CN114671809A - 一种奥卡西平衍生物、免疫原、抗奥卡西平特异性抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

一种奥卡西平衍生物、免疫原、抗奥卡西平特异性抗体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种奥卡西平衍生物、免疫原、抗奥卡西平特异性抗体及其制备方法与应用。首先将新型奥卡西平衍生物与经过基因工程改造得到的重组人血清白蛋白偶联制得奥卡西平人工抗原，再用奥卡西平人工抗原免疫实验动物获得抗奥卡西平特异性抗体，经ELISA检测表明该特异性抗体的特异性强、灵敏度高，干扰实验显示该特异性抗体与100种常见药物无任何交叉反应；将抗奥卡西平特异性抗体应用于制备奥卡西平检测试剂，包括奥卡西平均相酶免疫检测试剂与奥卡西平胶乳增强免疫比浊检测试剂，所述检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对奥卡西平的高通量、快速化检测。

Description

一种奥卡西平衍生物、免疫原、抗奥卡西平特异性抗体及其制 备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种奥卡西平衍生物、免疫原、抗奥卡西平特异性抗体及其制备方法与应用，属于生物医学检测技术领域。
背景技术
奥卡西平（Oxcarbazepine）是被批准用于治疗成人和儿童部分性癫痫的辅助治疗或单药治疗的抗癫痫药物。奥卡西平的化学结构为10,11-二氢-10-氧代-5H-二苯并[b，f]氮杂卓-5-甲酰胺，其代谢物10-羟基卡马西平的化学结构为10,11-二氢-10-氢卡马西平。奥卡西平可溶于DMSO、甲醇、水、乙醇和丙酮，在DMSO中溶解度≤9 mg/mL。10-羟基卡马西平在甲醇中溶解度为100μg/mL。奥卡西平通过胃肠道快速吸收并迅速降解为有药理活性的代谢产物10-羟基卡马西平（MHD）而发挥作用。多项研究表明，奥卡西平原型仅占血清中总放射活性的2%，因此临床上对奥卡西平治疗浓度的评价是通过对10-羟基卡马西平浓度的检测来体现的。
奥卡西平的不良反应有：①过敏反应：服药患者出现躯干部、面颈部红色斑疹伴瘙痒，眼睑膜充血等症状；②低钠血症：患者用药后出现嗜睡，精神萎靡，四肢肌张力增高，血钠含量低于正常水平；③甲状腺功能异常；④尿潴留；⑤诱导癫痫发作；⑥定向力障碍、共济失调等。对于肾功能不全的患者、妊娠期和产褥期妇女用药患者，以及与其它抗癫痫药物进行合并用药的患者，及时监测血清中奥卡西平代谢物浓度从而及时调整治疗剂量是至关重要的。此外，由于奥卡西平会导致过敏、低血钠症、甲状腺功能异常和尿潴留等不良反应，因此在奥卡西平用药期间要对服用该药的患者进行严密观察，测定患者血清内药物浓度，及时发现不良反应并对症治疗，避免严重不良反应发生，保证用药安全。
奥卡西平代谢物的血药浓度检测方法有高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-串联质谱(HPLC-MS)等。高效液相色谱法对临床癫痫患者进行血药浓度测定时，常用的抗癫痫药物丙戊酸、卡马西平和苯妥英钠对MHD的测定无干扰，特异性较好，灵敏度高，但其样品预处理过程复杂，时间长。液相色谱-串联质谱同时测定人血浆中奥卡西平和MHD浓度，样品前处理血浆用量少，分析时间较短，但操作较繁琐，过程不易控制，不方便形成大规模临床检验。
因此，目前市面上缺乏线性范围宽、灵敏度高、准确度高、精密度高、检测时间短，样品处理简单，适用于全自动化检测仪器，可进行高通量、快速化检测的奥卡西平检测产品。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种奥卡西平衍生物，该衍生物为新合成的化合物，自然界中不存在。
本发明的第一个目的采用以下技术方案实现：一种奥卡西平衍生物，其结构式如式Ⅰ所示：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE001
式Ⅰ。
本发明的第二个目的在于提供一种如上所述的奥卡西平衍生物的合成方法，该合成方法不同于常规合成方法，具有良好的合成效果，显著提高了奥卡西平衍生物的合成效率。
本发明的第二个目的采用以下技术方案实现：一种如上述结构式Ⅰ所示的奥卡西平衍生物的合成方法，反应过程如下式所示：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE002
；
具体的，反应过程包括以下步骤：
（A1）化合物2的合成：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE003
称取2.5g的亚硝基二磺酸钾（弗里米盐（Fremy’s salt，(KSO3)2NO），9.32 mmol）和1.8 g Na2HPO4（12.7 mmol），放入烧杯中，加入95ml双蒸水溶解，调节pH至7.22；称取0.6 g化合物1（12.76 mmol）至60ml丙酮溶液中；将上述两种溶液混合，剧烈搅拌，得到紫色溶液；将上述紫色溶液加入到丙酮溶液中，持续搅拌10分钟，过滤，并置于冰箱中过夜；将过夜的溶液经氩气旋转蒸发仪浓缩，用500ml乙醚进行萃取，萃取完成后，将有机相溶剂蒸发；将蒸发残留物用键合硅胶柱进行快速柱层析纯化，洗脱剂为4∶1比例混合的己烷和氯化四乙铵（TEAC）溶液，最后经乙醚（Et2O）重结晶得到亚胺基苯醌化合物2。
（A2）化合物3的合成：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE004
称取0.15g化合物2（5.8 mmol）溶解于50ml氯仿（CHCl3）中，将其置于分液漏斗中；称取2.5连二亚硫酸钠（Na2S2O4）（14.3 mmol）溶于20ml纯化水中制成溶液；在上述分液漏斗中加入过量的Na2S2O4溶液，轻轻振荡至有机溶液层的颜色由红色变为黄色，并静置分层；将水相用CHCl3进行萃取分离，得到的有机相再用Na2SO4进行吸水干燥，通过旋转蒸馏的方法将溶剂蒸发。经CHCl3萃取后的残留物进行重结晶得到化合物3。
（A3）化合物4的合成：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE005
称取0.14g的化合物3溶解于10 ml CHCl3中，再加入1ml的三乙胺（TEA）配制成溶液；向上述溶液中加入2 g 叔丁基二甲基氯硅烷（TBDMSCl）（15.2 mmol），于室温下搅拌3天，再将溶剂蒸发；加入纯化水溶解，用CHCl3进行萃取分离，得到的有机相用Na2SO4吸水干燥，通过旋转蒸馏的方法将溶剂蒸发，得到粗提化合物4。
（A4）化合物5的合成：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
称取0.16g的化合物4溶解于10 ml的CHCl3中，再加入2 ml腈基四甲基亚砜（TMSOCN）（4.95 mmol），于室温下搅拌2天，将溶剂蒸发；再加入纯化水溶解，用CHCl3萃取，得到的有机相先用盐水进行洗涤，再加入Na2SO4进行干燥，最后通过旋转蒸馏的方法将溶剂蒸发，得到粗提化合物5。
（A5）化合物6的合成：
Figure DEST_PATH_IMAGE007
称取0.16g化合物5和2 g四丁基氟化铵（TBAF）（15.2 mmol）置于烧杯中，加入20ml 四氢呋喃（THF）溶解，于室温下搅拌4小时后，将溶剂蒸发；再加入蒸馏水溶解，用丙烯酸乙酯（EA）萃取分离，得到的有机相用Na2SO4进行干燥，通过旋转蒸馏将溶剂蒸发；粗提物经过色谱柱（洗脱剂：EA/PE（丙烯酸乙酯/聚乙烯）=1:1）纯化后，得到化合物6。
（A6）化合物7的合成：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
称取0.12g的化合物6（4.0 mmol）加入到30 ml的丙烯腈（ACN）中溶解，再加入1.38g K2CO3（10.0 mmol）和1.16g化合物A（5-溴正戊酸甲酯）（6.0 mmol），室温下搅拌过夜；溶液经真空抽滤方法浓缩，再用乙酸乙酯（EtOAc）萃取分离；得到的有机相加入Na2SO4进行干燥，再经抽真空过滤；粗提化合物用硅胶键合柱进行快速层析（洗脱剂：EA/PE（丙烯酸乙酯/聚乙烯）=1:3）纯化后，得到化合物7。
（A7）奥卡西平衍生物的合成：
Figure DEST_PATH_IMAGE009
称取0.1g化合物7（3.0 mmol）溶解于20 ml四氢呋喃（THF）中；再称取0.48 g的含结晶水的氢氧化锂（LiOH·H2O）（11.8mmol）至10ml蒸馏水中溶解；将上述两种溶液混合，于50℃下搅拌6小时后，TLC显示水解作用完成；将该混合溶液浓缩并酸化至水层pH值等于3，经过滤将固液分离；再将白色固体经甲醇（MeOH）重结晶后得到奥卡西平衍生物。
本发明的第三个目的在于提供一种奥卡西平免疫原。
本发明的第三个目的采用以下技术方案实现：一种奥卡西平免疫原，所述奥卡西平免疫原由上述结构式Ⅰ所示的奥卡西平衍生物与载体蛋白连接而成，其结构式如式Ⅱ所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE010
式Ⅱ；
其中，载体蛋白为重组人血清白蛋白，进一步地，所述重组人血清白蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
重组人血清白蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO：1）具体如下：
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRKDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLKQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTKFGDKLCTVATLRETYGEMADKCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEKTFLKKYLYEIARRHPYFYAPELKFFAKRYKAKFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASKAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDKLECADDRADLAKYICENQDSIKSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLKADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMKLYEYARRHPDYSVVLKLRLAKTYKTTLEKCCAAADPHECYAKVFDEKKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALKVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMKCAEDYLSVKLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETKTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMKDFAAFVEKCCKAKDKETCFAEEGKKLVKASRAKLGL
本发明的第四个目的在于提供一种如上所述的奥卡西平免疫原的制备方法。
本发明的第四个目的采用以下技术方案实现：一种如上所述的奥卡西平免疫原的制备方法，包括以下步骤：
（B1）载体蛋白溶液的制备：将上述的重组人血清白蛋白溶解于磷酸盐缓冲液中，得到载体蛋白溶液；
（B2）奥卡西平衍生物溶液的制备：将上述结构式Ⅰ所示的奥卡西平衍生物与二甲基甲酰胺、乙醇、磷酸钾缓冲液、1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解，得到奥卡西平衍生物溶液；
（B3）奥卡西平免疫原的合成：将步骤（B2）得到的奥卡西平衍生物溶液加入到步骤（B1）得到的载体蛋白溶液中，搅拌反应，经透析纯化，得到奥卡西平免疫原。
具体的，所述奥卡西平免疫原的制备方法，包括以下步骤：
（b1）载体蛋白溶液的制备：将重组人血清白蛋白溶解于0.35mol/L的磷酸钾缓冲液（pH=8.5）中，重组人血清白蛋白的终浓度为5.0mg/mL，得到载体蛋白溶液；
（b2）奥卡西平衍生物溶液的制备：将250.0mg上述的奥卡西平衍生物、7.5mL二甲基甲酰胺、7.5mL乙醇、15.0mL的磷酸钾缓冲液（10.0mmol/L，pH=8.0）、150.0mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、90.0mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解反应3小时，得到奥卡西平衍生物溶液；
（b3）奥卡西平免疫原的合成：将步骤（b2）得到的奥卡西平衍生物溶液逐滴加入到步骤（b1）得到的载体蛋白溶液中，并在-4℃下搅拌过夜，经透析纯化，得到奥卡西平免疫原。
本发明的第五个目的在于提供一种抗奥卡西平特异性抗体。
本发明的第五个目的采用以下技术方案实现：一种抗奥卡西平特异性抗体，所述抗奥卡西平特异性抗体为使用上述的奥卡西平免疫原对实验动物进行注射后所得到的特异性抗体，所述的实验动物为兔子、山羊、绵羊、小鼠、大鼠、豚鼠或马中的一种。
本发明的第六个目的在于提供一种如上所述的抗奥卡西平特异性抗体的制备方法。
本发明的第六个目的采用以下技术方案实现：一种如上所述的抗奥卡西平特异性抗体的制备方法，包含以下步骤：
（C1）将上述的奥卡西平免疫原用磷酸盐缓冲液稀释，得到奥卡西平人工抗原溶液，然后将奥卡西平人工抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对上述的实验动物进行多点注射；
（C2）3-6周后，再用相同的奥卡西平人工抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物进行多点注射，之后每隔3-6周注射一次，共计注射3-10次；
（C3）对步骤（C2）中完成注射的实验动物取血，分离纯化，得到抗奥卡西平特异性抗体。
具体的，所述抗奥卡西平特异性抗体的制备方法，包含以下步骤：
（c1）将上述的奥卡西平免疫原用0.15mol/L磷酸钠缓冲液（pH=7.0）稀释至终浓度为3.5mg/mL，得到人工抗原溶液，然后将3.0mL人工抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物兔子进行多点注射；
（c2）4周后，再用3.0mL相同的人工抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂对上述实验动物兔子进行多点注射，之后每隔5周注射一次，共计注射6次；
（c3）对步骤（c2）完成注射的实验动物兔子取血，分离纯化，得到抗奥卡西平特异性抗体。
本发明的第七个目的在于提供一种如上所述的抗奥卡西平特异性抗体的应用。
本发明的第七个目的采用以下技术方案实现：一种如上所述的抗奥卡西平特异性抗体的应用，将所述抗奥卡西平特异性抗体用于制备奥卡西平检测试剂，所述奥卡西平检测试剂包括奥卡西平均相酶免疫检测试剂与奥卡西平胶乳增强免疫比浊检测试剂。
优选地，上述的抗奥卡西平特异性抗体的应用，所述奥卡西平均相酶免疫检测试剂，由R1试剂与R2试剂组成，所述R1试剂包含上述的抗奥卡西平特异性抗体与R1缓冲液，所述R2试剂包含奥卡西平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物与R2缓冲液；
所述的R1缓冲液含有酶底物、辅酶、牛血清白蛋白及Tris缓冲液，所述的酶底物为葡萄糖-6-磷酸，所述的辅酶为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；
所述的奥卡西平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物由上述结构式Ⅰ所示的奥卡西平衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联而成；其结构式如式Ⅲ所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE011
式Ⅲ；
所述的R2缓冲液为含有牛血清白蛋白的Tris缓冲液。
具体的，所述奥卡西平均相酶免疫检测试剂的制备方法，包含以下步骤：
（D1）将250.0mg牛血清白蛋白、250.0mg葡萄糖-6-磷酸及50.0mg氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依次加入250mL Tris缓冲液（50mmol/L，pH=8.5）中搅拌溶解制成R1缓冲液，再将抗奥卡西平特异性抗体以1∶1000的体积比加入到上述R1缓冲液中混匀，再用1.0 mol/L的盐酸调节pH至7.6，制成R1试剂；
（D2）将250.0mg牛血清白蛋白加入250mL Tris缓冲液（100mmol/L，pH=8.7）中搅拌溶解制成R2缓冲液，再将奥卡西平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物以1∶1000的体积比加入到上述R2缓冲液中混匀，再用1.0 mol/L的盐酸调节pH至8.0，制成R2试剂。
所述的奥卡西平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物的制备方法，包含以下步骤：
（E1）称取20.0 mg活力单位为200KU的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，在室温条件下溶解于50.0mL磷酸钠（100mmol/L，pH=8.0）缓冲液中，然后加入150.0 mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、75.0 mg葡萄糖-6-磷酸以及0.75 mL卡必醇，再逐滴加入2.5 mL二甲基亚砜，搅拌溶解，得到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液；
（E2）在无水状态下称取15.0 mg上述结构式Ⅰ所示的奥卡西平衍生物，溶解于500.0 µL二甲基甲酰胺中，将上述溶液温度降到0℃后加入4.5 µL三丁胺、2.5 µL氯甲酸异丁酯、3.5 µL N，N′-二环己基碳二亚胺，0℃下搅拌45分钟，得到奥卡西平衍生物激活液；
（E3）将奥卡西平衍生物激活液逐滴加入到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中，-4℃搅拌反应12小时，反应结束后经G-25凝胶层析柱纯化得到奥卡西平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物。
优选地，上述的抗奥卡西平特异性抗体的应用，所述奥卡西平胶乳增强免疫比浊检测试剂，由L1试剂与L2试剂组成；
所述L1试剂由上述的抗奥卡西平特异性抗体、pH=8.0的缓冲液、牛血清白蛋白、氯化钠、吐温-20、丙三醇、乙二胺四乙酸、促凝剂以及防腐剂组成；
所述L2试剂由奥卡西平-牛血清白蛋白复合体包被的聚苯乙烯胶乳颗粒、pH=8.0的缓冲液、牛血清白蛋白、氯化钠、吐温-20、丙三醇、乙二胺四乙酸以及防腐剂组成；
所述的奥卡西平-牛血清白蛋白复合体由上述结构式Ⅰ所示的奥卡西平衍生物与牛血清白蛋白偶联而成，其结构式如式Ⅳ所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE012
式Ⅳ；
所述的聚苯乙烯胶乳颗粒直径范围为50-250nm；
所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或巴比妥缓冲液中的一种；
所述促凝剂为PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000或硫酸葡聚糖钠中的一种；
所述防腐剂为叠氮钠、硫柳汞、苯酚或乙基汞硫代硫酸钠中的一种。
具体的，所述奥卡西平胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备方法，包含以下步骤：
（F1）将5.0mL的抗奥卡西平特异性抗体溶解于250.0mL磷酸钾缓冲液（50.0 mmol/L pH=8.0）中，然后添加100.0mg牛血清白蛋白、25.0mg氯化钠、250.0μL吐温-20、250.0μL丙三醇、100.0μL的乙二胺四乙酸、150.0μL的PEG-4000以及5.0mg叠氮钠，搅拌均匀，调节pH=7.3，制成L1试剂；
（F2）将1.5mg表面带有羧基的直径为125nm的聚苯乙烯胶乳颗粒加入15.0mL的MES缓冲液（50.0mmol/L，pH=7.0）中，然后加入5.0mg碳二亚胺，在25℃下反应3小时，制成胶乳颗粒溶液，再将1.2mg奥卡西平-牛血清白蛋白复合体用7.5mL的硼酸盐缓冲液（50.0mmol/L，pH=9.2）稀释后，立即加入到上述胶乳颗粒溶液中，在41℃下反应18小时，然后加入3.0mL的甘氨酸缓冲液（100.0mmol/L，pH=8.0）搅拌3小时，反应终止后离心去除上清液，再将沉淀物用20.0mL的Tris-HCl缓冲液（50.0mmol/L，pH=8.0）洗涤3次，再用50.0mL的甘氨酸缓冲液（50.0mmol/L，pH=8.6）稀释成胶乳悬浊液，最后加入质量分数为100.0mg牛血清白蛋白、25.0mg氯化钠、250.0μL吐温-20、250.0μL丙三醇、100.0μL的乙二胺四乙酸以及5.0mg叠氮钠，搅拌均匀，制成L2试剂。
所述的奥卡西平-牛血清白蛋白复合体的制备方法，包含以下步骤：
将10.0mg牛血清白蛋白用7.5mL的磷酸钠缓冲液（100.0mmol/L，pH=7.5）稀释，然后加入100.0mg上述结构式Ⅰ所示的奥卡西平衍生物，再加入50.0mg的1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺，在0℃下反应10 小时，再用100.0mL磷酸盐缓冲液（100.0mmol/L，pH=7.5）在-4℃下透析12小时，得到奥卡西平-牛血清白蛋白复合体。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明设计的奥卡西平衍生物及其合成方法均为针对性的新设计与研究，在现有技术中并不存在。
2、本发明使用经过基因工程改造得到的重组人血清白蛋白与奥卡西平衍生物偶联得到奥卡西平免疫原，偶联效率高，显著提高奥卡西平免疫原的免疫原性。使用本发明的奥卡西平免疫原制备得到的抗奥卡西平特异性抗体的特异性强、灵敏度高，并且与100种常见药物无任何交叉反应，因此能够用于制备具有较高的准确性、精密度、灵敏度和特异性的奥卡西平检测试剂。
3、本发明的两种奥卡西平检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对奥卡西平高通量、快速化的检测，能同时测定多个样品，具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低奥卡西平检测成本，有利于临床推广使用。
附图说明
图1为实施例4 奥卡西平的ELISA检测标准曲线；
图2为实施例8奥卡西平均相酶免疫检测试剂校准曲线；
图3为实施例10奥卡西平胶乳增强免疫比浊检测试剂校准曲线。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。除非特别指明，以下实施例中所用的试剂、仪器、设备、耗材均可从正规渠道商购买获得。
实施例1：奥卡西平衍生物的合成
通过以下合成路线合成奥卡西平衍生物：
Figure DEST_PATH_IMAGE013
具体的合成步骤如下：
（1）化合物2的合成：
Figure 735516DEST_PATH_IMAGE003
称取2.5g的亚硝基二磺酸钾（弗里米盐（Fremy’s salt，(KSO3)2NO），9.32 mmol）和1.8 g Na2HPO4（12.7 mmol），放入烧杯中，加入95ml双蒸水溶解，调节pH至7.22；称取0.6 g化合物1（12.76 mmol）至60ml丙酮溶液中；将上述两种溶液混合，剧烈搅拌，得到紫色溶液；将上述紫色溶液加入到丙酮溶液中，持续搅拌10分钟，过滤，并置于冰箱中过夜；将过夜的溶液经氩气旋转蒸发仪浓缩，用500ml乙醚进行萃取，萃取完成后，将有机相溶剂蒸发；将蒸发残留物用键合硅胶柱进行快速柱层析纯化，洗脱剂为4∶1比例混合的己烷和氯化四乙铵（TEAC）溶液，最后经乙醚（Et2O）重结晶得到的深红色晶体粉末状物质为亚胺基苯醌化合物2（0.15g，25%）。
（2）化合物3的合成：
Figure 590339DEST_PATH_IMAGE004
称取0.15g化合物2（5.8 mmol）溶解于50ml氯仿（CHCl3）中，将其置于分液漏斗中；称取2.5连二亚硫酸钠（Na2S2O4）（14.3 mmol）溶于20ml纯化水中制成溶液；在上述分液漏斗中加入过量的Na2S2O4溶液，轻轻振荡至有机溶液层的颜色由红色变为黄色，并静置分层；将水相用CHCl3进行萃取分离，得到的有机相再用Na2SO4进行吸水干燥，通过旋转蒸馏的方法将溶剂蒸发。经CHCl3萃取后的残留物进行重结晶得到的淡黄绿色晶体为化合物3（0.14g，92%）。
（3）化合物4的合成：
Figure 996175DEST_PATH_IMAGE005
称取0.14g的化合物3溶解于10 ml CHCl3中，再加入1ml的三乙胺（TEA）配制成溶液；向上述溶液中加入2 g 叔丁基二甲基氯硅烷（TBDMSCl）（15.2 mmol），于室温下搅拌3天，再将溶剂蒸发；加入纯化水溶解，用CHCl3进行萃取分离，得到的有机相用Na2SO4吸水干燥，通过旋转蒸馏的方法将溶剂蒸发，得到0.16g的粗提化合物4。
（4）化合物5的合成：
Figure 516018DEST_PATH_IMAGE006
称取0.16g的化合物4溶解于10 ml的CHCl3中，再加入2 ml腈基四甲基亚砜（TMSOCN）（4.95 mmol），于室温下搅拌2天，将溶剂蒸发；再加入纯化水溶解，用CHCl3萃取，得到的有机相先用盐水进行洗涤，再加入Na2SO4进行干燥，最后通过旋转蒸馏的方法将溶剂蒸发，得到0.16g黄色的粗提化合物5。
（5）化合物6的合成：
Figure 12947DEST_PATH_IMAGE007
称取0.16g化合物5和2 g四丁基氟化铵（TBAF）（15.2 mmol）置于烧杯中，加入20ml 四氢呋喃（THF）溶解，于室温下搅拌4小时后，将溶剂蒸发；再加入蒸馏水溶解，用丙烯酸乙酯（EA）萃取分离，得到的有机相用Na2SO4进行干燥，通过旋转蒸馏将溶剂蒸发；粗提物经过色谱柱（洗脱剂：EA/PE（丙烯酸乙酯/聚乙烯）=1:1）纯化后，得到0.12g的化合物6（从化合物3到化合物6的产率为86%）。
（6）化合物7的合成：
Figure 960043DEST_PATH_IMAGE008
称取0.12g的化合物6（4.0 mmol）加入到30 ml的丙烯腈（ACN）中溶解，再加入1.38g K2CO3（10.0 mmol）和1.16g化合物A（5-溴正戊酸甲酯）（6.0 mmol），室温下搅拌过夜；溶液经真空抽滤方法浓缩，再用乙酸乙酯（EtOAc）萃取分离；得到的有机相加入Na2SO4进行干燥，再经抽真空过滤；粗提化合物用硅胶键合柱进行快速层析（洗脱剂：EA/PE（丙烯酸乙酯/聚乙烯）=1:3）纯化后，得到0.1g白色固体化合物7，产率为83%。
（7）奥卡西平衍生物的合成：
Figure 164759DEST_PATH_IMAGE009
称取0.1g化合物7（3.0 mmol）溶解于20 ml四氢呋喃（THF）中；再称取0.48 g的含结晶水的氢氧化锂（LiOH·H2O）（11.8mmol）至10ml蒸馏水中溶解；将上述两种溶液混合，于50℃下搅拌6小时后，TLC显示水解作用完成；将该混合溶液浓缩并酸化至水层pH值等于3，经过滤将固液分离；再将白色固体经甲醇（MeOH）重结晶后得到52 mg奥卡西平衍生物，产率为52%。
实施例2：奥卡西平免疫原的制备
奥卡西平免疫原的制备方法具体步骤如下：
（1）载体蛋白溶液的制备：将重组人血清白蛋白溶解于0.35mol/L的磷酸钾缓冲液（pH=8.5）中，重组人血清白蛋白的终浓度为5.0mg/mL，得到载体蛋白溶液；
（2）奥卡西平衍生物溶液的制备：将250.0mg上述的奥卡西平衍生物、7.5mL二甲基甲酰胺、7.5mL乙醇、15.0mL的磷酸钾缓冲液（10.0mmol/L，pH=8.0）、150.0mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、90.0mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解反应3小时，得到奥卡西平衍生物溶液；
（3）奥卡西平免疫原的合成：将步骤（2）得到的奥卡西平衍生物溶液逐滴加入到步骤（1）得到的载体蛋白溶液中，并在-4℃下搅拌过夜，经透析纯化，得到奥卡西平免疫原。
实施例3：抗奥卡西平特异性抗体的制备
抗奥卡西平特异性抗体的制备方法具体步骤如下：
（1）将上述的奥卡西平免疫原用0.15mol/L磷酸钠缓冲液（pH=7.0）稀释至终浓度为3.5mg/mL，得到人工抗原溶液，然后将3.0mL人工抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物兔子进行多点注射；
（2）4周后，再用3.0mL相同的人工抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂对上述实验动物兔子进行多点注射，之后每隔5周注射一次，共计注射6次；
（3）对步骤（2）完成注射的实验动物兔子取血，分离纯化，得到抗奥卡西平特异性抗体。
实施例4：ELISA法检验抗奥卡西平特异性抗体的性能
1.奥卡西平的ELISA检测标准曲线的建立：
（1）标准品的制备：
将奥卡西平纯品粉末(购于Sigma公司) 溶解于甲醇溶液，制备成1mg/mL的储存液。用ELISA缓冲液将储存液依次稀释为50.00μg/mL、25.00μg/mL、12.50μg/mL、6.25μg/mL、3.13μg/mL、0.00μg/mL的标准溶液。其中，ELISA缓冲液由50.0mmol/L的Tris缓冲液，质量分数为1.5%的NaCl以及体积分数为0.25％的BSA配制而成。
（2）利用奥卡西平的ELISA检验方法制备标准曲线：
用磷酸钾缓冲液（50.0mmol/L，pH=8.0）将实施例3中所制备的抗奥卡西平特异性抗体稀释成1 : 10000的终浓度溶液，100μL/孔包被在96孔酶联板上，4℃放置18小时；用磷酸钾缓冲液将包被有抗奥卡西平特异性抗体的96孔酶联板洗涤3次后，加入200μL/孔的体积分数0.5％的BSA溶液，4℃下放置12小时。然后用磷酸钾缓冲液洗涤3次，加入20μL/孔的标准溶液。再加入100μL/孔工作浓度的HRP-奥卡西平偶联物；室温下孵育30min后磷酸钾缓冲液洗板5次；然后每孔加入100μL的TMB 底物，室温孵育30min。再每孔加入100μL的终止液（2.0mol/L的硫酸）。使用酶标仪测定450nm的吸光值。根据各标准溶液所对应的450nm的吸光值定标，制作标准曲线，结果如图1所示。
2.待测样品中奥卡西平含量的检测：
（1）制作待测样品：
制备方法：将奥卡西平纯品粉末(购于Sigma公司) 溶解于甲醇溶液制成1.0mg/mL的储存液，并将此储存液稀释于空白血清中，至终浓度分别为0.00μg/mL、10.00μg/mL、20.00μg/mL、40.00μg/mL，分别形成空白、低、中、高浓度的血清样本。所述空白血清为不含奥卡西平的健康人血清。
（2）测试方法：
利用上述奥卡西平的ELISA检验方法，将上述空白、低、中、高浓度的血清样本代替标准溶液，测试上述空白、低、中、高浓度的血清样本在450nm的吸光值。
（3）测试结果：
对照图1中所示的奥卡西平的ELISA检验的标准曲线，计算每个样本中奥卡西平含量，并对每个样本进行3个复孔测定，根据上述样本中奥卡西平的实际含量计算回收率，结果如表1所示。
表1 奥卡西平的ELISA检测结果
血清样本 空白 低值 中值 高值
样本浓度(μg/mL) 0.00 10.00 20.00 40.00
测定1 0.00 10.23 20.92 41.00
测定2 0.00 10.07 19.26 39.79
测定3 0.00 10.30 21.04 40.25
平均值(μg/mL) 0.00 10.20 20.41 40.35
回收率(％) - 102.0 102.0 100.9
由表1中结果可知：使用本发明奥卡西平特异性抗体的ELISA检测方法测定不同浓度样本中的奥卡西平回收率都较高，均在97%-103%之间，说明本发明所述的抗奥卡西平特异性抗体可以用于样本中奥卡西平的检测，并且灵敏度高，检测结果准确度高。
实施例5：100种常见药物干扰试验
选取100种常见药物作为干扰物进行干扰试验，将100种常见药物纯品粉末配制成浓度为100.0μg/mL的溶液作为待测干扰物样本，采用实施例4的ELISA检验方法对相应干扰物的浓度进行检测，100种常见药物名称以及检测结果详见表2。
表2 常见药物干扰试验检测结果
序号 化合物名称 实际检测值 (μg/mL) 序号 化合物名称 实际检测值 (μg/mL)
1 阿司匹林 0.00 2 苯丙醇胺 0.00
3 β-苯基乙胺 0.00 4 普鲁卡因酰胺 0.00
5 安非他命 0.00 6 普鲁卡因 0.00
7 氨苄青霉素 0.00 8 奎尼丁 0.00
9 甲氨二氮卓 0.00 10 佐美酸 0.00
11 氯丙嗪 0.00 12 苯肾上腺素 0.00
13 氯拉卓酸 0.00 14 桂皮酰艾克宁 0.00
15 二甲苯氧庚酸 0.00 16 芽子碱 0.00
17 非诺洛芬 0.00 18 地西洋 0.00
19 甲基苯丙胺 0.00 20 可替宁 0.00
21 龙胆酸 0.00 22 阿替洛尔 0.00
23 吉非贝齐 0.00 24 心得安 0.00
25 氢可酮 0.00 26 苯乙哌啶酮 0.00
27 布洛芬 0.00 28 苯基丁氮酮 0.00
29 丙咪嗪 0.00 30 麦角酸二乙基酰胺 0.00
31 二氨基二苯砜 0.00 32 大麻酚 0.00
33 萘普生 0.00 34 洛哌丁胺 0.00
35 氢氯噻嗪 0.00 36 异克舒令 0.00
37 哌替啶 0.00 38 苯基丙氨酸 0.00
39 烯丙羟吗啡酮 0.00 40 盐酸氟西汀 0.00
41 麻黄素 0.00 42 柳丁氨醇 0.00
43 烟酰胺 0.00 44 青霉素 0.00
45 甲胺呋硫 0.00 46 甲基二乙醇胺 0.00
47 异戊巴比妥 0.00 48 二亚甲基双氧苯丙胺 0.00
49 甲撑二氧苯丙胺 0.00 50 琥珀酸多西拉敏 0.00
51 四氢大麻酚 0.00 52 纳布啡 0.00
53 制霉菌素 0.00 54 去甲吗啡 0.00
55 乙酰吗啡 0.00 56 羟考酮 0.00
57 苄非他明 0.00 58 克他命 0.00
59 异丙嗪 0.00 60 苯海拉明 0.00
61 阿司帕坦 0.00 62 苯丁胺 0.00
63 阿立哌唑 0.00 64 氟康唑 0.00
65 氯氮平 0.00 66 呋塞米 0.00
67 艾司西酞普兰 0.00 68 加巴喷丁 0.00
69 伊马替尼 0.00 70 华法林 0.00
71 拉莫三嗪 0.00 72 瑞舒伐他汀 0.00
73 利奈唑胺 0.00 74 对乙酰氨基酚 0.00
75 利培酮 0.00 76 舒必利 0.00
77 舍曲林 0.00 78 氟伏沙明 0.00
79 托吡酯 0.00 80 氟西汀 0.00
81 文拉法辛 0.00 82 齐拉西酮 0.00
83 伏立康唑 0.00 84 氟哌啶醇 0.00
85 左乙拉西坦 0.00 86 亚胺培南 0.00
87 奥氮平 0.00 88 阿昔替尼 0.00
89 唑尼沙胺 0.00 90 培唑帕尼 0.00
91 阿米替林 0.00 92 瑞戈非尼 0.00
93 氯丙嗪 0.00 94 异烟肼 0.00
95 多虑平 0.00 96 利福平 0.00
97 帕罗西汀 0.00 98 左氧氟沙星 0.00
99 氯霉素 0.00 100 莫西沙星 0.00
测定结果显示：采用实施例4的ELISA检验方法对相应干扰物的浓度进行检测，上述100种常见药物实际检测值均为0.00μg/mL。由此可见，本发明的抗奥卡西平特异性抗体具有较强的抗原识别特异性，与100种常见药物无任何交叉反应。
实施例6：奥卡西平均相酶免疫检测试剂的制备
奥卡西平均相酶免疫检测试剂的制备方法，具体步骤如下：
（1）将250.0mg牛血清白蛋白、250.0mg葡萄糖-6-磷酸及50.0mg氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依次加入250mL Tris缓冲液（50mmol/L，pH=8.5）中搅拌溶解制成R1缓冲液，再将抗奥卡西平特异性抗体以1∶1000的体积比加入到上述R1缓冲液中混匀，再用1.0 mol/L的盐酸调节pH至7.6，制成R1试剂；
（2）将250.0mg牛血清白蛋白加入250mL Tris缓冲液（100mmol/L，pH=8.7）中搅拌溶解制成R2缓冲液，再将奥卡西平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物以1∶1000的体积比加入到上述R2缓冲液中混匀，再用1.0 mol/L的盐酸调节pH至8.0，制成R2试剂。
所述的奥卡西平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物的制备方法，包含以下步骤：
（1）称取20.0 mg活力单位为200KU的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，在室温条件下溶解于50.0mL磷酸钠（100mmol/L，pH=8.0）缓冲液中，然后加入150.0 mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、75.0 mg葡萄糖-6-磷酸以及0.75 mL卡必醇，再逐滴加入2.5 mL二甲基亚砜，搅拌溶解，得到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液；
（2）在无水状态下称取15.0 mg实施例1合成的奥卡西平衍生物，溶解于500.0 µL二甲基甲酰胺中，将上述溶液温度降到0℃后加入4.5 µL三丁胺、2.5 µL氯甲酸异丁酯、3.5µL N，N′-二环己基碳二亚胺，0℃下搅拌45分钟，得到奥卡西平衍生物激活液；
（3）将奥卡西平衍生物激活液逐滴加入到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中，-4℃搅拌反应12小时，反应结束后经G-25凝胶层析柱纯化得到奥卡西平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物。
实施例7：奥卡西平校准品、质控品的制备
（1）校准品的制备：将奥卡西平纯品粉末分别加入6份浓度为50.0mmol/L pH=7.2的Tris-HCl缓冲液中，搅拌溶解，至终浓度分别为0.00μg/mL、3.13μg/mL、6.25μg/mL、12.50μg/mL、25.00μg/mL、50.00μg/mL，然后在每份溶液中分别加入质量分数为0.5%的氯化钠、1.0%的牛血清白蛋白、0.75%的乙二胺四乙酸、0.05%的叠氮钠，搅拌均匀，即为奥卡西平校准品（6个浓度）。
（2）质控品的制备：将奥卡西平纯品粉末分别加入3份浓度为50.0mmol/L pH=7.2的Tris-HCl缓冲液中，搅拌溶解，至终浓度分别为10.00μg/mL、20.00μg/mL、40.00μg/mL，然后在每份溶液中分别加入质量分数为0.5%的氯化钠、1.0%的牛血清白蛋白、0.75%的乙二胺四乙酸、0.05%的叠氮钠，搅拌均匀，即为奥卡西平质控品（3个浓度）。
实施例8：奥卡西平均相酶免疫检测试剂校准曲线制作及质控实验
1. 制作奥卡西平均相酶免疫检测校准曲线：
在迈瑞 BS480全自动生化分析仪中放入R1试剂、R2试剂及校准品，然后对生化分析仪进行反应参数设置，具体参数详见表3；实际操作过程中需不断调整R1试剂和R2试剂的体积比例，同时调整测光点，最后由生化分析仪自动得出均相酶免疫检测校准曲线，如图2所示。
表3 迈瑞 BS480全自动生化分析仪反应参数设置
项目名称 奥卡西平
R1试剂 160.0µL
R2试剂 40.0µL
样本量 3.0µL
定标方法 两点终点法
主波长 340nm
次波长 405nm
反应时间 10分钟
温育时间 8分钟
反应方向 上升
结果 μg/mL
结果精度 0.01
拟合方法 Line graph
校准品浓度 0.00μg/mL、3.13μg/mL、6.25μg/mL、12.50μg/mL、25.00μg/mL、50.00μg/mL
2. 质控品检测实验：
利用上述的奥卡西平均相酶免疫检测方法，对质控品进行测定，并根据步骤1中制作的均相酶免疫检测校准曲线，计算每个质控品中奥卡西平的含量，每个质控品重复测定5次，检测结果及数据分析详见表4。
表4 奥卡西平均相酶免疫检验试剂检测结果及数据分析
质控品 低值 中值 高值
浓度 (μg/mL) 10.00 20.00 40.00
测试1 9.99 21.06 41.49
测试2 9.69 19.88 40.81
测试3 9.89 19.94 41.63
测试4 10.20 20.66 40.70
测试5 10.23 19.88 41.30
平均值(μg/mL) 10.00 20.28 41.19
标准差（SD） 0.22 0.55 0.41
精密度（CV%） 2.24 2.69 1.00
回收率（%） 100 101.42 102.97
实验结果表明：测定不同浓度质控品中奥卡西平含量的CV值均低于5%，回收率均在95%-105%之间，说明本发明的奥卡西平均相酶免疫检测试剂测定生物样本中奥卡西平含量的精密度较高，结果准确。
实施例9：奥卡西平胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备
奥卡西平胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备方法，包含以下步骤：
（F1）将5.0mL的抗奥卡西平特异性抗体溶解于250.0mL磷酸钾缓冲液（50.0 mmol/L pH=8.0）中，然后添加100.0mg牛血清白蛋白、25.0mg氯化钠、250.0μL吐温-20、250.0μL丙三醇、100.0μL的乙二胺四乙酸、150.0μL的PEG-4000以及5.0mg叠氮钠，搅拌均匀，调节pH=7.3，制成L1试剂；
（F2）将1.5mg表面带有羧基的直径为125nm的聚苯乙烯胶乳颗粒加入15.0mL的MES缓冲液（50.0mmol/L，pH=7.0）中，然后加入5.0mg碳二亚胺，在25℃下反应3小时，制成胶乳颗粒溶液，再将1.2mg奥卡西平-牛血清白蛋白复合体用7.5mL的硼酸盐缓冲液（50.0mmol/L，pH=9.2）稀释后，立即加入到上述胶乳颗粒溶液中，在41℃下反应18小时，然后加入3.0mL的甘氨酸缓冲液（100.0mmol/L，pH=8.0）搅拌3小时，反应终止后离心去除上清液，再将沉淀物用20.0mL的Tris-HCl缓冲液（50.0mmol/L，pH=8.0）洗涤3次，再用50.0mL的甘氨酸缓冲液（50.0mmol/L，pH=8.6）稀释成胶乳悬浊液，最后加入质量分数为100.0mg牛血清白蛋白、25.0mg氯化钠、250.0μL吐温-20、250.0μL丙三醇、100.0μL的乙二胺四乙酸以及5.0mg叠氮钠，搅拌均匀，制成L2试剂。
所述的奥卡西平-牛血清白蛋白复合体的制备方法，包含以下步骤：
将10.0mg牛血清白蛋白用7.5mL的磷酸钠缓冲液（100.0mmol/L，pH=7.5）稀释，然后加入100.0mg实施例1合成的奥卡西平衍生物，再加入50.0mg的1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺，在0℃下反应10 小时，再用100.0mL磷酸盐缓冲液（100.0mmol/L，pH=7.5）在-4℃下透析12小时，得到奥卡西平-牛血清白蛋白复合体。
实施例10：奥卡西平胶乳增强免疫比浊检测试剂校准曲线制作及质控实验
1. 制作奥卡西平胶乳增强免疫比浊检测试剂校准曲线：
在奥林巴斯AU480全自动生化分析仪中放入L1试剂、L2试剂及校准品，然后对生化分析仪进行反应参数设置，具体参数详见表5；实际操作过程中需不断调整L1试剂和L2试剂的体积比例，同时调整测光点，最后由生化分析仪自动得出胶乳增强免疫比浊检测校准曲线，如图3所示。
表5 奥林巴斯AU480全自动生化分析仪反应参数
项目名称 奥卡西平
L1试剂 160.0µL
L2试剂 40.0µL
样本量 5.0µL
定标方法 两点终点法
主波长 570nm
次波长 412nm
反应时间 10分钟
温育时间 5分钟
反应方向 下降
结果 μg/mL
结果精度 0.01
拟合方法 Logit-log 4P
校准品浓度 0.00μg/mL、3.13μg/mL、6.25μg/mL、12.50μg/mL、25.00μg/mL、50.00μg/mL
2. 质控品检测实验：
利用上述的胶乳增强免疫比浊检测方法，对质控品进行测定，并根据步骤1中制作的胶乳增强免疫比浊检测校准曲线，计算每个质控品中奥卡西平的含量，每个质控品重复测定10次，检测结果及数据分析详见表6。
表6 奥卡西平胶乳增强免疫比浊试剂检测结果及数据分析
质控品 低值 中值 高值
浓度 (μg/mL) 10.00 20.00 40.00
测试1 10.21 20.76 40.30
测试2 9.78 21.08 41.80
测试3 10.13 20.51 40.76
测试4 10.22 19.85 39.54
测试5 9.93 20.18 41.79
平均值(μg/mL) 10.05 20.48 40.84
标准差（SD） 0.19 0.48 0.98
精密度（CV%） 1.91 2.35 2.39
回收率（%） 100.54 102.38 102.09
实验结果表明：测定不同浓度质控品中奥卡西平含量的CV值均低于5%，回收率均在95%-105%之间，说明本发明的奥卡西平胶乳增强免疫比浊检测试剂测定生物样本中奥卡西平含量的精密度较高，结果准确。
对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思做出其它各种相应的变更以及修改，而所有的这些变更以及修改都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 苏州博源医疗科技有限公司
<120> 一种奥卡西平衍生物、免疫原、抗奥卡西平特异性抗体及其制备方法与应用
<130> 2020.12.13
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 609
<212> PRT
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Lys Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala
20 25 30
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu
35 40 45
Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Lys Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val
50 55 60
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
65 70 75 80
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Lys Phe Gly Asp
85 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala
100 105 110
Asp Lys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln
115 120 125
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val
130 135 140
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Lys Thr Phe Leu Lys
145 150 155 160
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
165 170 175
Glu Leu Lys Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Lys Phe Thr Glu Cys
180 185 190
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Lys Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys
210 215 220
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val
225 230 235 240
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser
245 250 255
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly
260 265 270
Asp Lys Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile
275 280 285
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Lys Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu
290 295 300
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp
305 310 315 320
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Lys Ala Asp Phe Val Glu Ser
325 330 335
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly
340 345 350
Met Lys Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val
355 360 365
Leu Lys Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Lys Thr Thr Leu Glu Lys Cys
370 375 380
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu
385 390 395 400
Lys Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys
405 410 415
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Lys
420 425 430
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
435 440 445
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His
450 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg Met Lys Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Lys
465 470 475 480
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg
485 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe
500 505 510
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala
515 520 525
Glu Thr Lys Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu
530 535 540
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys
545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Lys Asp Phe Ala
565 570 575
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Lys Asp Lys Glu Thr Cys Phe
580 585 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Lys Ala Ser Arg Ala Lys Leu Gly
595 600 605
Leu

Claims (10)

1.一种奥卡西平衍生物，其特征在于，其结构式如式Ⅰ所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
式Ⅰ。
2.一种如权利要求1所述的奥卡西平衍生物的合成方法，其特征在于，所述合成方法的反应过程如下式所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
3.一种奥卡西平免疫原，其特征在于，所述奥卡西平免疫原由权利要求1所述的奥卡西平衍生物与载体蛋白连接而成，其结构式如式Ⅱ所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
式Ⅱ；
其中，载体蛋白为重组人血清白蛋白。
4. 根据权利要求3所述的奥卡西平免疫原，其特征在于，所述重组人血清白蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
5.一种如权利要求3-4任一项所述的奥卡西平免疫原的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（B1）载体蛋白溶液的制备：将权利要求3-4任一项中所述的重组人血清白蛋白溶解于磷酸盐缓冲液中，得到载体蛋白溶液；
（B2）奥卡西平衍生物溶液的制备：将权利要求1所述的奥卡西平衍生物与二甲基甲酰胺、乙醇、磷酸钾缓冲液、1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解，得到奥卡西平衍生物溶液；
（B3）奥卡西平免疫原的合成：将步骤（B2）得到的奥卡西平衍生物溶液加入到步骤（B1）得到的载体蛋白溶液中，搅拌反应，经透析纯化，得到奥卡西平免疫原。
6.一种抗奥卡西平特异性抗体，其特征在于，所述抗奥卡西平特异性抗体为使用权利要求3-4任一项所述的奥卡西平免疫原对实验动物进行注射后所得到的特异性抗体，所述的实验动物为兔子、山羊、绵羊、小鼠、大鼠、豚鼠或马中的一种。
7.一种如权利要求6所述的抗奥卡西平特异性抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包含以下步骤：
（C1）将权利要求3-4任一项所述的奥卡西平免疫原用磷酸盐缓冲液稀释，得到奥卡西平人工抗原溶液，然后将奥卡西平人工抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对权利要求6中所述的实验动物进行多点注射；
（C2）3-6周后，再用相同的奥卡西平人工抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物进行多点注射，之后每隔3-6周注射一次，共计注射3-10次；
（C3）对步骤（C2）中完成注射的实验动物取血，分离纯化，得到抗奥卡西平特异性抗体。
8.如权利要求6-7任一项所述的抗奥卡西平特异性抗体的应用，其特征在于，将所述抗奥卡西平特异性抗体用于制备奥卡西平检测试剂，所述奥卡西平检测试剂包括奥卡西平均相酶免疫检测试剂与奥卡西平胶乳增强免疫比浊检测试剂。
9.根据权利要求8所述的抗奥卡西平特异性抗体的应用，其特征在于，所述奥卡西平均相酶免疫检测试剂，由R1试剂与R2试剂组成，所述R1试剂包含权利要求6-7任一项所述的抗奥卡西平特异性抗体与R1缓冲液，所述R2试剂包含奥卡西平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物与R2缓冲液；
所述的R1缓冲液含有酶底物、辅酶、牛血清白蛋白及Tris缓冲液，所述的酶底物为葡萄糖-6-磷酸，所述的辅酶为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；
所述的奥卡西平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物由权利要求1所述的奥卡西平衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联而成；其结构式如式Ⅲ所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
式Ⅲ；
所述的R2缓冲液为含有牛血清白蛋白的Tris缓冲液。
10.根据权利要求8所述的抗奥卡西平特异性抗体的应用，其特征在于，所述奥卡西平胶乳增强免疫比浊检测试剂，由L1试剂与L2试剂组成；
所述L1试剂由权利要求6-7任一项所述的抗奥卡西平特异性抗体、pH=8.0的缓冲液、牛血清白蛋白、氯化钠、吐温-20、丙三醇、乙二胺四乙酸、促凝剂以及防腐剂组成；
所述L2试剂由奥卡西平-牛血清白蛋白复合体包被的聚苯乙烯胶乳颗粒、pH=8.0的缓冲液、牛血清白蛋白、氯化钠、吐温-20、丙三醇、乙二胺四乙酸以及防腐剂组成；
所述的奥卡西平-牛血清白蛋白复合体由权利要求1所述的奥卡西平衍生物与牛血清白蛋白偶联而成，其结构式如式Ⅳ所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
式Ⅳ；
所述的聚苯乙烯胶乳颗粒直径范围为50-250nm；
所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或巴比妥缓冲液中的一种；
所述促凝剂为PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000或硫酸葡聚糖钠中的一种；
所述防腐剂为叠氮钠、硫柳汞、苯酚或乙基汞硫代硫酸钠中的一种。
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