CN110763800A - 检测血液中奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的方法 - Google Patents

检测血液中奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了检测血液中奥卡西平及10，11‑二氢‑10‑羟基卡马西平的方法包括：制备奥卡西平及10，11‑二氢‑10‑羟基卡马西平标准储备液、制备奥卡西平及10，11‑二氢‑10‑羟基卡马西平标准中间液、制备内标工作液和制备标准溶液，利用液相色谱‑质谱联用仪检测标准溶液，拟合得到奥卡西平及10，11‑二氢‑10‑羟基卡马西平对应的标准曲线方程分别为：y1＝a*x1+b和y2＝c*x2+d；对待测血液进行处理，利用液相色谱‑质谱联用仪检测待测血液，计算出待测血液中的奥卡西平及10，11‑二氢‑10‑羟基卡马西平的浓度，在本发明中，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、灵敏度高。

Description

检测血液中奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种检测血液中奥卡西平和10，11-二氢-10- 羟基卡马西平的方法。
背景技术
奥卡西平化学结构式和药理作用独特，属心境稳定剂，临床广泛用于局限性及全身性癫痫发作。10，11-二氢-10-羟基卡马西平是奥卡西平的主要活性代谢产物，二者均具有抗惊厥活性，故对奥卡西平及其活性代谢产物的监测具有重要的临床意义。
目前，检测服用奥卡西平的患者的血液样本时，通常采用高效液相色谱法进行测试。
但是，通过上述方法检测血液样本中的奥卡西平和其活性代谢物10，11-二氢-10-羟基卡马西平含量时，需要对血液样本进行前处理，例如，萃取。由于萃取处理的时间通常较长，从而使得检测时间长，导致血液样本的检测效率低。
发明内容
本申请的发明目的是提供了一种检测血液中奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的方法，能够提高血液样本的检测效率。
本发明的检测血液中奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的方法，其中：它包括以下步骤：
(一)标准溶液的标定
(a)制备奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平标准储备液
精确称取奥卡西平标准品1.71mg置于2mL冻存管，用含水量为0％-30％的甲醇溶液进行溶解，并定容于1mL，得到奥卡西平标准储备液，在-80℃条件下保存；
精确称取10，11-二氢-10-羟基卡马西平标准品2.87mg置于2mL冻存管，用含水量为 10％～80％的甲醇溶液进行溶解，并定容于1mL，得到10，11-二氢-10-羟基卡马西平标准储备液，在-80℃条件下保存；
(b)制备奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的标准中间液
将上述步骤(a)的奥卡西平标准储备液和10，11-二氢-10-羟基卡马西平标准储备液按照1:1.2的体积混合，用含水量为10％～80％甲醇稀释液稀释上述奥卡西平和10，11-二氢 -10-羟基卡马西平的标准储备液，制成含有浓度为0.5859μg/mL～37.5μg/mL的奥卡西平和浓度为1.172μg/mL～75μg/mL的10，11-二氢-10-羟基卡马西平的至少三种浓度的奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平标准中间液，并在-80℃条件下保存；
(c)制备内标工作液
将2500μg/mL的奥卡西平-d4储备液和2180μg/mL的10，11-二氢-10-羟基卡马西平- d4储备液按照1:2.295的体积混合，得到混合液，用含水量为10％～80％甲醇稀释液稀释上述混合液，得到一种含有1～10μg/mL奥卡西平-d4和含有1～10μg/mL 10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的内标工作液，并在-80℃条件下保存；
(d)制备标准溶液
分别移取10μL上述至少三种浓度的奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的标准中间液，在上述每一种奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的标准中间液中分别加入 10μL的内标工作液和90μL含水量为70％甲醇稀释液，并在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，再加入1000μL蛋白沉淀剂乙腈，并在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀5～10min，然后在10000～15000rpm的转速下高速离心5～10min，得到上清液，取上述上清液100μL，在上述上清液中加入600μL的含水量70％的甲醇溶液，并在转速为 1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，制成至少三种不同浓度的标准溶液，其中，每一种浓度的标准溶液中包含的内标物的浓度相同；
(e)拟合标准曲线方程
利用液相色谱-质谱联用仪检测上述每一种浓度的标准溶液，得到至少三种不同浓度的标准溶液的奥卡西平和奥卡西平-d4、10，11-二氢-10-羟基卡马西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的色谱峰峰面积，分别以上述至少三种不同浓度的标准溶液中的奥卡西平的色谱峰峰面积与奥卡西平-d4的色谱峰峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1，10， 11-二氢-10-羟基卡马西平的色谱峰峰面积与10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的色谱峰峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y2，以上述至少三种不同浓度的标准溶液中的奥卡西平的浓度与奥卡西平-d4的浓度的比值作为标准曲线的横坐标x1，10，11-二氢-10-羟基卡马西平的浓度与10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的浓度的比值作为标准曲线的横坐标 x2，将上述检测所得的至少三种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到奥卡西平和奥卡西平-d4对应的标准曲线方程为：y1＝a*x1+b，10，11-二氢-10-羟基卡马西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4对应的标准曲线方程为：y2＝c*x2+d，并且得到权重系数a、b、c、 d；
(二)待测血液样本的处理
取待测血液至少2mL，在离心速度3000～4000rpm下离心8～15min，提取待测血液的上清液，并在-20℃条件下保存；
移取步骤(c)的奥卡西平-d4和10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的内标工作液10μL 于1.5mL离心管中，再加入上述待测血液的上清液10μL，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合30s，然后在上述离心管中加入蛋白沉淀剂乙腈1000μL，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合5min后，再在12000rpm的转速下高速离心5min得到上清液，取上述上清液 100μL并加入含水量为70％的甲醇稀释液600μL，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合1min，得到上清液即为待测血液样本；
(三)待测血液样本的检测
利用液相色谱-质谱联用仪检测上述待测血液样本，得到待测血液样本中的奥卡西平和奥卡西平-d4、10，11-二氢-10-羟基卡马西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的色谱峰峰面积；将待测血液样本中的奥卡西平的色谱峰峰面积与奥卡西平-d4的色谱峰峰面积的比值作为y1，代入步骤(e)得到的y1＝a*x1+b公式中，计算得到待测血液样本中的奥卡西平兰的浓度与奥卡西平-d4的浓度的比值x1，由于上述待测血液样本中，奥卡西平-d4的浓度为已知，由此计算出待测血液样本中的奥卡西平浓度；将待测血液样本中的10，11-二氢- 10-羟基卡马西平的色谱峰峰面积与10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的色谱峰峰面积的比值作为y2，代入步骤(e)得到的y2＝c*x2+d公式中，计算得到待测血液样本中的10，11- 二氢-10-羟基卡马西平的浓度与10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的浓度的比值x2，由于上述待测血液样本中，10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的浓度为已知，由此计算出待测血液样本中的10，11-二氢-10-羟基卡马西平浓度。
本发明的检测血液中奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的方法，其中：在步骤 (b)中，制备七种含有不同浓度奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的标准中间液，它们分别是含有0.5859μg/mL奥卡西平和1.172μg/mL10，11-二氢-10-羟基卡马西平、1.172μg/mL奥卡西平和2.344μg/mL10，11-二氢-10-羟基卡马西平、2.344μg/mL奥卡西平和4.688μg/mL10，11-二氢-10-羟基卡马西平、4.688μg/mL奥卡西平和9.375μg/mL10，11-二氢-10-羟基卡马西平、9.375μg/mL奥卡西平和18.75μg/mL10，11-二氢-10-羟基卡马西平、18.75μg/mL奥卡西平和37.5μg/mL10，11-二氢-10-羟基卡马西平和37.5μg/mL奥卡西平和75μg/mL10，11-二氢-10-羟基卡马西平的标准中间液。
本发明的检测血液中奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的方法，其中：在步骤 (b)中，所述甲醇稀释液为含水量30％甲醇溶液。
本发明的检测血液中奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的方法，其中：在步骤 (a)中，用纯甲醇溶解奥卡西平标准品，用含水量30％的甲醇溶液溶解10，11-二氢-10- 羟基卡马西平标准品。
本发明的检测血液中奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的方法，其中：在步骤 (c)中，用含水量为30％甲醇稀释液稀释奥卡西平-d4和10，11-二氢-10-羟基卡马西平- d4储备液，得到一种含有3μg/mL奥卡西平-d4和含有3μg/mL10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的内标工作液。
本发明的检测血液中奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的方法，其中：所述液相色谱-质谱联用仪的色谱条件包括：C18反向色谱柱；柱温为20～40℃；流动相为：水和甲醇，上述水与甲醇的体积比为3：7，上述水和甲醇的等度洗脱时间不小于2.0min；流动相的流速为0.2～0.8mL/min。
本发明的检测血液中奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的方法，其中：所述液相色谱-质谱联用仪的质谱条件包括：液相色谱-质谱联用仪的质谱检测器为ESI(+)模式；离子源参数包括：气流量为8～50L/min，喷雾量为20～50L/min，气体温度为300～400℃，毛细管电压为5500～6500V。
本发明的检测血液中奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的方法，其中：所述 C18反向色谱柱为Waters Atlantis dC18色谱柱。
本发明的检测血液中奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的方法，其中：所述液相色谱-质谱联用仪的在线过滤器为SSI COL PRE-FILTER WATER 1/16 0.5M。
本发明具有如下有益效果：
1、在本发明一实施例中，利用液相色谱-质谱联用仪分别检测至少三种浓度的标准溶液，其中，标准溶液为具有内标物的奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的标准溶液，且至少三种浓度标准溶液中内标物浓度一致；根据至少三种浓度标准溶液的检测结果，分别拟合奥卡西平的标准曲线方程以及10，11-二氢-10-羟基卡马西平的标准曲线方程；对待检测血液进行高速离心处理，并向离心后的上清液中加入与标准溶液中相同量的内标物工作液，在高转速下涡旋振荡混合，再加入沉淀蛋白试剂，并再次进行高速涡旋振荡混合以及高速离心处理，以使溶液混合均匀获得去除干扰物后的上清液。利用液相色谱-质谱联用仪检测该上清液，基于奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的第一检测结果和奥卡西平的标准曲线方程以及10，11-二氢-10-羟基卡马西平的标准曲线方程，得到待测血液样本中奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的浓度，实现了同时检测血液中的奥卡西平和 10，11-二氢-10-羟基卡马西平，有效地缩短了检测时间。
2、在本发明一实施例中，对待测血液样品的处理方法以及内标物的选择，使得奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、灵敏度高，同时，回收率，检测限和精密度等各项技术指标均符合要求，同时，该检测血液中奥卡西平与10，11-二氢-10-羟基卡马西平的方法，重现性良好，且加样回收率良好，从而提高检测结果的准确度，消除系统误差。
附图说明
图1是本发明的奥卡西平OXC的化学结构式；
图2是本发明的10，11-二氢-10-羟基卡马西平MHD的化学结构式；
图3是本发明的标准溶液中奥卡西平、10，11-二氢-10-羟基卡马西平和奥卡西平-d4、 10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的色谱图；
图4是本发明提供的标准溶液中奥卡西平、10，11-二氢-10-羟基卡马西平和奥卡西平- d4、10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的质谱图；
图5是本发明提供的待测血液样本中的奥卡西平、10，11-二氢-10-羟基卡马西平和奥卡西平-d4、10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的色谱图；
图6是本发明提供的待测血液样本中的奥卡西平、10，11-二氢-10-羟基卡马西平和奥卡西平-d4、10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的质谱图。
具体实施方式
为使本申请的发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的技术方案进行描述。
本发明的检测血液中奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的方法包括以下步骤：
(一)标准溶液的标定
(a)制备奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的标准储备液
精确称取奥卡西平标准品1.71mg置于2mL冻存管，用纯甲醇溶液进行溶解，并定容于1mL，得到奥卡西平标准储备液，在-80℃条件下保存；
精确称取10，11-二氢-10-羟基卡马西平标准品2.87mg置于2mL冻存管，用含水量为 50％的甲醇溶液进行溶解，并定容于1mL，得到10，11-二氢-10-羟基卡马西平标准储备液，在-80℃条件下保存；
(b)制备奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的标准中间液
将上述步骤(a)的奥卡西平标准储备液和10，11-二氢-10-羟基卡马西平标准储备液按照1:1.2的体积混合，用含水量为30％甲醇稀释液稀释上述奥卡西平和10，11-二氢-10- 羟基卡马西平的标准储备液，制成含有浓度为0.5859μg/mL～37.5μg/mL的奥卡西平和浓度为1.172μg/mL～75μg/mL的10，11-二氢-10-羟基卡马西平的七种浓度的奥卡西平和10， 11-二氢-10-羟基卡马西平标准中间液，它们分别是含有0.5859μg/mL奥卡西平和1.172μg/mL10，11-二氢-10-羟基卡马西平、1.172μg/mL奥卡西平和2.344μg/mL10，11-二氢-10-羟基卡马西平、2.344μg/mL奥卡西平和4.688μg/mL10，11-二氢-10-羟基卡马西平、4.688μg/mL奥卡西平和9.375μg/mL10，11-二氢-10-羟基卡马西平、9.375μg/mL奥卡西平和18.75μg/mL10，11-二氢-10-羟基卡马西平、18.75μg/mL奥卡西平和37.5μg/mL10，11-二氢-10-羟基卡马西平和37.5μg/mL奥卡西平和75μg/mL10，11-二氢-10-羟基卡马西平的标准中间液，并在-80℃条件下保存；
(c)制备内标工作液
将2500μg/mL的奥卡西平-d4储备液和2180μg/mL的10，11-二氢-10-羟基卡马西平- d4储备液按照1:2.295的体积混合，得到混合液，用含水量为30％甲醇稀释液稀释上述混合液，得到一种含有4μg/mL奥卡西平-d4和含有8μg/mL 10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的内标工作液，并在-80℃条件下保存；
(d)制备标准溶液
分别移取10μL上述七种浓度的奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的标准中间液，在上述每一种奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的标准中间液中分别加入10μL的内标工作液和90μL、含水量为70％甲醇稀释液，并在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，再加入1000μL蛋白沉淀剂乙腈，并在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀5～10min，然后在10000～15000rpm的转速下高速离心5～10min，得到上清液，取上述上清液100μL，在上述上清液中加入600μL的含水量70％的甲醇溶液，并在转速为 1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，制成七种不同浓度的标准溶液，其中，每一种浓度的标准溶液中包含的内标物的浓度相同；
(e)拟合标准曲线方程
利用液相色谱-质谱联用仪检测上述每一种浓度的标准溶液，得到上述七种不同浓度的标准溶液的奥卡西平和奥卡西平-d4、10，11-二氢-10-羟基卡马西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的色谱峰峰面积，分别以上述七种不同浓度的标准溶液中的奥卡西平的色谱峰峰面积与奥卡西平-d4的色谱峰峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1，以10，11- 二氢-10-羟基卡马西平的色谱峰峰面积与10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的色谱峰峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y2，以上述七种不同浓度的标准溶液中的奥卡西平的浓度与奥卡西平-d4的浓度的比值作为标准曲线的横坐标x1，10，11-二氢-10-羟基卡马西平的浓度与10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的浓度的比值作为标准曲线的横坐标x2，将上述检测所得的七种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到奥卡西平和奥卡西平-d4对应的标准曲线方程为：y1＝a*x1+b，10，11-二氢-10-羟基卡马西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4对应的标准曲线方程为：y2＝c*x2+d，并且得到权重系数a、b、c、d；
(二)待测血液样本的处理
取待测血液至少2mL，在离心速度3000～4000rpm下离心10min，提取待测血液的上清液，并在-20℃条件下保存；
移取步骤(c)的奥卡西平d4和10，11-二氢-10-羟基卡马西平d4的内标工作液10μL于1.5mL离心管中，再加入上述待测血液的上清液10μL，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合30s，然后在上述离心管中加入蛋白沉淀剂乙腈1000μL，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合5min后，再在12000rpm的转速下高速离心5min得到上清液，取上述上清液 100μL并加入含水量为70％的甲醇稀释液600μL，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合1min，得到上清液即为待测血液样本；
(三)待测血液样本的检测
利用液相色谱-质谱联用仪检测上述待测血液样本，得到待测血液样本中的奥卡西平和奥卡西平-d4、10，11-二氢-10-羟基卡马西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的色谱峰峰面积；将待测血液样本中的奥卡西平的色谱峰峰面积与奥卡西平-d4的色谱峰峰面积的比值作为y1，代入步骤(e)得到的y1＝a*x1+b公式中，计算得到待测血液样本中的奥卡西平兰的浓度与奥卡西平-d4的浓度的比值x1，由于上述待测血液样本中，奥卡西平-d4的浓度为已知，由此计算出待测血液样本中的奥卡西平浓度；将待测血液样本中的10，11-二氢- 10-羟基卡马西平的色谱峰峰面积与10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的色谱峰峰面积的比值作为y2，代入步骤(e)得到的y2＝c*x2+d公式中，计算得到待测血液样本中的10，11- 二氢-10-羟基卡马西平的浓度与10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的浓度的比值x2，由于上述待测血液样本中，10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的浓度为已知，由此计算出待测血液样本中的10，11-二氢-10-羟基卡马西平浓度。
液相色谱-质谱联用仪的色谱条件包括：C18为Waters Atlantis dC18反向色谱柱；柱温为30℃；流动相为：水和甲醇，上述水与甲醇的体积比为3：7，上述水和甲醇的等度洗脱时间不小于2.0min；流动相的流速为0.2～0.8mL/min。
液相色谱-质谱联用仪的质谱条件包括：液相色谱-质谱联用仪的质谱检测器为ESI(+) 模式；离子源参数包括：气流量为12L/min，喷雾量为30L/min，气体温度为350℃，毛细管电压为6000V。液相色谱-质谱联用仪的在线过滤器为SSI COL PRE-FILTER WATER 1/16 0.5M。
可以理解的是，进样量可以是0.1μL到30μL范围内的任一体积，比如，0.1μL，0.2μL， 0.5μL，1μL，5μL，10μL，15μL，20μL，25μL以及30μL。
针对柱温来说，20～40℃是指在20℃到40℃的任一温度，比如，20℃，21℃，22.5℃， 23℃，24℃，25℃，27.5℃，29℃，30.5℃，33℃，34℃，35℃，37℃，38.5℃，39℃以及40℃等，在该范围内任一温度下，检测出来的结果大体一致。
针对气流量来说，8～50L/min是指在8L/min到50L/min的任一流速，比如，8L/min，8.5L/min，9L/min，11L/min，14L/min，19L/min，24L/min，28.5L/min，35L/min， 38.5L/min，42L/min，44L/min，47.5L/min，49L/min以及50L/min等。
针对喷雾量来说，20～50L/min是指在20L/min到50L/min的任一流速，比如， 20L/min，22.5L/min，26L/min，30L/min，32L/min，35.5L/min，36L/min，40L/min， 43L/min，46.5L/min以及50L/min等。
针对气体温度来说，300～400℃是指300℃到400℃的任一温度，比如，300℃，320℃， 350℃，380℃以及400℃等。
针对毛细管电压来说，5500～6500V是指5500V到6500V的任一电压，比如，5500V，5700V，5900V，6200V以及6500V等。
进一步地，液相色谱-质谱联用仪的质谱参数可进一步如下表1所示：
表1
物质名称 母离子 子离子 Dwell Fragmentor CE CAV
奥卡西平 253.1 208.1 100 95 35 5
奥卡西平 253.1 180.1 100 95 19 3
10，11-二氢-10-羟基卡马西平 255.1 237.1 100 80 19 5
10，11-二氢-10-羟基卡马西平 255.1 194.1 100 80 4 3
奥卡西平-d4 257.1 184.1 100 95 35 5
10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4 257.1 198.1 100 80 19 5
上述表中，Dwell表征扫描时间，Fragmentor表征裂解电压，CE表征碰撞电压，CAV表征碰撞池加速电压。奥卡西平253.1-208.1离子对作为定性使用，253.1-180.1离子对作为定量使用。10，11-二氢-10-羟基卡马西平255.1-237.1离子对作为定性使用，255.1-184.1 离子对作为定量使用。
图3显示了一种浓度的标准溶液中奥卡西平、10，11-二氢-10-羟基卡马西平和奥卡西平-d4、10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的色谱图，图4显示了一种浓度的标准溶液中奥卡西平、10，11-二氢-10-羟基卡马西平和奥卡西平-d4、10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4 的质谱图。其中，图3中的数字标识1从上到下依次为标准溶液中奥卡西平定量离子对253.1-180.1和定性离子对253.1-208.1的色谱图，数字标识2为标准溶液中奥卡西平-d4的色谱图，数字标识3从上到下依次为标准溶液中10，11-二氢-10-羟基卡马西平定量离子对255.1-184.1和定性离子对255.1-237.1的色谱图，数字标识4为标准溶液中10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的色谱图；图4中的数字标识1从上到下依次为标准溶液中奥卡西平定量离子对253.1-180.1和定性离子对253.1-208.1的质谱图，数字标识2为标准溶液中奥卡西平-d4的质谱图，数字标识3从上到下依次为标准溶液中10，11-二氢-10-羟基卡马西平定量离子对255.1-184.1和定性离子对255.1-237.1的质谱图，数字标识4为标准溶液中 10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的质谱图。标准溶液中的奥卡西平、10，11-二氢-10-羟基卡马西平和奥卡西平-d4、10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的保留时间分别为0.795min、0.800min、0.750min、0.757min。
图5显示了待测血液样本中的奥卡西平、10，11-二氢-10-羟基卡马西平和奥卡西平-d4、 10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的色谱图，图6显示了待测血液样本中的奥卡西平、10， 11-二氢-10-羟基卡马西平和奥卡西平-d4、10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的质谱图，如图5所示；其中图5中的数字标识1从上到下依次为待测血液样本中奥卡西平定量离子对 253.1-180.1和定性离子对253.1-208.1的色谱图，数字标识2为待测血液样本中奥卡西平- d4的色谱图，数字标识3从上到下依次为待测血液样本中10，11-二氢-10-羟基卡马西平定量离子对255.1-184.1和定性离子对255.1-237.1的色谱图，数字标识4为待测血液样本中 10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的色谱图；图6中的数字标识1从上到下依次为待测血液样本中奥卡西平定量离子对253.1-180.1和定性离子对253.1-208.1的质谱图，数字标识2 为待测血液样本中奥卡西平-d4的质谱图，数字标识3从上到下依次为待测血液样本中10， 11-二氢-10-羟基卡马西平定量离子对255.1-184.1和定性离子对255.1-237.1的质谱图，数字标识4为待测血液样本中10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的质谱图。待测血液样本中的奥卡西平、10，11-二氢-10-羟基卡马西平和奥卡西平-d4、10，11-二氢-10-羟基卡马西平 -d4的保留时间分别为0.795min、0.800min、0.750min、0.757min。
从图3、图4、图5和图6对比可见，待测血液样本中的奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的保留时间与标准溶液中的奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的保留时间已知，以奥卡西平-d4、10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4为内标物，使得奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、准确度和灵敏度高。
为了证明本申请溶液中含有一定浓度奥卡西平与10，11-二氢-10-羟基卡马西平所存在的线性关系，特作以下实验：
将上述配制的各个浓度的奥卡西平与10，11-二氢-10-羟基卡马西平的标准工作液，加入10μL内标工作液，并加入稀释液90μL含水量为70％甲醇稀释液混匀进样，按照上述处理方法及检测条件进行检测，以定量离子色谱峰峰面积与浓度作图，得到标准曲线，结果表明奥卡西平与10，11-二氢-10-羟基卡马西平的线性范围和定量限如下：
奥卡西平
(1)检测限(LOD)：0.0645μg/mL。
(2)定量限(LOQ)：0.1395μg/mL。
(3)线性范围：0.5859μg/mL到37.5μg/mL范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.99。
10，11-二氢-10-羟基卡马西平
(1)检测限(LOD)：0.0645μg/mL。
(2)定量限(LOQ)：0.1395μg/mL。
(3)线性范围：1.172μg/mL到75μg/mL范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.99。
分别取含奥卡西平与10，11-二氢-10-羟基卡马西平的标曲混合中间液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，按照上述处理方法及检测条件进行检测，重复分析测定3批次，奥卡西平的回收率和精密度如下表2所示，10，11-二氢-10-羟基卡马西平的回收率和精密度如下表3所示表2
加标量 1.17μg/mL 4.69μg/mL 18.75μg/mL
平均回收率 108％ 102％ 99％
精密度RSD 3.29％ 2.70％ 0.99％
由表2可知，奥卡西平在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为99％～108％，相对标准偏差为0.99％～3.29％。
表3
加标量 2.34μg/mL 9.38μg/mL 37.50μg/mL
平均回收率 107％ 104％ 102％
精密度RSD 3.54％ 1.21％ 1.24％
由表3可知，10，11-二氢-10-羟基卡马西平在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为102％～107％，相对标准偏差为1.21％～3.54％。
综合上述验证试验，检测限、回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，方法检测血液中奥卡西平与10，11-二氢-10-羟基卡马西平浓度，重现性良好，加样回收率高，提高了检测结果的准确度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种检测血液中奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的方法，其特征在于：它包括以下步骤：
(一)标准溶液的标定
(a)制备奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平标准储备液
精确称取奥卡西平标准品1.71mg置于2mL冻存管，用含水量为0％-30％的甲醇溶液进行溶解，并定容于1mL，得到奥卡西平标准储备液，在-80℃条件下保存；
精确称取10，11-二氢-10-羟基卡马西平标准品2.87mg置于2mL冻存管，用含水量为10％-80％的甲醇溶液进行溶解，并定容于1mL，得到10，11-二氢-10-羟基卡马西平标准储备液，在-80℃条件下保存；
(b)制备奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的标准中间液
将上述步骤(a)的奥卡西平标准储备液和10，11-二氢-10-羟基卡马西平标准储备液按照1∶1.2的体积混合，用含水量为10％～80％甲醇稀释液稀释上述奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的标准储备液，制成含有浓度为0.5859μg/mL～37.5μg/mL的奥卡西平和浓度为1.172μg/mL～75μg/mL的10，11-二氢-10-羟基卡马西平的至少三种浓度的奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平标准中间液，并在-80℃条件下保存；
(c)制备内标工作液
将2500μg/mL的奥卡西平-d4储备液和2180μg/mL的10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4储备液按照1：2.295的体积混合，得到混合液，用含水量为10％～80％甲醇稀释液稀释上述混合液，得到一种含有1～10μg/mL奥卡西平-d4和含有1～10μg/mL 10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的内标工作液，并在-80℃条件下保存；
(d)制备标准溶液
分别移取10μL上述至少三种浓度的奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的标准中间液，在上述每一种奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的标准中间液中分别加入10μL的内标工作液和90μL含水量为70％甲醇稀释液，并在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，再加入1000uL蛋白沉淀剂乙腈，并在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀5～10min，然后在10000～15000rpm的转速下高速离心5～10min，得到上清液，取上述上清液100μL，在上述上清液中加入600μL的含水量70％的甲醇溶液，并在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，制成至少三种不同浓度的标准溶液，其中，每一种浓度的标准溶液中包含的内标物的浓度相同；
(e)拟合标准曲线方程
利用液相色谱-质谱联用仪检测上述每一种浓度的标准溶液，得到至少三种不同浓度的标准溶液的奥卡西平和奥卡西平-d4、10，11-二氢-10-羟基卡马西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的色谱峰峰面积，分别以上述至少三种不同浓度的标准溶液中的奥卡西平的色谱峰峰面积与奥卡西平-d4的色谱峰峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1，10，11-二氢-10-羟基卡马西平的色谱峰峰面积与10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的色谱峰峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y2，以上述至少三种不同浓度的标准溶液中的奥卡西平的浓度与奥卡西平-d4的浓度的比值作为标准曲线的横坐标x1，10，11-二氢-10-羟基卡马西平的浓度与10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的浓度的比值作为标准曲线的横坐标x2，将上述检测所得的至少三种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到奥卡西平和奥卡西平-d4对应的标准曲线方程为：y1＝a*x1+b，10，11-二氢-10-羟基卡马西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4对应的标准曲线方程为：y2＝c*x2+d，并且得到权重系数a、b、c、d；
(二)待测血液样本的处理
取待测血液至少2mL，在离心速度3000～4000rpm下离心8～15min，提取待测血液的上清液，并在-20℃条件下保存；
移取步骤(c)的奥卡西平-d4和10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的内标工作液10μL于1.5mL离心管中，再加入上述待测血液的上清液10μL，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合30s，然后在上述离心管中加入蛋白沉淀剂乙腈1000μL，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合5min后，再在12000rpm的转速下高速离心5min得到上清液，取上述上清液100μL并加入含水量为70％的甲醇稀释液600μL，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合1min，得到上清液即为待测血液样本；
(三)待测血液样本的检测
利用液相色谱-质谱联用仪检测上述待测血液样本，得到待测血液样本中的奥卡西平和奥卡西平-d4、10，11-二氢-10-羟基卡马西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的色谱峰峰面积；将待测血液样本中的奥卡西平的色谱峰峰面积与奥卡西平-d4的色谱峰峰面积的比值作为y1，代入步骤(e)得到的y1＝a*x1+b公式中，计算得到待测血液样本中的奥卡西平的浓度与奥卡西平-d4的浓度的比值x1，由于上述待测血液样本中，奥卡西平-d4的浓度为已知，由此计算出待测血液样本中的奥卡西平浓度；将待测血液样本中的10，11-二氢-10-羟基卡马西平的色谱峰峰面积与10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的色谱峰峰面积的比值作为y2，代入步骤(e)得到的y2＝c*x2+d公式中，计算得到待测血液样本中的10，11-二氢-10-羟基卡马西平的浓度与10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的浓度的比值x2，由于上述待测血液样本中，10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的浓度为已知，由此计算出待测血液样本中的10，11-二氢-10-羟基卡马西平浓度。
2.如权利要求1所述的检测血液中奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的方法，其特征在于：在步骤(b)中，制备七种含有不同浓度艾司西酞普兰的标准中间液，它们分别是含有0.5859μg/mL奥卡西平和1.172μg/mL10，11-二氢-10-羟基卡马西平、1.172μg/mL奥卡西平和2.344μg/mL10，11-二氢-10-羟基卡马西平、2.344μg/mL奥卡西平和4.688μg/mL10，11-二氢-10-羟基卡马西平、4.688μg/mL奥卡西平和9.375μg/mL10，11-二氢-10-羟基卡马西平、9.375μg/mL奥卡西平和18.75μg/mL10，11-二氢-10-羟基卡马西平、18.75μg/mL奥卡西平和37.5μg/mL10，11-二氢-10-羟基卡马西平和37.5μg/mL奥卡西平和75μg/mL10，11-二氢-10-羟基卡马西平的标准中间液。
3.根据权利要求2所述的检测血液中奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的方法，其特征在于：在步骤(b)中，所述甲醇稀释液为含水量30％甲醇溶液。
4.根据权利要求3所述的检测血液中奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的方法，其特征在于：在步骤(a)中，用纯甲醇溶解奥卡西平标准品，用含水量50％的甲醇溶液溶解10，11-二氢-10-羟基卡马西平标准品。
5.根据权利要求4所述的检测血液中奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的方法，其特征在于：在步骤(c)中，用含水量为30％甲醇稀释液稀释奥卡西平-d4和10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4储备液，得到一种含有4μg/mL奥卡西平-d4和含有8μg/mL10，11-二氢-10-羟基卡马西平-d4的内标工作液。
6.根据权利要求5所述的检测血液中奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的方法，其特征在于：所述液相色谱-质谱联用仪的色谱条件包括：C18反向色谱柱；柱温为20～40℃；流动相为：水和甲醇，上述水与甲醇的体积比为3∶7，上述水和甲醇的等度洗脱时间不小于2.0min；流动相的流速为0.2～0.8mL/min。
7.根据权利要求6所述的检测血液中奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的方法，其特征在于：所述液相色谱-质谱联用仪的质谱条件包括：液相色谱-质谱联用仪的质谱检测器为ESI(+)模式；离子源参数包括：气流量为8～50L/min，喷雾量为20～50L/min，气体温度为300～400℃，毛细管电压为5500～6500V。
8.根据权利要求7所述的检测血液中奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的方法，其特征在于：所述C18反向色谱柱为Waters Atlantis dC18色谱柱。
9.根据权利要求8所述的检测血液中奥卡西平和10，11-二氢-10-羟基卡马西平的方法，其特征在于：所述液相色谱-质谱联用仪的在线过滤器为SSI COL PRE-FILTER WATER1/16 0.5M。
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