CN118033104A - 一种香草扁桃酸胶乳增强免疫比浊检测试剂及其制备方法 - Google Patents
一种香草扁桃酸胶乳增强免疫比浊检测试剂及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明使用表面带有氨基修饰的聚苯乙烯胶乳微球（氨基微球），首先使用马来酰亚胺‑聚乙二醇‑丙烯酸琥珀酰亚胺酯（Mal‑PEG‑NHS ester）与氨基微球进行偶联反应，对胶乳微球进行修饰，再用修饰后得到的胶乳微球‑聚乙二醇‑马来酰亚胺偶联体（Latex microspheres‑(PEG)n‑Mal）中的‑(PEG)n‑Mal作为连接分子，与抗体表面的巯基反应，得到胶乳微球‑连接分子‑抗体蛋白偶连体（即本发明中的抗香草扁桃酸特异性抗体包被的胶乳微球）。通过这种偶联方法能扩大抗体与胶乳微球表面之间的空间距离，同时增加抗体与抗体之间的间隔距离，避免抗体分子相互挤压，使抗体有足够空间与抗原进行识别结合反应，有效提高了抗体反应效率，减少了抗体使用量，节省了试剂成本，同时显著提高了香草扁桃酸检测的灵敏度。本发明的检测试剂可实现在全自动生化分析仪上对香草扁桃酸含量的高通量、快速化检测，且稳定性好、准确度高、特异性强、使用方便，检测效率显著提高，易于广泛推广使用。
Description
技术领域
本发明属于生物检测试剂技术领域，具体涉及一种香草扁桃酸胶乳增强免疫比浊检测试剂及其制备方法。
背景技术
香草扁桃酸（Vanillymandelic Acid，VMA），其结构式如式Ⅵ所示：
式Ⅵ。
香草扁桃酸即3-甲氧基-4-羟基苦杏仁酸，是肾上腺髓质、交感神经节等部位的嗜铬细胞分泌的儿茶酚胺类激素（肾上腺素、去甲肾上腺素）的主要代谢物，可反映体内肾上腺髓质激素的浓度水平。尿液中香草扁桃酸的测定可间接反映体内儿茶酚胺的分泌，对肾上腺髓质增生的诊断也有着重要的临床意义。尿液中VMA的多寡由交感神经、肾上腺髓质功能状态决定。VMA升高则说明肾上腺功能活跃，交感神经兴奋性增高。儿茶酚胺分泌增多则导致其代谢产物VMA的增多。VMA可用来诊断充血性心力衰竭(CHF)临床综合症。已有研究报道，中枢性睡眠呼吸障碍的存在加重了充血性心力衰竭患者夜间的缺氧，导致左室射血分数(LVEF)降低，对左心功能产生负面影响。存在睡眠呼吸障碍，常引起夜间反复的睡眠呼吸暂停及低通气，出现夜间的反复微醒觉。睡眠呼吸暂停、低氧、睡眠中微醒觉、胸内负压增加及变化过度均可导致体内儿茶酚胺的增加。研究表明：实验组与对照组LVEF相同情况下，实验组慢性充血性心力衰竭(CHF)患者组较对照组VMA水平高。
检测香草扁桃酸的方法有重氮法、微柱法、高效液相色谱法、电化学发光法、分光光度法等。重氮法不需特殊仪器，曾在临床得到广泛应用。但其易受药物、饮食等干扰而出现假阳性结果，且操作繁琐费时。微柱法原理是通过阴离子交换树脂将尿中VMA吸附保留在树脂内而与干扰物分离，随后将柱中VMA洗脱并在碱性条件下与高碘酸盐发生过氧化衍生反应生成香兰素，后者在360 nm 波长处有吸收，从而进行定量分析。该法存在以下缺点：所用微柱无法循环利用，增加了检测成本，标本检测长达2小时，难以用于相关疾病的筛查。高效液相色谱法可避免饮食、药物等干扰，定量更为准确、可靠，分析时间也显著缩短。但该方法需特殊仪器设备，填充柱价格昂贵，流动相消耗量大，检测成本高。同时，色谱柱对生物样品中杂质的非特异性吸附会影响其柱效及寿命，分析柱前常需加装保护柱。电化学发光法是通过施加一定的电压进行电化学反应，在电极表面产生一些电生物质，然后将这些电生物质之间或电生物质与体系中某些组分之间通过电子传递形成激发态，由激发态返回基态而产生的一种发光现象。该方法适用范围广，检测快速，整个检测过程小于20分钟，但需要特殊的化学发光仪，成本较高。分光光度法是在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与不同波长相对应的吸收强度。如以波长(λ)为横坐标，吸收强度(A)为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，其操作比较繁琐，准确度不高。
因此，针对现有技术中存在的缺陷，研发一种性能指标达到临床检测要求，灵敏度高、特异性强、稳定性好、结果准确，可应用于全自动生化分析仪的高通量、快速化检测的香草扁桃酸检测试剂已成为国内外体外诊断试剂行业的热点。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明所采用的技术方案是：
本发明一方面提供了一种香草扁桃酸胶乳增强免疫比浊检测试剂，包括：R1试剂与R2试剂；
所述R1试剂由香草扁桃酸-共轭蛋白偶联物和R1缓冲液组成，所述R2试剂由抗香草扁桃酸特异性抗体包被的胶乳微球和R2缓冲液组成；
所述的香草扁桃酸-共轭蛋白偶联物由香草扁桃酸衍生物与共轭蛋白偶联而成，其结构式如式Ⅰ所示：
式Ⅰ；
所述香草扁桃酸衍生物，结构式如式Ⅱ所示：
式Ⅱ；
所述共轭蛋白为血清白蛋白；所述R1缓冲液为含有聚乙二醇20000与普瑞克宁300的Tirs缓冲液；
所述的抗香草扁桃酸特异性抗体为香草扁桃酸免疫原免疫实验动物后得到的抗体；所述的香草扁桃酸免疫原由式Ⅱ所示的香草扁桃酸衍生物与载体蛋白偶联而成，其结构式如式Ⅲ所示：
式Ⅲ；
所述的载体蛋白是具有免疫原性的蛋白质或多肽；所述的实验动物为哺乳动物；
所述抗香草扁桃酸特异性抗体包被的胶乳微球由抗香草扁桃酸特异性抗体通过连接分子与胶乳微球偶联而成；
所述连接分子为马来酰亚胺-聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯，其结构式如式Ⅳ所示：
式Ⅳ；
式Ⅳ中n为1-12之间的任意整数；
所述胶乳微球为表面带有氨基、羧基、羟基、巯基、酰肼基或氯甲基中任意一种基团修饰的聚苯乙烯胶乳微球，直径范围为50-450nm；
所述R2缓冲液为含有普瑞克宁300的磷酸钠缓冲液。
优选地，所述血清白蛋白为牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、羊血清白蛋白、马血清白蛋白或人血清白蛋白中的一种。更优选地，所述血清白蛋白为人血清白蛋白。
优选地，所述具有免疫原性的蛋白质或多肽为血清白蛋白、甲状腺球蛋白、丙种球蛋白、卵清白蛋白、血蓝蛋白或多聚赖氨酸中的一种；所述哺乳动物为家兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的一种。更优选地，所述具有免疫原性的蛋白质或多肽为血蓝蛋白；所述哺乳动物为家兔。
优选地，所述连接分子为马来酰亚胺-十二聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯，其结构式如式Ⅴ所示：
式Ⅴ；
优选地，所述胶乳微球为表面带有氨基修饰的聚苯乙烯胶乳微球，直径为200nm。
本发明另一方面提供了一种上述的香草扁桃酸胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备方法，所述的制备方法包含以下步骤：
（A1）R1试剂的制备：将香草扁桃酸-共轭蛋白偶联物溶解于纯化水中，然后添加聚乙二醇20000、普瑞克宁300、三羟甲基氨基甲烷，搅拌均匀，将pH值调节至7.0-9.0，制得R1试剂；
（A2）R2试剂的制备：将抗香草扁桃酸特异性抗体包被的胶乳微球加入纯化水中，然后添加磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、普瑞克宁300，搅拌均匀，将pH值调节至7.0-9.0，制得R2试剂。
具体地，上述的香草扁桃酸胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备方法包含以下步骤：
（A1）R1试剂的制备：将香草扁桃酸-共轭蛋白偶联物按照终浓度质量分数为0.01%的比例溶解于纯化水中，然后添加终浓度质量分数为0.1%的聚乙二醇20000、0.05%的普瑞克宁300，终浓度摩尔浓度为100.0mmol/L的三羟甲基氨基甲烷，搅拌均匀，将pH值调节至8.0，制得R1试剂；
（A2）R2试剂的制备：将抗香草扁桃酸特异性抗体包被的胶乳微球按照终浓度质量分数为2.0%的比例加入纯化水中，然后添加终浓度摩尔浓度为8.0 mmol/L的磷酸氢二钠、5.0 mmol/L的磷酸二氢钾，终浓度质量分数为0.05%的普瑞克宁300，搅拌均匀，将pH值调节至8.0，制得R2试剂。
优选地，所述香草扁桃酸-共轭蛋白偶联物的制备方法，包含以下步骤：
（B1）将共轭蛋白溶解于磷酸钾缓冲液中，得到共轭蛋白溶液；
（B2）将上述式Ⅱ所示的香草扁桃酸衍生物与二甲基甲酰胺、乙醇、磷酸钾缓冲液、1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解，得到香草扁桃酸衍生物溶液；
（B3）将步骤（B2）得到的香草扁桃酸衍生物溶液加入到步骤（B1）得到的共轭蛋白溶液中，搅拌反应，经透析纯化，得到香草扁桃酸-共轭蛋白偶联物。
具体地，所述香草扁桃酸-共轭蛋白偶联物的制备方法，包含以下步骤：
（B1）将500.0mg人血清白蛋白溶解于100.0mL(0.5mol/L、pH=8.0)的磷酸钾缓冲液中，得到人血清白蛋白溶液；
（B2）将200.0mg上述的香草扁桃酸衍生物、10.0mL二甲基甲酰胺、7.5mL乙醇、15.0mL(10.0mmol/L、pH=7.0)的磷酸钾缓冲液、250.0mg 1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺、100.0mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解反应1小时，得到香草扁桃酸衍生物溶液；
（B3）将步骤（B2）得到的香草扁桃酸衍生物溶液加入到步骤（B1）得到的人血清白蛋白溶液中，并在4℃下搅拌反应12小时，经透析纯化，得到香草扁桃酸-共轭蛋白偶联物。
优选地，所述式Ⅱ所示的香草扁桃酸衍生物的制备方法，合成路径如下：
；
所述香草扁桃酸衍生物的制备方法包括以下步骤：
（C1）合成化合物3：将化合物1、化合物2溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，并加入K2CO3进行反应后，经萃取、干燥、浓缩、纯化得到化合物3；
（C2）合成香草扁桃酸衍生物：将化合物3与苄基三乙基氯化铵溶解于氯仿中，制成反应溶液；将NaOH溶液滴加入反应溶液中，反应后调节溶液pH=4，然后经萃取、干燥、浓缩、纯化，得到香草扁桃酸衍生物。
具体地，所述香草扁桃酸衍生物的制备方法包括以下步骤：
（C1）合成化合物3：
称取20 g（131.6 mmol）的化合物1、33.2 g（170 mmol）的化合物2，共同溶解于300mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，然后加入36.4 g（263 mmol）的K2CO3，制成反应混合液；将反应混合液在室温下搅拌12小时；反应结束后，在反应混合液中加入200 mL纯化水，然后用300 mL 二氯甲烷（DCM）进行萃取，萃取步骤重复3次；将萃取得到的结合的有机相通过Na2SO4进行干燥处理，再进行浓缩；将浓缩后得到的剩余物通过硅胶干燥柱（PE:EA=5:1）进行纯化，得到化合物3。
（C2）合成香草扁桃酸衍生物：
称取3 g（11.3 mmol）的化合物3、0.15g（0.6 mmol）苄基三乙基氯化铵，共同溶解于30 mL 氯仿（CHCl3）中制成反应溶液；将浓度为15 g/mL NaOH溶液在56℃条件下逐滴加入反应溶液中，并在56℃条件下搅拌2.5小时；反应结束后得到的剩余物用1N 的HCI调节至pH=4，进行酸化处理，然后用30 mL乙酸乙酯（EA）进行萃取，萃取步骤重复3次；将萃取得到的结合的有机相进行干燥与浓缩处理；将浓缩后得到的剩余物通过pre-HPLC进行纯化，得到香草扁桃酸衍生物。
优选地，所述抗香草扁桃酸特异性抗体包被的胶乳微球的制备方法，包含以下步骤：
（D1）将聚苯乙烯胶乳微球加入磷酸钠缓冲液中，轻柔振荡使聚苯乙烯胶乳微球悬浮于上述磷酸钠缓冲液中，离心后去除上清液，然后用磷酸钠缓冲液将沉淀物重悬，制得胶乳微球悬浊液；将马来酰亚胺-聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶解于二甲基亚砜中，制成马来酰亚胺-聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶液；将马来酰亚胺-聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶液加入胶乳微球悬浊液中，充分搅拌溶解，在室温下搅拌反应。反应结束后，将溶液离心，去除上清液，用上述相同的磷酸钠缓冲液快速洗涤沉淀物两次，得到胶乳微球-连接分子偶联物。
（D2）将步骤（D1）制备的胶乳微球-连接分子偶联物重悬于磷酸钠缓冲液中制成胶乳微球-连接分子偶联物悬浊液；将抗香草扁桃酸特异性抗体用硼酸钠缓冲液稀释得到抗体溶液，将抗体溶液立即加入到上述胶乳微球-连接分子偶联物悬浊液中，然后在室温下搅拌反应；反应完成后，加入半胱氨酸，静置2小时，以阻断过量的马来酰亚胺反应位点；然后离心，去除上清液，再将沉淀物用硼酸钠缓冲液洗涤3次，得到抗香草扁桃酸特异性抗体包被的胶乳微球；最后将抗香草扁桃酸特异性抗体包被的胶乳微球重悬于甘氨酸缓冲液中，加入叠氮钠防腐剂于0-4℃下保存。
具体地，所述抗香草扁桃酸特异性抗体包被的胶乳微球的制备方法，包含以下步骤：
（D1）将10.0mg直径为200nm的聚苯乙烯胶乳微球加入15.0 mL(10.0mmol/L、pH=7.2)的磷酸钠缓冲液中，轻柔振荡使聚苯乙烯胶乳微球悬浮于上述磷酸钠缓冲液中，10000r/min离心10分钟后去除上清液，然后用15.0 mL(10.0mmol/L、pH=7.2)的磷酸钠缓冲液将沉淀物重悬，制得胶乳微球悬浊液；将马来酰亚胺-十二聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，制成终浓度为20.0mmol/L的马来酰亚胺-十二聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶液；将马来酰亚胺-十二聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶液以体积比1∶20的比例加入胶乳微球悬浊液中，充分搅拌溶解，在室温下搅拌反应1小时。反应结束后，将溶液用10000r/min离心5分钟，去除上清液，用上述相同的磷酸钠缓冲液快速洗涤沉淀物两次，得到胶乳微球-连接分子偶联物。
（D2）将步骤（D1）制备的胶乳微球-连接分子偶联物重悬于10.0mL(10.0mmol/L、pH=7.2)的磷酸钠缓冲液中制成胶乳微球-连接分子偶联物悬浊液；将1.0mg抗香草扁桃酸特异性抗体用5.0mL（50.0mmol/L、pH=8.2）的硼酸钠缓冲液稀释得到抗体溶液，将抗体溶液立即加入到上述胶乳微球-连接分子偶联物悬浊液中，然后在室温下搅拌反应6小时；反应完成后，加入50.0mmol/L的半胱氨酸，静置2小时，以阻断过量的马来酰亚胺反应位点；然后10000r/mim离心8分钟，去除上清液，再将沉淀物用10.0mL（50.0mmol/L、pH=8.0）的硼酸钠缓冲液洗涤3次，得到抗香草扁桃酸特异性抗体包被的胶乳微球；最后将抗香草扁桃酸特异性抗体包被的胶乳微球重悬于15.0mL（50.0mmol/L、pH=8.0）的甘氨酸缓冲液中，加入质量分数为0.01%的叠氮钠防腐剂于0-4℃下保存。
优选地，所述抗香草扁桃酸特异性抗体的制备方法，包含以下步骤：
（E1）将上述结构式Ⅲ所示的香草扁桃酸免疫原用磷酸钠缓冲液稀释，得到抗原溶液，然后将所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射；
（E2）15-45天后，再用上述的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物注射一次，之后每隔10-20天注射一次，共计注射4-6次；
（E3）对步骤（E2）免疫后的实验动物取血，分离纯化抗血清，得到抗香草扁桃酸特异性抗体；
具体地，所述抗香草扁桃酸特异性抗体的制备方法，包含以下步骤：
（E1）将上述结构式Ⅲ所示的香草扁桃酸免疫原用磷酸钠缓冲液(0.2mol/L、pH=7.5)稀释至终浓度为3.0mg/mL，得到抗原溶液，然后将3.0mL所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对家兔进行注射；
（E2）30天后，再用3.0mL上述的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述家兔注射一次，之后每隔15天注射一次，共计注射5次；
（E3）对步骤（E2）免疫后的家兔取血，分离纯化抗血清，得到抗香草扁桃酸特异性抗体。
优选地，所述结构式Ⅲ所示的香草扁桃酸免疫原的制备方法，包含以下步骤：
（F1）将载体蛋白溶解于磷酸钾缓冲液中，得到载体蛋白溶液；
（F2）将上述式Ⅱ所示的香草扁桃酸衍生物与二甲基甲酰胺、乙醇、磷酸钾缓冲液、1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解，得到香草扁桃酸衍生物溶液；
（F3）将步骤（F2）得到的香草扁桃酸衍生物溶液加入到步骤（F1）得到的载体蛋白溶液中，搅拌反应，经透析纯化，得到香草扁桃酸免疫原。
具体地，所述的香草扁桃酸免疫原的制备方法包括以下步骤：
（F1）将800.0mg血蓝蛋白溶解于100.0mL(0.3mol/L、pH=8.3)的磷酸钾缓冲液中，得到血蓝蛋白溶液；
（F2）将120.0mg上述的香草扁桃酸衍生物、6.0mL二甲基甲酰胺、6.0mL乙醇、15.0mL(10.0mmol/L、pH=6.5)的磷酸钾缓冲液、150.0mg1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺、30.0mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解反应2小时，得到香草扁桃酸衍生物溶液；
（F3）将步骤（F2）得到的香草扁桃酸衍生物溶液加入到步骤（F1）得到的血蓝蛋白溶液中，并在4℃下搅拌反应12小时，经透析纯化，得到香草扁桃酸免疫原。
本发明的有益效果为：现有技术中的胶乳增强免疫比浊试剂常用的胶乳微球为表面带有羧基修饰的胶乳微球（羧基微球），羧基微球能与抗体（IgG）上的氨基直接偶联。这种偶联方法较为简单，但偶联后的结果是偶联体（即抗体包被的胶乳微球）中抗体与胶乳微球表面之间的空间距离很小，同时抗体与抗体之间的间隔距离也很小，大量抗体分子相互挤压在一起，导致抗体没有足够空间与抗原进行识别结合反应，进而导致抗体活性和灵敏度下降，降低了抗体利用效率，造成了抗体浪费。
本发明使用的胶乳微球为表面带有氨基修饰的聚苯乙烯胶乳微球（氨基微球），首先使用马来酰亚胺-聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯（Mal-PEG-NHS ester）与氨基微球进行偶联反应，对胶乳微球进行修饰，再用修饰后得到的胶乳微球-聚乙二醇-马来酰亚胺偶联体（Latex microspheres-(PEG)n-Mal）中的-(PEG)n-Mal作为连接分子，与抗体表面的巯基反应，得到胶乳微球-连接分子-抗体蛋白偶连体（即本发明中的抗香草扁桃酸特异性抗体包被的胶乳微球）。通过这种偶联方法能扩大抗体与胶乳微球表面之间的空间距离，同时增加抗体与抗体之间的间隔距离，避免抗体分子相互挤压，使抗体有足够空间与抗原进行识别结合反应，有效提高了抗体反应效率，减少了抗体使用量，节省了试剂成本，同时显著提高了香草扁桃酸检测的灵敏度。本发明的检测试剂可实现在全自动生化分析仪上对香草扁桃酸含量的高通量、快速化检测，且稳定性好、准确度高、特异性强、使用方便，检测效率显著提高，易于广泛推广使用。
附图说明
图1是香草扁桃酸胶乳增强免疫比浊检测试剂的校准曲线。
图2是胶乳增强免疫比浊检测试剂与高效液相色谱法检测香草扁桃酸的相关性分析图。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。除非特别指明，以下实施例中所用的试剂、仪器、设备、耗材均可从正规渠道商购买获得。
实施例1：香草扁桃酸胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备
(1)香草扁桃酸衍生物的制备
a.称取20 g（131.6 mmol）的化合物1、33.2 g（170 mmol）的化合物2，共同溶解于300 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，然后加入36.4 g（263 mmol）的K2CO3，制成反应混合液；将反应混合液在室温下搅拌12小时；反应结束后，在反应混合液中加入200 mL纯化水，然后用300 mL 二氯甲烷（DCM）进行萃取，萃取步骤重复3次；将萃取得到的结合的有机相通过Na2SO4进行干燥处理，再进行浓缩；将浓缩后得到的剩余物通过硅胶干燥柱（PE:EA=5:1）进行纯化，得到28 g化合物3，产率80%；
。
利用Bruker Avance III plus 400 MHz 和VARIAN MERCURY plus 300M对上述化合物Ⅳ进行核磁共振光谱扫描，采用TMS作为内标；结果如下：1H-NMR (400 MHz, CDCI3):δ 9.86 (s, 1H), 7.46 (m, 2H), 7.01 (m, 1H), 4.19 (m, 4H), 3.93 (s, 3H), 2.58(m, 2H), 2.22(m, 2H), 1.26 (m, 3H)。
b.称取3 g（11.3 mmol）的化合物3、0.15g（0.6 mmol）苄基三乙基氯化铵，共同溶解于30 mL 氯仿（CHCl3）中制成反应溶液；将浓度为15 g/mL NaOH溶液在56℃条件下逐滴加入反应溶液中，并在56℃条件下搅拌2.5小时；反应结束后得到的剩余物用1N 的HCI调节至pH=4，进行酸化处理，然后用30 mL 乙酸乙酯（EA）进行萃取，萃取步骤重复3次；将萃取得到的结合的有机相进行干燥与浓缩处理；将浓缩后得到的剩余物通过pre-HPLC进行纯化，得到0.4 g白色固体状的香草扁桃酸衍生物，产率12.4%；
。
利用Bruker Avance III plus 400 MHz 和VARIAN MERCURY plus 300M对上述白色固体化合物进行核磁共振光谱扫描，采用TMS作为内标。结果如下：1H-NMR (400 MHz,CD3OD): δ 7.08 (s, 1H), 6.93 (m, 2H), 5.06 (s, 1H), 4.04 (m, 2H), 3.83 (s,3H), 2.50(m, 2H), 2.03 (m, 2H)。表征为结构式Ⅱ所示的香草扁桃酸衍生物。
（2）香草扁桃酸-共轭蛋白偶联物的制备
a.将500.0mg人血清白蛋白溶解于100.0mL(0.5mol/L、pH=8.0)的磷酸钾缓冲液中，得到人血清白蛋白溶液；
b.将200.0mg上述的香草扁桃酸衍生物、10.0mL二甲基甲酰胺、7.5mL乙醇、15.0mL(10.0mmol/L、pH=7.0)的磷酸钾缓冲液、250.0mg 1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺、100.0mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解反应1小时，得到香草扁桃酸衍生物溶液；
c.将步骤b得到的香草扁桃酸衍生物溶液加入到步骤a得到的人血清白蛋白溶液中，并在4℃下搅拌反应12小时，经透析纯化，得到香草扁桃酸-共轭蛋白偶联物。
(3)香草扁桃酸免疫原的制备
a.将800.0mg血蓝蛋白溶解于100.0mL(0.3mol/L、pH=8.3)的磷酸钾缓冲液中，得到血蓝蛋白溶液；
b.将120.0mg上述的香草扁桃酸衍生物、6.0mL二甲基甲酰胺、6.0mL乙醇、15.0mL(10.0mmol/L，pH=6.5)的磷酸钾缓冲液、150.0mg1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺、30.0mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解反应2小时，得到香草扁桃酸衍生物溶液；
c.将步骤b得到的香草扁桃酸衍生物溶液加入到步骤a得到的血蓝蛋白溶液中，并在4℃下搅拌反应12小时，经透析纯化，得到香草扁桃酸免疫原。
(4)抗香草扁桃酸特异性抗体的制备
a.将结构式Ⅲ所示的香草扁桃酸免疫原用磷酸钠缓冲液(0.2mol/L、pH=7.5)稀释至终浓度为3.0mg/mL，得到抗原溶液，然后将3.0mL所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对家兔进行注射；
b.30天后，再用3.0mL上述的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述家兔注射一次，之后每隔15天注射一次，共计注射5次；
c.对步骤b免疫后的家兔取血，分离纯化抗血清，得到抗香草扁桃酸特异性抗体。
(5)抗香草扁桃酸特异性抗体包被的胶乳微球的制备
a.将10.0mg直径为200nm的聚苯乙烯胶乳微球加入15.0 mL(10.0mmol/L、pH=7.2)的磷酸钠缓冲液中，轻柔振荡使聚苯乙烯胶乳微球悬浮于上述磷酸钠缓冲液中，10000r/min离心10分钟后去除上清液，然后用15.0 mL(10.0mmol/L、pH=7.2)的磷酸钠缓冲液将沉淀物重悬，制得胶乳微球悬浊液；将马来酰亚胺-十二聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，制成终浓度为20.0mmol/L的马来酰亚胺-十二聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶液；将马来酰亚胺-十二聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶液以体积比1∶20的比例加入胶乳微球悬浊液中，充分搅拌溶解，在室温下搅拌反应1小时。反应结束后，将溶液用10000r/min离心5分钟，去除上清液，用上述相同的磷酸钠缓冲液快速洗涤沉淀物两次，得到胶乳微球-连接分子偶联物。
b.将步骤a制备的胶乳微球-连接分子偶联物重悬于10.0mL(10.0mmol/L、pH=7.2)的磷酸钠缓冲液中制成胶乳微球-连接分子偶联物悬浊液；将1.0mg抗香草扁桃酸特异性抗体用5.0mL（50.0mmol/L、pH=8.2）的硼酸钠缓冲液稀释得到抗体溶液，将抗体溶液立即加入到上述胶乳微球-连接分子偶联物悬浊液中，然后在室温下搅拌反应6小时；反应完成后，加入50.0mmol/L的半胱氨酸，静置2小时，以阻断过量的马来酰亚胺反应位点；然后10000r/mim离心8分钟，去除上清液，再将沉淀物用10.0mL（50.0mmol/L、pH=8.0）的硼酸钠缓冲液洗涤3次，得到抗香草扁桃酸特异性抗体包被的胶乳微球；最后将抗香草扁桃酸特异性抗体包被的胶乳微球重悬于15.0mL（50.0mmol/L、pH=8.0）的甘氨酸缓冲液中，加入质量分数为0.01%的叠氮钠防腐剂于0-4℃下保存。
(6)香草扁桃酸胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备
a.R1试剂的制备：将香草扁桃酸-共轭蛋白偶联物按照终浓度质量分数为0.01%的比例溶解于纯化水中，然后添加终浓度质量分数为0.1%的聚乙二醇20000、0.05%的普瑞克宁300，终浓度摩尔浓度为100.0mmol/L的三羟甲基氨基甲烷，搅拌均匀，将pH值调节至8.0，制得R1试剂；
b.R2试剂的制备：将抗香草扁桃酸特异性抗体包被的胶乳微球按照终浓度质量分数为2.0%的比例加入纯化水中，然后添加终浓度摩尔浓度为8.0 mmol/L的磷酸氢二钠、5.0mmol/L的磷酸二氢钾，终浓度质量分数为0.05%的普瑞克宁300，搅拌均匀，将pH值调节至8.0，制得R2试剂。
实施例2：香草扁桃酸标准品的制备
将香草扁桃酸纯品粉末分别加入6份浓度为50mmol/L pH=7.2的Tris-HCl缓冲液中，搅拌溶解，至终浓度分别为0.00μg/mL、2.56μg/mL、6.40μg/mL、16.00μg/mL、40.00μg/mL、100.00μg/mL，然后在每份溶液中分别加入质量分数为0.5%的氯化钠、1.0%的牛血清白蛋白、0.75%的乙二胺四乙酸、0.05%的叠氮钠，搅拌均匀，即为香草扁桃酸标准品（一组6个不同浓度）。
实施例3：香草扁桃酸胶乳增强免疫比浊检测试剂校准曲线制作及性能评估实验
（1）制作香草扁桃酸胶乳增强免疫比浊检测试剂校准曲线：
在奥林巴斯AU480全自动生化分析仪中放入实施例1制备得到的香草扁桃酸胶乳增强免疫比浊检测试剂，及实施例2制备得到的香草扁桃酸标准品，然后对生化分析仪进行反应参数设置，具体参数详见表1。实际检测过程中先加入R1试剂，再加入标准品，最后加入R2试剂。加入R2试剂后，测定不同时间点的OD570nm吸光值，计算出不同标准品浓度时的反应速率（详见表2），绘制成反应标准曲线，如图1所示。
表1. 奥林巴斯AU480全自动生化分析仪反应参数
| 项目名称 | 香草扁桃酸 |
| R1试剂 | 160.0µl |
| R2试剂 | 40.0µl |
| 样本量 | 10.0µl |
| 定标方法 | 终点法 |
| 主波长 | 570nm |
| 次波长 | 412nm |
| 反应时间 | 10分钟 |
| 温育时间 | 8分钟 |
| 反应方向 | 下降 |
| 结果 | μg/mL |
| 结果精度 | 0.01 |
| 拟合方法 | Spline |
| 标准品浓度 | 0.00μg/mL、2.56μg/mL、6.40μg/mL、16.00μg/mL、40.00μg/mL、100.00μg/mL |
表2. 不同标准品浓度时的反应度数值
| 标准品浓度（µg/mL） | △OD570nm |
| 0.00 | 0.6508 |
| 2.56 | 0.5791 |
| 6.40 | 0.5234 |
| 16.00 | 0.4444 |
| 40.00 | 0.3575 |
| 100.00 | 0.2737 |
（2）质控实验：
将香草扁桃酸纯品粉末溶解于甲醇中制得1mg/mL的储存液，并将此储存液稀释于不含香草扁桃酸的健康人血浆中，至终浓度分别为0.00、9.00、30.00、100.00μg/mL，制得空白、低、中、高浓度的质控样本。利用上述的胶乳增强免疫比浊检测方法，对质控样本进行测定，并根据步骤1中制作的胶乳增强免疫比浊检测校准曲线，计算每个质控样本中香草扁桃酸的含量，每个质控样本重复测定10次，检测结果及数据分析详见表3。
表3. 香草扁桃酸胶乳增强免疫比浊试剂检测结果及数据分析
| 质控样品 | 空白 | 低 | 中 | 高 |
| 样品浓度 (μg/mL) | 0.00 | 9.00 | 30.00 | 100.00 |
| 测试1 | 0.00 | 8.91 | 30.46 | 106.61 |
| 测试2 | 0.00 | 9.06 | 28.85 | 104.52 |
| 测试3 | 0.00 | 8.63 | 30.84 | 93.75 |
| 测试4 | 0.00 | 8.79 | 29.25 | 98.79 |
| 测试5 | 0.00 | 9.31 | 31.35 | 99.01 |
| 测试6 | 0.00 | 8.75 | 29.19 | 100.70 |
| 测试7 | 0.00 | 9.29 | 30.39 | 96.82 |
| 测试8 | 0.00 | 8.72 | 30.25 | 103.84 |
| 测试9 | 0.00 | 8.98 | 30.35 | 97.25 |
| 测试10 | 0.00 | 8.67 | 30.17 | 102.08 |
| 平均值(μg/mL) | 0.00 | 8.91 | 30.11 | 100.34 |
| 标准差（SD） | / | 0.25 | 0.78 | 3.97 |
| 精密度（CV） | / | 2.81% | 2.59% | 3.96% |
| 回收率 | / | 99.00% | 100.37% | 100.34% |
实验结果表明：测定不同浓度质控样品中香草扁桃酸含量的CV值均低于5%，回收率均在95%-105%之间，说明本发明的香草扁桃酸胶乳增强免疫比浊检测试剂测定生物样本中香草扁桃酸含量的精密度较高，结果准确。
（3）香草扁桃酸胶乳增强免疫比浊检测试剂的性能评估实验
根据GB/T 26124-2011《临床化学体外诊断试剂（盒）》、《中华人民共和国卫生行业标准：定量测定方法的线性评价》的有关要求，参考CLSI相关标准，在进行大量实验验证后，确定本发明的试剂可以达到的性能指标如下：
a.试剂空白吸光度：以纯化水为检测样本时，吸光度≥0.8（光径1 cm；主波长570nm；37℃）。
b.分析灵敏度：测定浓度为6.40μg/mL的香草扁桃酸样本，吸光度差值（ΔA）的范围为0.01~0.40。
c.线性范围：[2.00，100.00] μg/mL，线性相关系数r≥0.990；在[2.00，10.00) μg/mL线性范围内，绝对偏差在±1.50μg/mL以内；在[10.00，100.00] μg/mL线性范围内，相对偏差在±15.0%以内。
d.精密度：重复性CV≤10.0%（n=10）；连续三批生产的不同批号的试剂测定同一样本，每个批号测三次，批间差R≤10.0%。
e.准确度：用香草扁桃酸试剂对质控品进行测定，每个浓度测定3次，取平均值，根据平均值计算相对偏差B在±15.0%以内。
f.分析特异性：进行了白蛋白≤6g/L、肌酐≤4000mg/L、血红蛋白≤200mg/dL、胆红素≤20mg/dL、甘油三酯≤2000mg/dL的干扰试验研究。测定已知浓度的样本3次，计算相对偏差，相对偏差在±15.0%以内，说明该浓度范围内的干扰物对本试剂无影响。
g.可报告范围：香草扁桃酸胶乳增强免疫比浊检测试剂的可报告范围为1.70~300.00μg/mL。
h.稳定性：将试剂密闭贮存于2℃~8℃，有效期为12个月；试剂开封后在2℃~8℃储存环境下，有效期为30天。
性能评估实验结果表明，本发明的香草扁桃酸胶乳增强免疫比浊检测试剂的试剂空白吸光度、分析灵敏度、线性范围、精密度（重复性、批间差）、准确度、分析特异性、可报告范围、稳定性等性能指标均符合相关标准的技术要求。
实施例4：胶乳增强免疫比浊检测试剂与高效液相色谱法检测香草扁桃酸的相关性实验
使用实施例1制备得到的香草扁桃酸胶乳增强免疫比浊检测试剂与高效液相色谱法对100例临床尿液样本分别进行检测，对上述检测得到的数据作散点图，并进行相关性分析（如图2所示），得到的线性方程为：y = 1.0079x + 0.0893，相关系数R2 = 0.9975，表明采用本发明香草扁桃酸胶乳增强免疫比浊检测试剂检测临床尿液样本的实验数据与高效液相色谱法具有较高的一致性，检测结果准确度高。
实施例5：使用不同连接分子的抗香草扁桃酸特异性抗体包被的胶乳微球制备的试剂的性能验证
为了说明本发明使用其它不同连接分子的抗香草扁桃酸特异性抗体包被的胶乳微球都能用于制备香草扁桃酸胶乳增强免疫比浊检测试剂，并且都具有相同性能，采用各种不同连接分子的抗香草扁桃酸特异性抗体包被的胶乳微球，按照实施例1的方法制备相应的检验试剂，并对所制备的检验试剂按照实施例3-4所述方法进行各项实验，各实验方案所采用的连接分子及试剂性能验证结果见表4。
表4.使用不同连接分子的试剂性能验证结果
实验结果表明：本发明使用其它不同连接分子的抗香草扁桃酸特异性抗体包被的胶乳微球都能用于制备香草扁桃酸胶乳增强免疫比浊检测试剂，并且都具有优越性能。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及其附图内容所做的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关技术领域，均同理包括在本发明的权利要求保护范围内。
Claims (10)
1.一种香草扁桃酸胶乳增强免疫比浊检测试剂，其特征在于，包括：R1试剂与R2试剂；
所述R1试剂由香草扁桃酸-共轭蛋白偶联物和R1缓冲液组成，所述R2试剂由抗香草扁桃酸特异性抗体包被的胶乳微球和R2缓冲液组成；
所述的香草扁桃酸-共轭蛋白偶联物由香草扁桃酸衍生物与共轭蛋白偶联而成，其结构式如式Ⅰ所示：
式Ⅰ；
所述香草扁桃酸衍生物，结构式如式Ⅱ所示：
式Ⅱ；
所述共轭蛋白为血清白蛋白；所述R1缓冲液为含有聚乙二醇20000与普瑞克宁300的Tirs缓冲液；
所述的抗香草扁桃酸特异性抗体为香草扁桃酸免疫原免疫实验动物后得到的抗体；所述的香草扁桃酸免疫原由式Ⅱ所示的香草扁桃酸衍生物与载体蛋白偶联而成，其结构式如式Ⅲ所示：
式Ⅲ；
所述的载体蛋白是具有免疫原性的蛋白质或多肽；所述的实验动物为哺乳动物；
所述抗香草扁桃酸特异性抗体包被的胶乳微球由抗香草扁桃酸特异性抗体通过连接分子与胶乳微球偶联而成；
所述连接分子为马来酰亚胺-聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯，其结构式如式Ⅳ所示：
式Ⅳ；
式Ⅳ中n为1-12之间的任意整数；
所述胶乳微球为表面带有氨基、羧基、羟基、巯基、酰肼基或氯甲基中任意一种基团修饰的聚苯乙烯胶乳微球，直径范围为50-450nm；
所述R2缓冲液为含有普瑞克宁300的磷酸钠缓冲液。
2.根据权利要求1所述的香草扁桃酸胶乳增强免疫比浊检测试剂，其特征在于，所述血清白蛋白为牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、羊血清白蛋白、马血清白蛋白或人血清白蛋白中的一种。
3.根据权利要求2所述的香草扁桃酸胶乳增强免疫比浊检测试剂，其特征在于，所述血清白蛋白为人血清白蛋白。
4.根据权利要求1所述的香草扁桃酸胶乳增强免疫比浊检测试剂，其特征在于，所述具有免疫原性的蛋白质或多肽为血清白蛋白、甲状腺球蛋白、丙种球蛋白、卵清白蛋白、血蓝蛋白或多聚赖氨酸中的一种；所述哺乳动物为家兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的一种。
5.根据权利要求4所述的香草扁桃酸胶乳增强免疫比浊检测试剂，其特征在于，所述具有免疫原性的蛋白质或多肽为血蓝蛋白；所述哺乳动物为家兔。
6.根据权利要求1所述的香草扁桃酸胶乳增强免疫比浊检测试剂，其特征在于，所述连接分子为马来酰亚胺-十二聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯，其结构式如式Ⅴ所示：
式Ⅴ；
所述胶乳微球为表面带有氨基修饰的聚苯乙烯胶乳微球，直径为200nm。
7.一种如权利要求1所述的香草扁桃酸胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包含以下步骤：
（A1）R1试剂的制备：将香草扁桃酸-共轭蛋白偶联物溶解于纯化水中，然后添加聚乙二醇20000、普瑞克宁300、三羟甲基氨基甲烷，搅拌均匀，将pH值调节至7.0-9.0，制得R1试剂；
（A2）R2试剂的制备：将抗香草扁桃酸特异性抗体包被的胶乳微球加入纯化水中，然后添加磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、普瑞克宁300，搅拌均匀，将pH值调节至7.0-9.0，制得R2试剂。
8.根据权利要求7所述的香草扁桃酸胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备方法，其特征在于，所述香草扁桃酸-共轭蛋白偶联物的制备方法，包含以下步骤：
（B1）将共轭蛋白溶解于磷酸钾缓冲液中，得到共轭蛋白溶液；
（B2）将权利要求1中式Ⅱ所示的香草扁桃酸衍生物与二甲基甲酰胺、乙醇、磷酸钾缓冲液、1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解，得到香草扁桃酸衍生物溶液；
（B3）将步骤（B2）得到的香草扁桃酸衍生物溶液加入到步骤（B1）得到的共轭蛋白溶液中，搅拌反应，经透析纯化，得到香草扁桃酸-共轭蛋白偶联物；
所述式Ⅱ所示的香草扁桃酸衍生物的制备方法，合成路径如下：
；
所述式Ⅱ所示的香草扁桃酸衍生物的制备方法包括以下步骤：
（C1）合成化合物3：将化合物1、化合物2溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，并加入K2CO3进行反应后，经萃取、干燥、浓缩、纯化得到化合物3；
（C2）合成香草扁桃酸衍生物：将化合物3与苄基三乙基氯化铵溶解于氯仿中，制成反应溶液；将NaOH溶液滴加入反应溶液中，反应后调节溶液pH=4，然后经萃取、干燥、浓缩、纯化，得到香草扁桃酸衍生物。
9.根据权利要求7所述的香草扁桃酸胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备方法，其特征在于，所述抗香草扁桃酸特异性抗体包被的胶乳微球的制备方法，包含以下步骤：
（D1）将聚苯乙烯胶乳微球加入磷酸钠缓冲液中，轻柔振荡使聚苯乙烯胶乳微球悬浮于上述磷酸钠缓冲液中，离心后去除上清液，然后用磷酸钠缓冲液将沉淀物重悬，制得胶乳微球悬浊液；将马来酰亚胺-聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶解于二甲基亚砜中，制成马来酰亚胺-聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶液；将马来酰亚胺-聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶液加入胶乳微球悬浊液中，充分搅拌溶解，在室温下搅拌反应；反应结束后，将溶液离心，去除上清液，用上述相同的磷酸钠缓冲液快速洗涤沉淀物两次，得到胶乳微球-连接分子偶联物；
（D2）将步骤（D1）制备的胶乳微球-连接分子偶联物重悬于磷酸钠缓冲液中制成胶乳微球-连接分子偶联物悬浊液；将抗香草扁桃酸特异性抗体用硼酸钠缓冲液稀释得到抗体溶液，将抗体溶液立即加入到上述胶乳微球-连接分子偶联物悬浊液中，然后在室温下搅拌反应；反应完成后，加入半胱氨酸，静置2小时，以阻断过量的马来酰亚胺反应位点；然后离心，去除上清液，再将沉淀物用硼酸钠缓冲液洗涤3次，得到抗香草扁桃酸特异性抗体包被的胶乳微球；最后将抗香草扁桃酸特异性抗体包被的胶乳微球重悬于甘氨酸缓冲液中，加入叠氮钠防腐剂于0-4℃下保存。
10.根据权利要求9所述的香草扁桃酸胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备方法，其特征在于，所述抗香草扁桃酸特异性抗体的制备方法，包含以下步骤：
（E1）将权利要求1中结构式Ⅲ所示的香草扁桃酸免疫原用磷酸钠缓冲液稀释，得到抗原溶液，然后将所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射；
（E2）15-45天后，再用上述的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物注射一次，之后每隔10-20天注射一次，共计注射4-6次；
（E3）对步骤（E2）免疫后的实验动物取血，分离纯化抗血清，得到抗香草扁桃酸特异性抗体；
所述结构式Ⅲ所示的香草扁桃酸免疫原的制备方法，包含以下步骤：
（F1）将载体蛋白溶解于磷酸钾缓冲液中，得到载体蛋白溶液；
（F2）将权利要求1中式Ⅱ所示的香草扁桃酸衍生物与二甲基甲酰胺、乙醇、磷酸钾缓冲液、1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解，得到香草扁桃酸衍生物溶液；
（F3）将步骤（F2）得到的香草扁桃酸衍生物溶液加入到步骤（F1）得到的载体蛋白溶液中，搅拌反应，经透析纯化，得到香草扁桃酸免疫原。
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