CN109358192B - 一种去除抗药抗体检测样品中游离药物的装置和方法、该装置的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种去除抗药抗体检测样品中游离药物的装置和方法、该装置的制备方法及应用，具体地，在所述装置中，与药物特异结合的物质与固相载体偶联，并且所述与药物特异结合的物质不与样品中除了所述游离药物以外的其他成分反应。采用本发明的装置预处理抗药抗体检测样品并结合抗药抗体检测方法(如桥接法)检测样品中的抗药抗体，可以有效地减少抗体药物对于抗药抗体检测的干扰，提高样品中抗药抗体检测的灵敏度。

Description

一种去除抗药抗体检测样品中游离药物的装置和方法、该装 置的制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物医药领域的样品前处理领域，具体地，涉及一种去除样品中游离药物的装置和方法、该装置的制备方法及应用，具体地，本发明涉及一种去除样品中游离抗体药物的装置和方法、该装置的制备方法及应用。
背景技术
癌症是威胁人类健康的主要疾病之一，预防和治疗癌症也是研究和开发生物药物的主要目标之一。生物制药主要涵盖了抗体药物、重组蛋白、血液制品、疫苗等类别，其中抗体药物由于靶向性强、特异性高和毒副作用低等特点，已迅速发展成为生物制品行业中占比最大的类别。而抗体类药物由于分子量大、给药剂量大、大多是静脉给药、有些是直接作用于免疫系统，因此，比其他生物制品的安全性风险更大，因此非临床安全性评价时，需要考虑更多的因素，为药物的临床评价提供更多的安全性信息。
免疫原性是指药物刺激机体产生的特异性抗体或致敏淋巴细胞的性质，在临床前实验中评价免疫原性是生物药申请临床试验的重要内容。临床上抗药抗体(ADA)可能带来的影响有：1.ADA可以增加或减少药物的清除率；2.ADA会降低药物的药理作用；3.ADA与药物及内源性同系蛋白结合后，可能会导致该蛋白缺陷综合症；4.对药物的免疫应答可能会导致过敏反应，甚至特异质反应。所以，尽管在动物模型中显示的免疫原性不能准确预期人体试验的结果，但是评价药物引起的免疫反应仍显得十分重要。动物给药后产生的ADA可能会中和药物的活性，影响药物的清除、血浆半衰期和组织分布，改变药效动力学(PD)/药代动力学(PK)特征，造成在临床前实验中观察到的效应并非药物真正的药理和/或毒性反应，因此在评价药物安全性时免疫原性的考察是非常重要的。但是ADA的检测方法易受到药物(游离药物和游离药物-ADA结合物)的干扰，虽然目前ADA的检测方法中通常会加入酸处理的过程，但是该方法也只是给与药物结合的ADA增加了能被检测的机会，最终的检测结果仍然受到样品中药物浓度的影响。
目前对ADA的检测有改善作用的应用技术主要有酸解、酸解+MSD(酸解+电化学发光法)和ACE(酸解-捕获-洗脱)，其他方法也偶见报道，如PEG沉淀法。
具体地说，酸解是通过酸化样品来实现将药物-抗药抗体复合物离解成药物和抗药抗体。但这仅是在酸性条件下的存在形式，酸化后的样品需要在pH回到中性时方可被用于抗药抗体的检测，其时，样品中的药物和抗药抗体又重新形成药物-抗药抗体复合物。酸解的最大目的是使得原来已与药物结合的抗药抗体至少有部分可以被测量到，而如果不采用酸解的话，它们是不可能被检测到的。
在酸解+MSD(酸解+电化学发光法)中，酸化后样品中的抗药抗体在中性pH条件下有部分会同时与微孔中生物素化的药物以及钌标记的药物结合，然后，被检测出来(见图1)。由于基于MSD平台的电化学发光测量技术的高灵敏度和钌标记的药物信号强度，使得ADA测量方法的灵敏度很高(可达fg/mL)，并且线性范围很宽(可达6个数量级)。因此，只要有达到灵敏度信号水平以上的抗药抗体存在，便能被测定出来。
在ACE方法中，酸化后样品中的抗药抗体在中性pH条件下有部分会与包被在微孔板上的药物结合，然后，通过洗板，除去样品中所有未结合的成分包括游离药物，再通过酸化步骤将结合在微孔板上的抗药抗体洗脱下来，中和后直接包被在第二块微孔板上，然后，通过加入直接标记的药物或通过生物素-亲和素间接标记的药物，实现对抗药抗体的测定(见图2)。该方法的局限之处如下：1)酸化后样品中的抗药抗体在中性pH条件下仅仅只有部分会与包被在微孔板上的药物结合，并且，这部分的抗药抗体的量与样品中存在的游离药物浓度呈反比，也就是说，如果样品中存在的游离药物浓度很高的话，那么与包被在微孔板上的药物相结合的抗药抗体的量会降低。因此，从这个原理上讲，该方法并未消除游离药物对抗药抗体的影响。只是在分析后期的检测步骤中，避免了样品中的游离药物与标记试剂竞争结合待检的抗药抗体所致的干扰。2)再酸化步骤是达到将结合在微孔板上的抗药抗体洗脱下来的目的，但是由于包被在微孔板上的药物是通过非共价键的被动吸附实现的，所以在酸洗脱时，不仅有抗药抗体从包被的药物分子上被洗脱下来，还有药物与抗药抗体结合的复合体也被洗脱下来，而后者是不能被检测到的。
鉴于以上方法存在的缺点，在ADA检测中，需要一种可以降低游离药物对于ADA检测的影响并提高ADA检测灵敏度的方法。
发明内容
本发明的技术目的是通过设计一种药物吸附装置来解决抗药抗体分析中的药物干扰问题。
一方面，本发明提供了一种去除抗药抗体检测样品中游离药物的装置，在所述装置中，与药物特异结合的物质与固相载体偶联，并且所述与药物特异结合的物质不与样品中除了所述药物以外的其他成分反应。本发明中，术语“抗药抗体检测样品”是指用于检测抗药抗体的样品，例如，为用于检测抗药抗体的动物血液样品。
在一个实施方式中，所述游离药物为抗体药物或非抗体药物，特别为抗体药物，例如为人IgG类药物，如抗PD-L1的抗体药物。关于所述抗体药物，在本申请中，与人IgG的Fc片段融合的蛋白药物也可被视为抗体药物。
在一个实施方式中，所述装置可以为吸附小柱的形式。
在一个实施方式中，所述固相载体可以为琼脂糖树脂、磁性颗粒、芯片或微流体。
在一个实施方式中，所述与药物特异结合的物质包括蛋白分子，具体地，包括抗体分子或细胞膜受体，特别地，当所述药物为抗体药物时，所述与药物特异结合的物质为抗体分子。并且，当所述抗体药物为人鼠嵌合抗体、人源化的抗体或全人抗体类生物药时，所述与药物特异结合的物质是针对上述抗体药物的单克隆抗体(包括独特型)或多克隆抗体。例如，所述与药物特异结合的物质为抗人IgG的单克隆抗体或多克隆抗体。
在一个具体实施方式中，所述装置为其中偶联有抗人IgG的多克隆抗体或单克隆抗体的琼脂糖树脂的装置。
另一方面，本发明提供一种制备上述装置的方法，其包括使与药物特异结合的物质与固相载体偶联的步骤。
在一个实施方式中，所述药物为生物药，特别为抗体药物，例如为人IgG类药物，如抗PD-L1的抗体药物。
在一个实施方式中，所述装置可以为吸附小柱的形式。
在一个实施方式中，所述固相载体可以为琼脂糖树脂、磁性颗粒、芯片或微流体。
在一个实施方式中，所述与药物特异结合的物质包括蛋白分子，具体地，包括抗体分子或细胞膜受体，特别地，当所述药物为抗体药物时，所述与药物特异结合的物质为抗体分子。并且，当所述抗体药物为人鼠嵌合抗体、人源化的抗体或全人抗体类生物药时，所述与药物特异结合的物质是针对上述抗体药物的单克隆抗体(包括独特型)或多克隆抗体。例如，所述与药物特异结合的物质为抗人IgG的单克隆抗体或多克隆抗体。
在一个具体实施方式中，所述与药物特异结合的物质为抗人IgG的多克隆抗体或单克隆抗体，所述固相载体为琼脂糖树脂。
在一个更具体实施方式中，当所述生物药为抗体药物，例如，人IgG时，所述装置包含与作为固相载体的琼脂糖树脂偶联的抗人IgG，其由以下步骤制备：
1)采用Protein A+G琼脂糖柱纯化猴血清中的猴IgG，将纯化后的猴IgG洗脱并收集；
2)使纯化后的猴IgG与N-羟基丁二酰亚胺(NHS)活化的琼脂糖树脂反应，制备猴IgG偶联的琼脂糖树脂；
3)采用所述猴IgG偶联的琼脂糖树脂纯化抗人IgG的多克隆抗体，以及
4)将纯化后的抗人IgG的多克隆抗体与N-羟基丁二酰亚胺(NHS)活化的琼脂糖树脂反应，制成抗人IgG偶联的琼脂糖树脂。
再一方面，本发明提供了上述装置在临床前或临床期在含抗药抗体的样品的预处理中的用途。又一方面，本发明提供一种去除抗药抗体检测样品中游离药物的方法，包括以下步骤：使所述样品通过上述装置，样品中的游离药物通过与所述装置中偶联的与药物特异结合的物质的结合反应而被吸附在固相上，然后实施将所述游离药物从样品中分离出来的操作。
在一个实施方式中，所述游离药物为抗体。
在一个实施方式中，所述方法进一步包括在使样品通过上述装置前，采用酸性溶液对样品进行酸化处理的步骤。
在一个实施方式中，所述酸化中采用的酸性溶液为醋酸溶液或甘氨酸-HCl缓冲液，例如，0.3M的醋酸或0.5M甘氨酸-HCl缓冲液。
在一个实施方式中，所述样品为血液样品，例如，为动物血液样品，例如，为临床前的动物血液样品。
又一方面，本发明提供一种检测样品中抗药抗体的方法，其中所述方法包括使用如上所述的装置预处理样品，并且以桥接法或非桥接法检测预处理后样品中的抗药抗体。
在一个实施方式中，所述样品为血液样品，例如，为动物血液样品，例如，为临床前的动物血液样品。
有益效果
本发明设计了一种独立的样品前处理装置，用来去除ADA检测样品中的游离药物，前处理后的样品可被用于桥接ELISA/ECLIA(电化学发光免疫分析)或其他的方法，但以用于基于MSD平台(Meso Scale Discovery)之上的ECLIA为最佳。如图7所示，在含有大量游离药物的样品中，通常不存在游离的抗药抗体，所有的抗药抗体均是处于结合状态，包括全结合和部分结合状态的抗药抗体，二者对于目前通行的桥接分析方法而言，均不能被检测出来。使用了本发明的装置后，最显著的变化是，1)处理后的样品中已不含游离的药物，这使其后应用的桥接分析方法中避免了样品中的游离药物与标记试剂竞争结合待检的抗药抗体所致的干扰；2)来源于样品前处理装置应用条件中包含了酸化的过程，处理后的样品中会出现没有与药物结合的游离抗药抗体，使得在早期(第8天)含有大量游离药物的样品中的ADA的测量不再受药物的干扰。
由此，本发明的装置可用于抗药抗体检测样品的预处理，可以有效地减少游离药物对于ADA检测的干扰，提高检测灵敏度。
另外，本发明的装置可以被分为两类：1.通用型样品前处理装置，该装置主要是应用在所有动物基质(不包括人)的样品，这些样品中可能含有抗人源性单克隆抗体药物(包括抗体药物偶联物)的抗药抗体。2.个性化样品前处理装置，适用于任何基质的样品，但需要专门制备。
附图说明
图1为现有技术中用于改善ADA检测效果的酸解+MSD方法原理示意图。
图2为现有技术中用于改善ADA检测效果的ACE(酸解-捕获-洗脱)方法原理示意图。
图3显示根据本发明的吸附小柱的构建流程。
图4显示根据本发明的吸附小柱的抗体偶联能力。
图5显示根据本发明的吸附小柱对模拟药物(人IgG)吸附的结果。
图6显示采用根据本发明的装置检测样品中ADA的流程。
图7示意性地指出根据本发明的方法处理后的样品不含有造成干扰的游离药物。
具体实施方式
下文将采用实施例对本申请的具体实施方式进行详细描述，以使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但这些实施例不应理解为限制本发明的范围。
制备实施例吸附小柱的制备
先将Protein A+G(已与琼脂糖偶联)填充至柱子中，纯化猴血清中的猴IgG，将纯化后的猴IgG洗脱下来并收集。将纯化后的猴IgG与NHS活化的琼脂糖树脂室温反应1h，反应结束后，使用PBS缓冲液冲洗纯化柱，并使用1M Tris缓冲液(pH 7.4)封闭该纯化柱，室温反应15-20min，再使用PBS缓冲液冲洗纯化柱，即制成猴IgG偶联的琼脂糖树脂。将山羊抗人IgG的多克隆抗体(北京百奥莱博科技有限公司；规格/型号：F020227)通过猴IgG偶联的琼脂糖树脂进行纯化，再将纯化后的山羊抗人IgG的多克隆抗体通过使用与上述猴IgG偶联的琼脂糖树脂的制备方法相同的方法制成抗人IgG偶联的琼脂糖树脂，即为供样品预处理使用的实验柱，即所述吸附小柱。上述操作的具体操作流程请见附图3。
分析方法
下文列出在本申请的以下实验实施例中所用的分析方法。
1.用于定量检测人源化单克隆抗体药物(针对PD-L1的抗体)的酶联免疫分析方法的关键步骤(人源化单克隆抗体药物在下面的描述中以字母“M”表示)
1)包被：每孔加入100μL由包被缓冲液(0.01M磷酸缓冲液，pH 7.4)配制成的3μg/mL的MB(MB为针对M结合区的独特型抗体)，封膜。将板置于2-8℃孵育18-24小时，不振摇。
2)洗板。
3)封闭。
4)洗板。
5)与标准品、基质空白和测试样品反应。
6)洗板。
7)加酶标抗体：每孔中加入用稀释缓冲液稀释的HRP标记的小鼠抗人IgG Fc抗体，封膜。在iEMS震荡孵育器中37±1℃，650rpm转速条件下孵育1h±5min。
8)洗板。
9)显色：每孔中加入100μL的TMB，封膜，在37±1℃、625±25rpm条件下孵育。
10)终止。
11)检测：用酶标仪在450nm处测量吸光度值。
12)计算:标准曲线以logistic模型(5参数方程)进行曲线拟合和数据处理。
2.基于电化学发光技术的定量检测抗人源化单克隆抗体药物的抗体(ADA)的分析方法(抗人源化单克隆抗体药物的抗体在下面的描述中以“抗M”表示)
2.1仪器和软件
表2.1
Figure BDA0001574653710000071
2.2试剂和相关耗材
表2.2
Figure BDA0001574653710000081
2.3用于定量检测抗人源化单克隆抗体药物的抗体(ADA)的桥接电化学发光法的分析步骤
1)封闭：MSD GOLDTM96孔链霉亲和素板中加Blocker A封闭。
2)洗板。
3)预稀释校准标准品和待测样品
4)酸化处理。
5)与标准品、质控样品和待测样品反应。
6)加样。
7)洗板。
8)读板。
9)计算：以logistic模型(4/5参数方程)进行数据处理，以MSD DISCOVERYWORKBENCH 4.0软件进行曲线拟合和待测样品的浓度计算(基质空白样品的ECL值作为背景值需要在测试样品中扣除，包括标准品和待测样品)。
2.4筛选试验的分析步骤
1)封闭。
2)洗板。
3)预稀释测试样品。
4)酸化处理。
5)与已处理的质控和样品反应。
6)加样。
7)洗板。
8)读板。
9)计算：用MSD DISCOVERY WORKBENCH 4.0软件和MicroSoft Excel 2007计算待测样品的信号基线比(Signal to baseline ratio,SB)。样品的SB计算公式如下：SB＝复孔样品的平均ECL值/至少六复孔的混合猴血清(SNQC)。
2.5确证试验的分析步骤
除步骤3，4，9外，确证试验的步骤和筛选分析试验大致相同。在确证试验的第3步中，各样品在用LowCross缓冲液5倍稀释后分成含药组的样品和不含药组的样品。对于含药组样品，需添加10μL的M(30.0mg/mL)；而对于不含药组样品，需添加10μL LowCross稀释液。
在确证试验第4步中，需添加110μL乙酸(0.3M，pH 2.8)至上述110μL的已处理好的样品中。然后24±1℃温育5±2min，慢速振摇(设定转速600rpm)。
在确证试验第9步中，用MSD DISCOVERY WORKBENCH 4.0软件和MicroSoft Excel2007计算每个样品的IR值。每个样品的IR计算公式如下：
IR(％)＝[1-(含药组样品的平均ECL值/不含药组样品的平均ECL值)]×100％
2.6试验结果的报告
1)SCP值(筛选分析临界点，Screening cut point)为1.028(SB)，SB值低于SCP的样品将报告为筛选试验阴性。
2)SB值大于或等于SCP值的样品将报告为筛选试验阳性，需进一步做确证试验以确证样品中抗M抗体的存在。
3)CCP值(确证分析临界点，Confirmation cut point)为27.7％(IR)，IR值不大于CCP的样品将报告为确证试验阴性。
3.通用ELISA方法检测猴血清中人源IgG
1)包被ELISA板
1μg/mL的包被液(1μg/mL抗人IgG(重链+轻链)溶液)100μL/孔。封板，2-8℃，过夜孵育。
2)封闭。
3)加样温育。
4)加酶标抗体溶液，温育。
5)TMB显色。
6)终止。
7)读板(吸光值测定)15min内在450nm波长下用酶标仪进行读板。
8)数据分析。
采用酶标仪测定每孔的OD 450nm值，并通过OD值用SMP(SoftMax Pro)软件以logistic模型(4/5参数方程)进行数据处理和计算待测样品中的人源IgG的浓度。
实验实施例1吸附小柱的抗体偶联能力评估
通过上述通用ELISA方法，发现采用由制备实施例得到的吸附小柱(山羊抗人IgG)在选定的偶联条件下，可以结合不低于450μg的人IgG，结果见图4。
用400μg的山羊抗人IgG偶联柱子后，用以吸附不同量的人IgG(模拟药物)，室温下1h，结果发现当人IgG为500μg时，柱子的吸附效果达到90％(见图5中的箭头所示)。
实验实施例2由制备实施例得到的吸附小柱对于纯化的抗PD-L1的人源化单克隆抗体药物的吸附
用400μg的山羊抗人IgG偶联柱子后，用于吸附纯化的抗PD-L1的人源化单克隆抗体药物(下文中用字母“M”表示)，结果发现吸附小柱能够吸附564μg的药物M(以超微量核酸蛋白测定仪(德国耶拿Scan Drop 100)测量待测抗体溶液在280nm处的吸光度值，通过下面的公式计算出溶液中的抗体浓度：抗体浓度(mg/mL)＝10×A280/1.36，其中A280为抗体溶液在280nm处测得的吸光度值)，结果见表1。
表1.吸附小柱对抗PD-L1的人源化单克隆抗体药物M的吸附结果
Figure BDA0001574653710000101
实验实施例3由制备实施例得到的吸附小柱预处理样品对最终样品ADA检测的影响评价
对食蟹猴单次静脉输注抗PD-L1的人源化单克隆抗体药物M后的动物血样中的ADA进行了半定量分析。毒理实验设置了15mg/kg和50mg/kg 2个剂量组，每组1雌1雄两只动物，分别在第8天、第15天和第22天时间点进行血样采集。
ADA样品预先使用Lowcross Buffer稀释5倍，再加入等体积的0.3M醋酸，室温条件下慢速振摇(600rpm)5min，反应结束后转移400μL酸化后的样品至预先加入50μL的2MTris-HCl(pH 8.0)缓冲液的吸附小柱中，室温条件下反应10min。反应结束后，1000g条件下离心1min，收集样品(操作过程参见图6)。
采用上文所述的基于MSD的电化学发光技术并结合酸化处理对所有采集到的血清样品进行定性的筛选分析和确证分析检测ADA。
结果示于以下表2。对于50mg/kg给药组的两个动物(1301和2301)在给药后的第8天，第15天和第22天采集的血样而言，从处理过的样品都能检测出抗药抗体，而同时分析的未处理过的样品中仅有一份第22天的样品(2301号动物)被检测出了抗药抗体，其余皆未能检测出抗药抗体，说明处理过的样品基本免除了样品中高水平药物的干扰，可应用在给药后的早期含高浓度药物的样品中的ADA的分析；此外，对于15mg/kg给药组的两个动物在给药后的第8天，第15天和第22天的样品而言，处理过的样品的ADA检测结果与用未处理过的ADA检测结果具有几乎相同的阳性检测结果。但无论是低浓度还是高浓度的给药组样品，处理过的样品的阳性ADA检测信号明显高于未处理的样品阳性ADA检测信号，提示处理过的样品具有更高的分析灵敏度。
表2.实际样品的检测结果
Figure BDA0001574653710000111
从以上结果可以看出，本申请所制备的吸附小柱可以有效地提高样品中ADA检测的灵敏度。
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种制备用于去除抗药抗体检测样品中游离药物的装置的方法，所述方法包括以下步骤：
1)采用Protein A+G琼脂糖柱纯化猴血清中的猴IgG，将纯化后的猴IgG洗脱并收集；
2)使纯化后的猴IgG与N-羟基丁二酰亚胺活化的琼脂糖树脂反应，制备猴IgG偶联的琼脂糖树脂；
3)采用所述猴IgG偶联的琼脂糖树脂纯化抗人IgG的多克隆抗体，以及
4)将纯化后的抗人IgG的多克隆抗体与N-羟基丁二酰亚胺活化的琼脂糖树脂反应，制成偶联有抗人IgG的多克隆抗体的琼脂糖树脂。
2.一种用于去除抗药抗体检测样品中游离药物的装置，其根据权利要求1所述的方法制备。
3.根据权利要求2所述的装置，其中，所述装置为吸附小柱的形式。
4.如权利要求2或3所述的装置在临床前在含抗药抗体的样品的预处理中的用途。
5.一种去除抗药抗体检测样品中游离药物的方法，包括以下步骤：使所述样品通过如权利要求2或3所述的装置，样品中的游离药物通过与所述装置中偶联的抗人IgG的多克隆抗体的结合反应而被吸附在固相上，然后实施将所述游离药物从样品中分离出来的操作，并且
所述方法进一步包括在使所述样品通过所述装置前，采用酸性溶液对样品进行酸化处理的步骤。
6.一种检测样品中抗药抗体的方法，所述方法包括使用如权利要求2或3所述的装置预处理样品，并且以桥接法或非桥接法检测预处理后样品中的抗药抗体。
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