CN101210928B - 用功能糖芯片及飞行质谱仪分析糖结合蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

一种用功能糖芯片及飞行质谱仪分析糖结合蛋白的方法，其首先配制偶联剂溶液，孵育固相载体，清洗、干燥后，将还原糖用水溶解，调至所需的浓度，经点样、温育，得功能糖芯片。将生物样品直接加在功能糖芯片上，进行孵育、去除杂质、成形晶体、解离晶体，用飞行质谱仪检测荷电离子在真空电场中飞行的时间，得到蛋白质图谱信息，直观显示被测生物样品中分子量、丰度等蛋白质信息，鉴定蛋白质差异表达。将被测生物样品的蛋白质图谱信息与样本图谱信息进行比照，得到差异表达的糖结合蛋白质信息。本发明解决了背景技术中检测通量低，检测步骤繁琐，周期长的技术问题。本发明操作简便，灵敏度高，重复性好，适合于医学临床的快速分析应用。

Description

用功能糖芯片及飞行质谱仪分析糖结合蛋白的方法

技术领域

本发明涉及一种分析糖结合蛋白的方法，具体是一种采用功能糖芯片，结合表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术来对糖结合蛋白进行检测和鉴定的方法。

背景技术

目前，蛋白质组学的分析检测所涉及的技术主要有：二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)、电喷雾质谱(ESI-MS)、基质辅助激光解吸离子飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)及近期出现的蛋白质芯片联用飞行时间质谱仪技术。飞行时间质谱仪是基于表面增强激光解析电离光谱技术(surface-enhanced laser desorptionionization spectrometry，SELDI)发展起来的，其基本原理是2002年诺贝尔化学奖获得者田中耕一于1993年提出的。同年，美国的Bill Hutchens和Tai-Yung Yip提出了改良的表面增强激光解析电离飞行时间质谱(surface-enhanced laser desorptionionization time of flight，SELDI-TOF-MS)。

以质谱技术为基础的直接检测法，是将吸附在芯片表面的靶蛋白离子化，使之能在电场力的作用下飞行，根据离子的飞行时间计算出质量电荷比，用以分析蛋白质的分子量和相对含量；得到的蛋白指纹图谱，用以鉴定蛋白特异性生物标志物。此技术在识别特定蛋白质表达物、进行蛋白水平的药物筛选、揭示蛋白激酶作用、测定血清中小分子物质含量等方面具有更准确、更迅速的特点，是目前最直接、最有效的比较蛋白质组分析方法。

糖结合蛋白的重要生物学功能表现在细胞间的通讯和识别、细胞与病原微生物的相互作用、细胞内蛋白的运输、蛋白间的相互作用、蛋白与受体的特异性结合等方面。糖结合蛋白的研究因缺乏高通量的技术和手段而相对滞后，目前，功能糖芯片是研究糖结合蛋白与其糖配体相互作用最有效的高通量技术，此技术的建立为高通量研究糖与蛋白质间相互作用的机理，为蛋白质与糖链作用的关系提供有效的工具。但糖芯片在用于检测糖结合蛋白时仍采用示踪物，例如：采用放射性同位素、荧光染料、胶体金、金磁微粒等标记蛋白技术，经标记的蛋白在结构方面或多或少会发生变化，进而会影响其与糖链的相互识别、作用及结合。对糖结合蛋白的鉴定仍需要先对其进行分离纯化，然后用质谱法、蛋白质测序法等技术对其鉴定。

目前，蛋白质的研究多采用色谱分离纯化、二维电泳、光谱、质谱等分析化学的方法，其存在如下瓶颈问题：

1.适用范围窄。无法用于分离跨膜蛋白，不能检出样品中的众多低丰度蛋白质。

2.检测通量低。只能依次鉴定单个蛋白斑点，限制了检测通量，不适于大规模医学临床筛查。

3.检测步骤繁琐，周期长，不能实现全自动化的分析检测。

4.检测费用高。应用所需技术条件高，仪器昂贵，导致检测费用高，不适用于临床检测。

5.蛋白质芯片联用飞行时间质谱仪技术无法明确检测糖结合蛋白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用功能糖芯片及飞行质谱仪分析糖结合蛋白的方法，其解决了背景技术中检测通量低，检测步骤繁琐，周期长的技术问题。

本发明的技术解决方案：

功能糖芯片是分析测定糖结合蛋白与其糖链配体相互作用的高通量技术，与飞行时间质谱仪联用，用于糖结合蛋白的分析测定，比较糖结合蛋白变化，可确定生物标志物。具体方案如下：

一种用功能糖芯片及飞行质谱仪分析糖结合蛋白的方法，其特征在于，该方法的实现步骤包括：

(1)制备功能糖芯片：

(1.1)配制偶联剂溶液、孵育固相载体：将偶联剂溶于有机溶剂中，配制成10～50mol/L的偶联剂有机溶液；将衍生化的固相载体浸入偶联剂有机溶液中，室温下孵育3小时。

(1.2)清洗：分别用溶解偶联剂的有机溶剂和无水乙醇将固相载体清洗二次。

(1.3)干燥：将固相载体于室温干燥。

(1.4)将还原糖用水溶解，调至所需的浓度。

(1.5)点样：加入pH3～6的酸性点样缓冲液，对固相载体进行点样。

(1.6)温育：于25～60℃温育12小时，得功能糖芯片。

(2)加载生物样品：

(2.1)将生物样品直接加在功能糖芯片上；糖结合蛋白质通过与糖链的特异识别结合到功能糖芯片上，形成特定糖结合蛋白与糖链的复合物；糖链基团以共价偶联方式固定于芯片表面：特定糖结合蛋白与糖链基团通过特异的相互识别和作用，吸附于功能糖芯片上。

(2.2)孵育时间0.5-2小时。

(3)去除杂质：用清洗缓冲液清洗，去除功能糖芯片上的非特异结合蛋白质、弱结合蛋白质，以消除干扰。

(4)成形晶体：

加上能量吸收分子或基质，于室温干燥，能量吸收分子或基质与蛋白质结合形成混合晶体。混合晶体有利于促进蛋白质在检测中的解吸附和离子化。

(5)解离晶体：

用激光解吸电离的方法使结合在功能糖芯片上的蛋白质解离，形成荷电离子。

(6)绘制质谱图：

由于不同质荷比的荷电离子在真空电场中飞行的时间长短不同，用飞行质谱仪检测荷电离子在真空电场中飞行的时间，获取数据，得到蛋白质图谱信息，由绘制质谱图可直观显示被测生物样品中分子量、丰度等蛋白质信息，对其进行解析。

(7)鉴定蛋白质差异表达：

将被测生物样品的蛋白质图谱信息与样本图谱信息进行比照，得到差异表达的糖结合蛋白质信息。

上述偶联剂可采用含有一个氨基和一个羟基的偶联剂；上述衍生化的固相载体可采用环氧乙烷基团衍生化的固相载体。

上述偶联剂具体可采用4-羟基苯甲酰胺或4-羟基丁酸肼等。

上述偶联剂可采用含有一个羧基和一个羟基的偶联剂；上述衍生化的固相载体可采用氨基基团衍生化的固相载体；上述偶联剂有机溶液中加有N-羟基琥珀酰亚胺和二环已基碳二亚胺，该偶联剂有机溶液中按溶质比例：

偶联剂∶N-羟基琥珀酰亚胺∶二环已基碳二亚胺＝1∶2∶2～4；所述偶联剂被活化的酸基生成活泼酯衍生物。

上述偶联剂可采用4-羟基苯基戊酸或16-羟基十六羧酸等。

上述配制偶联剂有机溶液中的有机溶剂可采用乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙腈或二甲基甲酰胺等；上述还原糖可采用单糖、寡糖或多糖等；上述固相载体可采用玻片、硝酸纤维素膜或瓷片等。

上述清洗缓冲液具体可采用2×PBS的清洗缓冲液，上述能量吸收分子具体可采用白芥子酸，上述基质具体可采用2，5-二羟基苯甲酸。

上述生物样品可以是毫血液、尿液、细胞裂解、脑脊液、关节腔滑液或支气管洗脱液等。

本发明具有以下优点：

1.功能糖芯片上的糖链活性稳定，可在室温条件下长期保存生物活性不变。

2.操作简便。糖链与载体的结合，不用物理吸附的方法，也无需先对糖链进行化学修饰，是糖的还原末端半缩醛ROH以糖苷键的形式共价偶联到羟基衍生化的载体上，可直接用于未纯化的样品分析，不需要对待分析样品进行示踪标记。

3.灵敏度高，重复性好，适合于医学临床的快速分析应用。

4.所需样品量少，应用范围广泛。可用于未纯化的尿液、血液、脑脊液、关节腔滑液、支气管洗脱液、细胞裂解液及各种分泌物等的分析、筛查。

5.具有高通量的分析能力，可同时快速发现多个生物标志物，进行快速、准确的早期检测、分析。具有与“双相电泳加飞行质谱”相似的功能，同时可用于测定疏水蛋白质。

6.在同一系统中集发现和检测为一体，不需要对靶蛋白进行分离纯化、特异性高，可发现低丰度、小分子量的蛋白质，鉴定功能蛋白质。

具体实施方式

本发明的实现步骤如下：

1.制备功能糖芯片：

(1)配制偶联剂溶液、孵育固相载体：将偶联剂溶于有机溶剂中，配制成10～50mol/L的偶联剂有机溶液；将衍生化的固相载体浸入其中，室温下孵育3小时。本发明偶联剂可采用含有一个氨基和一个羟基的偶联剂，衍生化的固相载体可采用环氧乙烷基团衍生化的固相载体。偶联剂具体可采用4-羟基苯甲酰胺或4-羟基丁酸肼等。本发明偶联剂也可采用含有一个羧基和一个羟基的偶联剂，衍生化的固相载体也可采用氨基基团衍生化的固相载体。偶联剂有机溶液中按溶质比例：

偶联剂∶N-羟基琥珀酰亚胺∶二环已基碳二亚胺＝1∶2∶2～4，加N-羟基琥珀酰亚胺和二环已基碳二亚胺，偶联剂被活化的酸基生成活泼酯衍生物。偶联剂具体可采用4-羟基苯基戊酸或16-羟基十六羧酸。本发明配制偶联剂有机溶液中的有机溶剂可采用乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙腈或二甲基甲酰胺等，还原糖可采用单糖、寡糖或多糖等，固相载体可采用玻片、硝酸纤维素膜或瓷片等。

(2)清洗：分别用溶解偶联剂的有机溶剂和无水乙醇将固相载体清洗二次。

(3)干燥：将固相载体于室温干燥。

(4)将还原糖用水溶解，调至所需的浓度。

(5)点样：加入pH3～6的酸性点样缓冲液，对固相载体进行点样。

(6)温育：于25～60℃温育12小时，得功能糖芯片。

2.加载生物样品：

(1)将生物样品直接加在功能糖芯片上。糖结合蛋白质通过与糖链的特异识别结合到功能糖芯片上，形成特定糖结合蛋白与糖链的复合物。糖链基团以共价偶联方式固定于芯片表面。特定糖结合蛋白与糖链基团通过特异的相互识别和作用，吸附于功能糖芯片上。本发明生物样品是指血液、尿液、细胞裂解、脑脊液、关节腔滑液、支气管洗脱液以及各种分泌物或其他蛋白等。生物粗样品一般是指含有高盐、去垢剂等杂质的未纯化的生物样品。

(2)进行孵育，孵育时间0.5-2小时。

3.去除杂质：用2×PBS清洗缓冲液清洗，去除功能糖芯片上的非特异结合蛋白质、弱结合蛋白质，以消除干扰。

4.成形晶体：加上SA(sinapinic acid，白芥子酸)等能量吸收分子，或基质如：DHBA(2，5-dihydroxybenzoic acid，2，5-二羟基苯甲酸)等，于室温干燥，能量吸收分子或基质与蛋白质结合形成混合晶体。混合晶体有利于促进蛋白质在检测中的解吸附和离子化。

5.解离晶体：用激光脉冲辐射即激光解吸电离的方法，使结合在功能糖芯片上的蛋白质解离，形成荷电离子。

6.绘制质谱图：由于不同质荷比的荷电离子在真空电场中飞行的时间长短不同，用飞行质谱仪检测荷电离子在真空电场中飞行的时间，获取数据，得到蛋白质图谱信息，可直观显示被测生物样品中分子量、丰度等蛋白质信息。

7.鉴定蛋白质差异表达：

将被测生物样品的蛋白质图谱信息与样本图谱信息进行比照，得到差异表达的糖结合蛋白质信息。

Claims (6)

1.一种用功能糖芯片及飞行质谱仪分析糖结合蛋白的方法，其特征在于，该方法的实现步骤包括：

(1)制备功能糖芯片：

(1.1)配制偶联剂溶液、孵育固相载体：将偶联剂溶于有机溶剂中，配制成10～50mol/L的偶联剂有机溶液；将衍生化的固相载体浸入偶联剂有机溶液中，室温下孵育3小时；

(1.2)清洗：分别用溶解偶联剂的有机溶剂和无水乙醇将固相载体清洗二次；

(1.3)干燥：将固相载体于室温干燥；

(1.4)将还原糖用水溶解，调至所需的浓度；

(1.5)点样：加入pH3～6的酸性点样缓冲液，对固相载体进行点样；

(1.6)温育：于25～60℃温育12小时，得功能糖芯片；

(2)加载生物样品：

(2.1)将生物样品直接加在功能糖芯片上；糖结合蛋白质通过与糖链的特异识别结合到功能糖芯片上，形成特定糖结合蛋白与糖链的复合物；糖链基团以共价偶联方式固定于芯片表面；特定糖结合蛋白与糖链基团通过特异的相互识别和作用，吸附于功能糖芯片上；

(2.2)孵育时间0.5-2小时；

(3)去除杂质：用清洗缓冲液清洗，去除功能糖芯片上的非特异结合蛋白质、弱结合蛋白质；

(4)成形晶体：

加上能量吸收分子或基质，于室温干燥，能量吸收分子或基质与蛋白质结合形成混合晶体；

(5)解离晶体：

用激光解吸电离的方法使结合在功能糖芯片上的蛋白质解离，形成荷电离子；

(6)绘制质谱图：

用飞行质谱仪检测荷电离子在真空电场中飞行的时间，得到蛋白质图谱信息，绘制质谱图；

(7)鉴定蛋白质差异表达：

将被测生物样品的蛋白质图谱信息与样本图谱信息进行比照，得到差异表达的糖结合蛋白质信息；

所述的偶联剂是含有一个氨基和一个羟基的偶联剂；所述的衍生化的固相载体是环氧乙烷基团衍生化的固相载体；

或者所述的偶联剂是含有一个羧基和一个羟基的偶联剂；所述的衍生化的固相载体是氨基基团衍生化的固相载体；所述的偶联剂有机溶液中加有N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺，该偶联剂有机溶液中按溶质比例：偶联剂∶N-羟基琥珀酰亚胺∶二环己基碳二亚胺＝1∶2∶2～4；所述偶联剂被活化的酸基生成活泼酯衍生物。

2.根据权利要求1所述的用功能糖芯片及飞行质谱仪分析糖结合蛋白的方法，其特征在于：所述的含有一个氨基和一个羟基的偶联剂是4-羟基苯甲酰胺或4-羟基丁酸肼。

3.根据权利要求1所述的用功能糖芯片及飞行质谱仪分析糖结合蛋白的方法，其特征在于：所述的含有一个羧基和一个羟基的偶联剂是4-羟基苯基戊酸或16-羟基十六羧酸。

4.根据权利要求1所述的用功能糖芯片及飞行质谱仪分析糖结合蛋白的方法，其特征在于：所述的配制偶联剂有机溶液中的有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙腈或二甲基甲酰胺；所述的还原糖为单糖、寡糖或多糖；所述的固相载体为玻片、硝酸纤维素膜或瓷片。

5.根据权利要求4所述的用功能糖芯片及飞行质谱仪分析糖结合蛋白的方法，其特征在于：所述的清洗缓冲液为2×PBS的清洗缓冲液，所述的能量吸收分子为白芥子酸，所述的基质为2，5-二羟基苯甲酸。

6.根据权利要求5所述的用功能糖芯片及飞行质谱仪分析糖结合蛋白的方法，其特征在于：所述的生物样品是血液、尿液、细胞裂解、脑脊液、关节腔滑液或支气管洗脱液。