、3、4、5，分别加入500μL的1-芘甲醛溶液，然后加入500μL步骤S1中不同浓度的Cys和Hcy溶液，在室温下反应1小时，得到反应液。

S4、将基质2,5-二羟基苯甲醛(DHB)溶于磷酸二氢铵(ADP)与乙腈(ACN)体积比为7:3的混合溶液中，配制DHB浓度为10g/L的基质溶液。

S5、取等体积的反应液和基质溶液，预先混合均匀，得到混合液。

S6、取1μL的混合液点在与MALDI-MS配套的靶板上，在室温下自然冷却，待溶剂挥发结晶，送入MALDI-MS进行分析，其结果如附图8所示。从图中可以看出，用1-芘甲醛作标签可以将Cys和Hcy的检测限降低至100amol。具体的，1-芘甲醛作为标签时，小分子区域的Cys和Hcy的峰强大大提高，得到干净的分析物峰，使得小分子区域Cys和Hcy的检测得到重大突破，检测限大大降低。

实施例4

该实施例提供了用1-芘甲醛作MALDI-MS标签定量检测Cys和Hcy的方法，其包括以下步骤：

S1、将实施例2中的Cys储备液按浓度梯度分别稀释到浓度500μM，250μM，200μM，100μM，50μM，2μM，0.5μM的溶液备用；将实施例2中的Hcy储备液按浓度梯度分别稀释到浓度500μM，250μM，100μM，50μM，2μM，1μM的溶液备用，备用。

S2、将1-芘甲醛溶于甲醇中，配制浓度为5mM的1-芘甲醛溶液。

S3、取7个1.5mL离心管编号1、2、3、4，5，6，7分别加入500μL的1-芘甲醛溶液，然后加入500μL步骤S1中不同浓度的Cys溶液，在室温下反应1小时，得到反应液；取6个1.5mL离心管编号1、2、3、4，5，6分别加入500μL的1-芘甲醛溶液，然后加入500μL步骤S1中不同浓度的Hcy溶液，在室温下反应1小时，得到反应液。

S4、将基质2,5-二羟基苯甲醛(DHB)溶于磷酸二氢铵(ADP)与乙腈(ACN)体积比为7:3的混合溶液中，配制DHB浓度为10g/L的基质溶液。

S5、取等体积的反应液和基质溶液，预先混合均匀，得到混合液。

S6、取1μL的混合液点在与MALDI-MS配套的靶板上，在室温下自然冷却，待溶剂挥发结晶，送入MALDI-MS进行分析。

S7、分别采集不同浓度下反应后的Cys和Hcy的质谱数据，通过对比不同浓度下产生的丢失氢气的峰强度占丢失氢气的峰强加上未丢失氢气的峰强的之和，通过对比发现，不同浓度下丢失氢气的峰强度的占比与浓度之间呈线性关系，具体如图9～10所示。因此在250μM～0.25μM的浓度范围内，两者呈线性关系，从而实现了Cys和Hcy跨越3个数量级的定量。

另外，反应前的1-芘甲醛、1-芘甲醛分别与Cys和Hcy反应后产物的紫外吸收光谱图如图11所示。

实施例5

该实施例提供了1-芘甲醛在MALDI质谱中作为标签检测生物小分子Cys和Hcy的方法，其包括以下步骤：

S1、分别使用pH＝7.5的PBS缓冲溶液配制浓度为5mM的Cys和Hcy储备液，保存于4℃的冰箱中以备用。

S2、将1-芘甲醛溶于甲醇中，配制浓度为3mM的1-芘甲醛溶液。

S3、分别取500μL的1-芘甲醛溶液于1.5mL离心管中，然后分别加入250μL步骤S1得到的储备液，在室温下反应1小时，得到反应液。

S4、将基质2,5-二羟基苯甲醛(DHB)溶于磷酸二氢铵(ADP)与乙腈(ACN)体积比为6:4的混合溶液中，配制DHB浓度为20g/L的基质溶液。

S5、取等体积的反应液和基质溶液，预先混合均匀，得到混合液。

S6、取0.5μL的混合液点在与MALDI-MS配套的靶板上，在室温下自然冷却，待溶剂挥发结晶，送入MALDI-MS进行分析。

实施例6

该实施例提供了1-芘甲醛在MALDI质谱中作为标签检测生物小分子Cys和Hcy的方法，其包括以下步骤：

S1、分别使用pH＝7.5的PBS缓冲溶液配制浓度为5mM的Cys和Hcy储备液，保存于4℃的冰箱中以备用。

S2、将1-芘甲醛溶于甲醇中，配制浓度为7mM的1-芘甲醛溶液。

S3、分别取500μL的1-芘甲醛溶液于1.5mL离心管中，然后分别加入250μL步骤S1得到的储备液，在室温下反应1小时，得到反应液。

S4、将基质2,5-二羟基苯甲醛(DHB)溶于磷酸二氢铵(ADP)与乙腈(ACN)体积比为8:2的混合溶液中，配制DHB浓度为15g/L的基质溶液。

S5、取等体积的反应液和基质溶液，预先混合均匀，得到混合液。

S6、取0.8μL的混合液点在与MALDI-MS配套的靶板上，在室温下自然冷却，待溶剂挥发结晶，送入MALDI-MS进行分析。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (1)

1.一种1-芘甲醛作为标签在基质辅助激光解析电离飞行时间质谱定量检测生物小分子中的应用，其特征在于，所述生物小分子为半胱氨酸和/或高半胱氨酸；生物小分子的定量检测方法包括以下步骤：

将1-芘甲醛溶于溶剂中，得到1-芘甲醛溶液；

将待检测的生物小分子与缓冲溶液进行混合，得到待检测溶液；

将1-芘甲醛溶液与待检测溶液进行混合反应，得到反应液；

将基质2,5-二羟基苯甲醛溶于磷酸二氢铵与乙腈的混合溶液中，得到基质溶液；

将反应液与基质溶液进行混合后，再进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析；

分别采集不同浓度的生物小分子进行上述反应后的质谱数据，通过分别对比不同浓度的生物小分子进行上述反应后的质谱数据，根据不同浓度条件下1-芘甲醛与生物小分子进行反应的产物在质谱分析过程中产生的丢失氢气的离子的峰强度占产物丢失氢气的离子的峰强度加上未丢失氢气的产物的峰强度的之和的比例，得到不同浓度下产物丢失氢气的离子的峰强度的占比与对应生物小分子的浓度之间的线性关系；其中，当生物小分子为半胱氨酸时，未丢失氢气的产物为[(1-py-Cys)-H²+H]⁺，产物丢失氢气的离子为[1-py-Cys+H]⁺；当生物小分子为高半胱氨酸时，未丢失氢气的产物为[(1-py-Hcy)-H²+H]⁺，产物丢失氢气的离子为[1-py-Hcy+H]⁺；

采集待检测的生物小分子进行上述反应后的质谱数据，并根据上述不同浓度下产物丢失氢气的离子的峰强度的占比与对应生物小分子的浓度之间的线性关系，计算得到待检测的生物小分子的浓度；

其中，所述1-芘甲醛溶液中，1-芘甲醛的浓度为3~7mmol/L；所述缓冲溶液为磷酸缓冲盐溶液，其pH为7.5；所述磷酸二氢铵与乙腈的混合溶液中，磷酸二氢铵与乙腈的体积比为6:4或7:3或8:2；所述基质溶液中，2,5-二羟基苯甲醛的浓度为10~20mg/mL；所述溶剂为甲醇。

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