JP2008500972A - 免疫グロブリンの精製方法 - Google Patents
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Abstract
本明細書には、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の精製方法を開示する。本方法は、特定のバッファー及び試薬を用いて、ヒトＩｇＧを単離及び精製し、あるいはフィードストックから、宿主の混入タンパク質、非ヒトＩｇＧ若しくはキメラＩｇＧ、ＩｇＧ二量体、ＩｇＧ凝集体、ウシ血清アルブミン、感染性海綿状脳症、ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ又はウイルス粒子を除去することを特徴とする。本明細書に記載の方法により精製されたＩｇＧは、研究、診断又は治療目的に用いることができる。
Description
本発明は、概して、免疫グロブリンの精製方法に関する。
免疫グロブリン（Ｉｇ）は、診断及び治療分野で使用するのに極めて重要である。例えば、ヒト血漿又は超免疫血漿若しくは血清から単離した免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）調製物は、先天性及び後天性免疫不全疾患、並びに感染性疾患のような疾患を治療するために用いられている。
一般に、免疫グロブリンは、動物血清から、又は好適な細胞系の培養から得られる。コーンエタノール分画の後、イオン交換クロマトグラフィ又はカプリル酸（ＣＡ）沈殿を用いて血漿又は血清からＩｇＧ精製を実施する従来の方法が記載されている（例えば、McKinneyら、J. Immunol. Methods 96:271-278, 1987；米国特許第４，１６４，４９５号；第４，１７７，１８８号；ＲＥ第３１，２６８号；第４，９３９，１７６号；及び第５，１６４，４８７号参照）。以前記載されているこれらの方法はほとんどの場合、低濃度のＣＡ（０．４％〜２．５％）の使用を必要とし、中には、硫酸アンモニウム沈殿のような追加の沈殿ステップが必要なものもある。加えて、フィードストックは往々にして非常に希薄であるため、大量のフィードストックを必要とする。このような従来の製造及び精製方法には、精製物質の汚染、不十分な収率、及び大規模での抗体製造のコストが高いといった制限が存在しうる。
従って、血漿又は血清のような動物の体液から、ＩｇＧ二量体及び凝集体、並びにウイルス及び宿主のタンパク質混入物を通常含まないＩｇＧを高純度かつ高収率で精製するための改善された方法が必要とされている。
本発明者らは、野生型又はトランスジェニック動物の体液、例えば、血漿、血清、腹水、及び乳汁、又はポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体を含む細胞培養上清からＩｇＧを精製するための改良法を見い出した。
第１の態様では、本発明は、フィードストックからＩｇＧを精製する方法に関する。この方法は、複数のステップを含む。最初に、フィードストックのｐＨを約４．０〜５．５の範囲内（例えば、ｐＨ４．０、４．２、４．４、４．５、４．６、４．８又は５．０）に調整する。次に、ｐＨ調整フィードストックと、炭素数４〜１２のモノ又はポリアルカン酸、例えば、炭素数４〜１２、好ましくは炭素数６〜９の任意のアルカン酸とを接触させる。アルカン酸はＣＡであるのが望ましい。非分枝アルカン酸が好ましいが、分枝アルカン酸を用いることもできる。高級アルカン酸（例えば、炭素数９〜１２のものなど）を用いる場合には、さらに１個以上のカルボキシル基を組み込むことにより、水溶性を改善するのが有利である。同様の効果が、例えば、１個以上のヒドロキシル基又はアミノ基を含む置換基を有するアルカン酸を用いることにより達成される。この方法では、沈殿物を形成するのに十分な量及び時間で酸（例えば、ＣＡ）を添加するが、その際、上清溶液はＩｇＧを含んでいる。アルカン酸濃度は総量の百分率として計算することができ、各フィードストックについて経験により決定することができる。アルカン酸がＣＡのとき、フィードストック溶液中のＣＡ濃度は、少なくとも３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％又はそれ以上であるのが望ましい。また、アルカン酸濃度はフィードストック中の総タンパク質の量に対して計算することもできる。例えば、標準的タンパク質アッセイ方法（例：Pierce Biotechnology Inc.製のＢＣＡアッセイキット又はBio-Rad製のＢｒａｄｆｏｒｄアッセイキット）を用いて、フィードストックの総タンパク質濃度を決定することができ、アルカン酸／総タンパク質の比が０．７５〜２．２５、好ましくは約１〜２．２５となるような量のアルカン酸を添加する。
アルカン酸の添加後、ＩｇＧを含む上清を沈殿物から分離する（例えば、遠心分離又は濾過により行う）。続いて、上清のｐＨを中性ｐＨの範囲内、又は続くステップで用いるクロマトグラフィ樹脂に適したｐＨに調整する。次に、上記上清と、ＩｇＧに対するアフィニティを有する少なくとも１つのクロマトグラフィ試薬とを、該上清溶液中のＩｇＧが上記試薬と結合可能な条件で接触させる。好適な樹脂としては、ＩｇＧに対するアフィニティを有する樹脂であればいずれでもよい（例えば、リガンドとして、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、４−メルカプト−エチル−ピリジン、又は抗ヒトＩｇＧ抗体（例：ウマ抗ヒトＩｇＧ若しくはラマ抗ヒトＩｇＧ）を有する樹脂）。リガンドは天然に存在するタンパク質でも、あるいは組換え又は合成により作製したリガンドでもよい。クロマトグラフィ樹脂の例を以下に挙げる：プロテインＡ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ、プロテインＡ−アガロース、プロテインＡ−アガロースＣＬ−４Ｂ、プロテインＧ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ、プロテインＧ−アガロース、プロテインＧ−アガロースＣＬ−４Ｂ、プロテインＬ−アガロース、プロテインＡ／Ｇアガロース、ＫＡＰＴＩＶＴＭイムノアフィニティマトリックス（例えば、ＫＡＰＴＩＶ−ＧＹＴＭ、ＫＡＰＴＩＶ−ＡＥＴＭ、ＫＡＰＴＩＶ−ＭＴＭ、すべてTecnogen, Inc.製）、Ｃｅｌｌｔｈｒｕ ＢｉｇＢｅａｄＴＭ（Sterogene）、プロテインＡ ＵｌｔｒａｆｌｏｗＴＭ（Sterogene）、プロテインＡ ＣｅｌｌｔｈｒｕＴＭ３００（Sterogene）、ＱｕｉｃｋＭａｂ（Sterogene）、ＱｕｉｃｋＰｒｏｔｅｉｎ ＡＴＭ（Sterogene）、ＴｈｒｕｐｕｔＴＭ又はＴｈｒｕｐｕｔ Ｐｌｕｓ（Sterogene）、ＰＲＯＳＥＰ−Ａ及びＰＲＯＳＥＰ−Ｇ（Millipore）、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒｃｅｌＴＭ（Ciphergen）、ＭＢＩ ＨｙｐｅｒｃｅｌＴＭ（Ciphergen）、ＣＭ ＨｙｐｅｒｚＴＭ（Ciphergen）、並びにＮＨＳ活性化ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ。リガンドは、Paul Life Sciences製のＭｕｓｔａｎｇＴＭ膜のような膜支持体又はカートリッジ上に固定することができる。
用いた樹脂に最適なｐＨを有する溶出剤を用いて、クロマトグラフィ樹脂からＩｇＧを溶出する。一例では、ｐＨ約３．０〜５．０（例：ｐＨ３．０、３．５、４．０、４．２、４．４、４．５、４．６、４．８又は５）の酸性ｐＨを有する溶出剤を用いる。別の例では、ｐＨ約８．０〜１１．０の塩基性ｐＨを有する溶出剤を用いる。任意により、溶出後の溶液（すなわち、溶出液）のｐＨを中性ｐＨに調整する。
フィードストックは、例えば、野生型又はトランスジェニック哺乳動物（例：有蹄動物、マウス、ウマ、ブタ、ラット、及びウサギ）から取得した血漿、血清、腹水又は乳汁でありうる。好ましい有蹄動物は、ヒツジ、ウシ、ブタ、及びヤギである。一実施形態では、哺乳動物は、ヒトＩｇＧを産生するトランスジェニックウシである。フィードストックはまた、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を含む細胞培養上清であってもよい。
好ましくは、この方法により、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％以上の純度のＩｇＧの調製物が得られる。望ましくは、ＩｇＧの調製物は、５％、４％、３％、２％、１％若しくは０．５％未満の非ヒトＩｇＧ、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％若しくは２０％未満のキメラＩｇＧ、１００、５０若しくは１０ｐｐｍ未満のウシ血清アルブミン、５００、２５０若しくは１００ｐｐｍ未満の宿主の混入タンパク質、又は５、４、３、２若しくは１ｐｐｍ未満のＤＮＡを含み、あるいは、当分野で公知の標準的検出方法、例えば、ウエスタンブロット分析、感染性アッセイ又はＰＣＲ分析を用いて検出可能なレベルの感染性海綿状脳症、ウイルスＤＮＡ又はウイルス粒子を含まない。
第２の態様では、本発明は、フィードストックからＩｇＧを精製する方法に関する。この方法は、複数のステップを含む。最初に、フィードストックのｐＨを約４．０〜５．５の範囲内（例えば、ｐＨ４．０、４．２、４．４、４．５、４．６、４．８又は５．０）に調整する。次に、ｐＨ調整フィードストックを、炭素数４〜１２のモノ又はポリアルカン酸、例えば、前記のような炭素数４〜１２、好ましくは炭素数６〜９の任意のアルカン酸と接触させる。アルカン酸はＣＡであるのが望ましい。アルカン酸がＣＡのとき、フィードストック溶液中のＣＡ濃度は、少なくとも３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％又はそれ以上であるのが望ましい。また、アルカン酸濃度はフィードストック中の総タンパク質の量に対して計算することもできる。例えば、標準的タンパク質アッセイ方法（例：Pierce Biotechnology Inc.製のＢＣＡアッセイキット又はBio-Rad製のＢｒａｄｆｏｒｄアッセイキット）を用いて、フィードストックの総タンパク質濃度を決定することができ、アルカン酸／総タンパク質の比が０．７５〜２．２５、好ましくは約１〜２．２５であるような量のアルカン酸を添加する。
アルカン酸の添加後、ＩｇＧを含む上清を沈殿物から分離する（例えば、遠心分離又は濾過により行う）。次に、ｐＨ約４．５〜約６．０、好ましくは約５．０のｐＨを有するバッファーに対して上清を透析する。バッファーはＭＯＰＳＯ及びβアラニンを含むのが望ましい。次に、膜媒介電気泳動（例えば、ＧｒａｄｉｆｌｏｗＴＭシステム）を用いて、上清からＩｇＧを分離し、精製したＩｇＧを回収する。
フィードストックは、例えば、野生型又はトランスジェニック哺乳動物（例：有蹄動物、マウス、ウマ、ブタ、ラット、及びウサギ）から取得した血漿、血清、腹水又は乳汁でありうる。好ましい有蹄動物は、ヒツジ、ウシ、ブタ、及びヤギである。一実施形態では、哺乳動物は、ヒトＩｇＧを産生するトランスジェニックウシである。フィードストックはまた、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を含む細胞培養上清からの上清であってもよい。
好ましくは、この方法により、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％以上の純度のＩｇＧの調製物が得られる。望ましくは、ＩｇＧの調製物は、５％、４％若しくは３％未満のＩｇＧ凝集体、１００、５０若しくは１０ｐｐｍ未満のウシ血清アルブミン、５００、２５０若しくは１００ｐｐｍ未満の宿主の混入タンパク質、又は５、４、３、２若しくは１ｐｐｍ未満のＤＮＡを含み、あるいは、当分野で公知の標準的検出方法、例えば、ウエスタンブロット分析、感染性アッセイ又はＰＣＲ分析を用いて検出可能なレベルの感染性海綿状脳症、ウイルスＤＮＡ又はウイルス粒子を含まない。この方法は単独で用いてもよいし、あるいは、当分野では公知の、又は本明細書に記載する他のＩｇＧ精製方法に続いて、ＩｇＧのさらなる精製のための最終仕上げ（polishing）ステップとして実施してもよい。
第３の態様では、本発明は、ヒトＩｇＧ及び非ヒトＩｇＧの両方を含むフィードストックからヒトＩｇＧを精製する方法を特徴とし、好ましくは、上記フィードストックは、ヒトＩｇＧを発現する非ヒトトランスジェニック哺乳動物から取得したものである。この方法は、複数のステップを含む。最初に、フィードストックと、リガンドとしてプロテインＡを有する少なくとも１つのアフィニティクロマトグラフィ樹脂とを、該ヒトＩｇＧが該樹脂に結合可能な条件で接触させる。プロテインＡは天然に存在するものか、又はプロテインＡの組換え形態であるのが望ましい。次に、洗浄によって樹脂から非ヒトＩｇＧを解離させるが、その際、ヒトＩｇＧは実質的に解離しないように、酸性度が高くなる洗浄バッファーの系列（例：ｐＨ７．０、６．５、６．０、５．８、５．５、５．２、５．０、４．８、４．６、４．５、４．４又は４．０）で上記クロマトグラフィ樹脂を洗浄する。樹脂は、洗浄バッファーで少なくとも１回、好ましくは少なくとも２回、最も好ましくは少なくとも３回洗浄し、その際、最初の洗浄バッファーはｐＨ約５．０〜６．０、好ましくはｐＨ約５．２であり、続く洗浄バッファーの各々は先行の洗浄バッファーより酸性度が高いｐＨを有するようにする。好ましい実施形態では、洗浄バッファーは、樹脂から２０％、１０％又は５％を超えるヒトＩｇＧを解離させないようなものとする。
樹脂を洗浄した後、ｐＨ約２．５〜３．５（例：ｐＨ２．５、３．０、３．５）の酸性ｐＨを有し、かつ洗浄バッファーのいずれより酸性度が高い溶出剤を用いて、クロマトグラフィ樹脂からヒトＩｇＧを溶出する。溶出液は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％以上の好ましい純度を有する、精製ヒトＩｇＧを含む。望ましくは、ＩｇＧの調製物は、５％、４％、３％、２％、１％若しくは０．５％未満の非ヒトＩｇＧ、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％若しくは２０％未満のキメラＩｇＧ、１００、５０若しくは１０ｐｐｍ未満のウシ血清アルブミン、５００、２５０若しくは１００ｐｐｍ未満の宿主の混入タンパク質、又は５、４、３、２若しくは１ｐｐｍ未満のＤＮＡを含み、あるいは当分野で公知の標準的検出方法、例えば、ウエスタンブロット分析、感染性アッセイ又はＰＣＲ分析を用いて検出可能なレベルの感染性海綿状脳症、ウイルスＤＮＡ又はウイルス粒子を含まない。任意により、溶出液のｐＨを中性ｐＨに調整する。
第３の態様に用いるフィードストックは、例えば、ヒトＩｇＧを発現するトランスジェニック動物（例：有蹄動物、マウス、ウマ、ブタ、ラット、及びウサギ）から取得した血漿、血清、腹水又は乳汁でありうる。好ましい有蹄動物は、ヒツジ、ウシ、ブタ、及びヤギである。一実施形態では、上記哺乳動物は、ヒトＩｇＧを産生するトランスジェニックウシである。フィードストックはまた、ヒトＩｇＧを含み、既述した本方法に従い予め精製されたもの又はその一部を含むフィードストックのいずれでもよい。
第４の態様では、本発明は、ＩｇＧ単量体を含み、かつＩｇＧ二量体若しくは凝集体、又はその両方を含みうるフィードストックからＩｇＧ単量体を精製する方法に関する。この方法の最初のステップは、フィードストックと、抗体選択性リガンドを含む少なくとも１つのクロマトグラフィ樹脂とを、ＩｇＧ二量体又は凝集体が存在する場合にはこれらと実質的に結合することなく、該ＩｇＧ単量体の少なくとも一部が該樹脂に結合可能な条件で接触させることである。抗体選択性リガンドとしては、メルカプト基及び芳香族ピリジン環（例えば、４−メルカプト−エチル−ピリジン）を有するリガンドが挙げられるが、セルロース支持体（例：Ciphergenから入手可能なＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭ、カタログ番号：12035-069、12035-010、12035-028、12035-036、12035-040 及び12035-044）も含まれる。次に、上記樹脂を中性又は酸性ｐＨ、好ましくはｐＨ約５．５〜９．０（例：ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５、８．０又は８．５）を有する少なくとも１つの洗浄バッファーで洗浄し、続いてｐＨ約３．０〜５．０（例：ｐＨ３．０，３．５、４．０、４．２、４．４、４．５、４．６、４．８又は５．０）の酸性ｐＨを有する溶出剤を用いて、上記クロマトグラフィ樹脂から上記ＩｇＧ単量体を溶出する。
精製したＩｇＧ単量体は溶出液に含まれ、望ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％以上の純度であるか、あるいはＩｇＧ二量体又は凝集体を少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％含まない。望ましくは、上記ＩｇＧの調製物は、１００、５０若しくは１０ｐｐｍ未満のウシ血清アルブミン、５００、２５０若しくは１００ｐｐｍ未満の宿主の混入タンパク質、又は５、４、３、２若しくは１ｐｐｍ未満のＤＮＡを含み、あるいは、当分野で公知の標準的検出方法、例えば、ウエスタンブロット分析、感染性アッセイ又はＰＣＲ分析を用いて検出可能なレベルの感染性海綿状脳症、ウイルスＤＮＡ又はウイルス粒子を含まない。
第４の態様に用いるフィードストックは、例えば、ＩｇＧ単量体を発現する野生型又はトランスジェニック動物（例：有蹄動物、マウス、ウマ、ブタ、ラット、及びウサギ）から取得した血漿、血清、腹水又は乳汁でありうる。好ましい有蹄動物は、ヒツジ、ウシ、ブタ、及びヤギである。一実施形態では、上記哺乳動物は、ヒトＩｇＧを産生するトランスジェニックウシであるが、既述した本方法に従い予め精製された任意のフィードストック又はそれらの一部（例えばＣＡ沈殿物）でもよい。フィードストックはまた、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を含む細胞培養上清からの上清であってもよい。さらに、フィードストックは、生産及び精製プロセスで、ＩｇＧ二量体、凝集体又はその両方が生成されるいずれのフィードストックでもよい。二量体又は凝集体の形成は、温度変化（例えば、ＩｇＧサンプルの血清の低温殺菌法）、ｐＨ、血漿分画ステップ（例えば、コーン分画）でのエタノールのような特定の化学薬品への暴露、並びに滅菌ステップでの血漿又は血清のγ線照射などの物理的条件により生じることがある。二量体又は凝集体の形成は、クロマトグラフィ樹脂に接触させる前に、少なくとも５０℃、好ましくは少なくとも５５℃、さらに好ましくは少なくとも６０℃にフィードストックを加熱することにより生じさせることができる。好ましい実施形態では、フィードストックを少なくとも３０分、好ましくは１時間、最も好ましくは２時間以上６０℃に加熱した後、冷却してから、本方法のステップ（ａ）を実施する。
第５の態様では、本発明は、ヒトＩｇＧを発現するトランスジェニック非ヒト宿主から取得したフィードストック（例えば、血漿、血清、腹水若しくは乳汁）又はトランスジェニック有蹄動物から取得し、前記の方法について記載したようにＣＡで処理したフィードストックからヒトＩｇＧを精製する方法に関する。好ましい有蹄動物は、ヒツジ、ウシ、ブタ、及びヤギである。一実施形態では、哺乳動物はヒトＩｇＧを産生するトランスジェニックウシである。本方法は複数のステップを含む。本方法の最初のステップは、フィードストックと、ヒトＩｇＧに対するアフィニティを有する少なくとも１つのクロマトグラフィ樹脂とを、ヒトＩｇＧが該樹脂に結合可能な条件で接触させることを含む。次に、上記樹脂から非ヒトＩｇＧの解離を可能にするが、ヒトＩｇＧを有意に解離しない少なくとも１つのバッファー（例えば、ｐＨ約７．０、６．５、６．０、５．８、５．５、５．２、５．０、４．８、４．６、４．５、４．４、若しくは４．０の酸性ｐＨを有するバッファー）で上記樹脂を洗浄する。上記樹脂は、洗浄バッファーで少なくとも１回、好ましくは少なくとも２回、最も好ましくは少なくとも３回洗浄し、その際、最初の洗浄バッファーはｐＨ約５．０〜６．０、好ましくはｐＨ約５．２を有する。好ましい実施形態では、洗浄バッファーのｐＨを洗浄毎に低くしていくことにより、樹脂から２０％、１０％又は５％を超えるヒトＩｇＧが解離しないようにする。次に、ｐＨ約２．５〜３．５（例：ｐＨ２．５、３．０、３．５）の酸性ｐＨを有する溶出剤を用いて、上記樹脂からヒトＩｇＧを溶出した後、任意により、中性ｐＨに調整する。この溶出液と、リガンドとして抗宿主ＩｇＧを含む少なくとも１つのアフィニティクロマトグラフィ樹脂とを、非ヒトＩｇＧの少なくとも一部が該樹脂に結合可能な条件で接触させた後、精製ヒトＩｇＧを含むフロースルーを回収する。得られるヒトＩｇＧは、好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％以上の純度であるか、あるいは、非ヒトＩｇＧ、キメラＩｇＧ又はその両方を少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％以上含まない。非ヒト又はキメラＩｇＧは、任意により溶出剤を用いて樹脂から除去してもよい。
あるいは、第５の態様の精製ステップを逆にしてもよく、これによって、本方法の最初のステップは、前記フィードストックと、リガンドとして抗宿主ＩｇＧを含む少なくとも１つのアフィニティクロマトグラフィ樹脂とを、非ヒトＩｇＧが該樹脂に結合可能な条件で接触させた後、精製ヒトＩｇＧを含むフロースルーを回収することを含む。次に、上記フロースルーと、ヒトＩｇＧに対するアフィニティを有する少なくとも１つのクロマトグラフィ樹脂とを、ヒトＩｇＧが該樹脂に結合可能な条件で接触させる。続いて、上記樹脂から非ヒトＩｇＧの解離を可能にするが、ヒトＩｇＧを有意に解離しない少なくとも１つのバッファー（例えば、ｐＨ約７．０、６．５、６．０、５．８、５．５、５．２、５．０、４．８、４．６、４．５、４．４又は４．０の酸性ｐＨを有するバッファー）で上記樹脂を洗浄する。この樹脂は、ｐＨ約４．０〜６．０を有する洗浄バッファーで少なくとも１回、好ましくは少なくとも２回、最も好ましくは少なくとも３回洗浄するが、その際、ｐＨ約５．２を有するバッファーで開始するのが好ましい。好ましい実施形態では、洗浄バッファーのｐＨを洗浄毎に低くしていくことにより、上記樹脂から２０％、１０％又は５％を超えるヒトＩｇＧが解離しないようにする。次に、ｐＨ約２．５〜３．５（例：ｐＨ２．５、３．０、３．５）の酸性ｐＨを有する溶出剤を用いて、上記樹脂からヒトＩｇＧを溶出した後、任意により、中性ｐＨに調整する。
これら別の実施形態の各々の望ましい実施形態では、抗宿主ＩｇＧリガンドは、例えば、ウマ抗ウシＩｇＧ又は非ヒト宿主のＩｇＧ重鎖又は軽鎖に特異的なリガンドである。望ましくは、上記リガンドは、ＶＨＨリガンドであり、これは、所望であれば、米国特許出願公開第２００３００７８４０２号、並びに米国特許第６，３９９，７６３号及び第６，６７０，４５３号に記載されている方法により作製することができる。クロマトグラフィ樹脂は本明細書に記載した樹脂のいずれでもよい。ヒトＩｇＧに対するアフィニティを有する好適な樹脂としては、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、４−メルカプト−エチル−ピリジン又は抗ヒトＩｇＧ抗体（例えば、ウマ抗ヒトＩｇＧ若しくはラマ抗ヒトＩｇＧ）を含む樹脂が挙げられる。リガンドは、天然に存在するタンパク質又は組換え若しくは合成により作製したリガンドのいずれでもよい。
好ましくは、いずれの別の実施形態の場合でも、本方法により、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％以上の純度のＩｇＧの調製物が得られる。望ましくは、ＩｇＧの調製物は、５％、４％、３％、２％、１％若しくは０．５％未満の非ヒトＩｇＧ、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％若しくは２０％未満のキメラＩｇＧ、１００、５０若しくは１０ｐｐｍ未満のウシ血清アルブミン、５００、２５０若しくは１００ｐｐｍ未満の宿主の混入タンパク質、又は５、４、３、２若しくは１ｐｐｍ未満のＤＮＡを含み、あるいは、当分野で公知の標準的検出方法、例えば、ウエスタンブロット分析、感染性アッセイ又はＰＣＲ分析を用いて検出可能なレベルの感染性海綿状脳症、ウイルスＤＮＡ又はウイルス粒子を含まない。
第６の態様では、本発明は、ヒトＩｇＧを発現するトランスジェニック非ヒト宿主から取得したフィードストック（例えば、トランスジェニック有蹄動物から取得し、前記の方法について記載したようにＣＡで処理した血漿、血清、腹水又は乳汁）からヒトＩｇＧを精製する方法に関する。好ましい有蹄動物は、ヒツジ、ウシ、ブタ及びヤギである。一実施形態では、哺乳動物は、ヒトＩｇＧを産生するトランスジェニックウシである。本方法は複数のステップを含む。本方法の最初のステップは、フィードストックと、非ヒト宿主のＩｇＧ重鎖又は軽鎖に特異的な少なくとも１つのリガンドを有する少なくとも１つのクロマトグラフィ樹脂とを、非ヒト宿主のＩｇＧ重鎖又は軽鎖が、上記リガンドを有するクロマトグラフィ樹脂に結合可能な条件で接触させることを含む。望ましくは、上記リガンドは、ＶＨＨリガンドであり、これは、所望であれば、米国特許出願公開第２００３００７８４０２号、並びに米国特許第６，３９９，７６３号及び第６，６７０，４５３号に記載されている方法により作製することができる。クロマトグラフィ樹脂は本明細書に記載した樹脂のいずれでもよい。望ましくは、クロマトグラフィ樹脂は小さなリガンドの固定化に適している（例えば、樹脂ＮＨＳ活性化ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（６−アミノヘキサン酸で活性化することにより、活性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを形成する；Amersham Biosciences）。アフィニティクロマトグラフィ樹脂からのフロースルーは精製ヒトＩｇＧを含むが、非ヒト宿主ＩｇＧ及びキメラヒト／非ヒト宿主ＩｇＧはアフィニティクロマトグラフィ樹脂のリガンドに結合する。非ヒト宿主は、有蹄動物、マウス、ウマ、ブタ、ラット又はウサギでありうる。好ましい有蹄動物は、ヒツジ、ウシ、ブタ、及びヤギである。
好ましくは、本方法により、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％以上の純度のＩｇＧの調製物が得られる。望ましくは、ＩｇＧの調製物は、５％、４％、３％、２％、１％若しくは０．５％未満の非ヒトＩｇＧ、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％若しくは２０％未満のキメラＩｇＧ、１００、５０若しくは１０ｐｐｍ未満のウシ血清アルブミン、５００、２５０若しくは１００ｐｐｍ未満の宿主の混入タンパク質、又は５、４、３、２、若しくは１ｐｐｍ未満のＤＮＡを含み、あるいは、当分野で公知の標準的検出方法、例えば、ウエスタンブロット分析、感染性アッセイ又はＰＣＲ分析を用いて検出可能なレベルの感染性海綿状脳症、ウイルスＤＮＡ又はウイルス粒子を含まない。
前記方法のいずれかを、本明細書に記載した膜媒介電気泳動と組み合わせることにより、さらにＩｇＧを精製することもできる。
第７の態様では、本発明は、非ヒトトランスジェニック宿主からのフィードストックを用いて作製される精製ヒトＩｇＧの調製物に関する。望ましくは、この調製物のヒトＩｇＧと宿主ＩｇＧの比は少なくとも２：１、１０：１又は１００：１である。好ましい実施形態では、上記調製物は、本発明の方法のいずれを用いても調製することができる。非ヒト宿主は、有蹄動物、マウス、ウマ、ブタ、ラット又はウサギでありうる。好ましい有蹄動物は、ヒツジ、ウシ、ブタ、及びヤギである。
第８の態様では、本発明は、５％、４％、３％、２％、１％若しくは０．５％未満の非ヒトＩｇＧ、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％若しくは２０％未満のキメラＩｇＧ、１００若しくは５０ｐｐｍ未満のウシ血清アルブミン、５００、２５０若しくは１００ｐｐｍ未満の宿主の混入タンパク質、又は５、４、３、２若しくは１ｐｐｍ未満のＤＮＡを含む、非ヒトトランスジェニック宿主からのフィードストックを用いて作製される精製ヒトＩｇＧの調製物に関する。
第９の態様では、本発明は、当分野で公知の標準的検出方法（例えば、ウエスタンブロット分析）を用いて検出可能なレベルの感染性海綿状脳症を含まない、あるいは当分野で公知の標準的検出方法（例えば、感染性アッセイ又はＰＣＲ分析）を用いて検出可能なウイルスＤＮＡ又はウイルス粒子を含まない、非ヒトトランスジェニック宿主からのフィードストックを用いて作製される精製ヒトＩｇＧの調製物に関する。
第８及び第９の態様の好ましい実施形態では、上記フィードストックは、例えば、野生型又はトランスジェニック哺乳動物（有蹄動物、マウス、ウマ、ブタ、ラット、及びウサギ）から取得した血漿、血清、腹水又は乳汁でありうる。好ましい有蹄動物は、ヒツジ、ウシ、ブタ、及びヤギである。一実施形態では、非ヒトトランスジェニック宿主は、ヒトＩｇＧを産生するトランスジェニックウシである。
「アフィニティクロマトグラフィ」とは、所望の成分（例えば、免疫グロブリン）と特異的に結合又は相互作用する天然又は合成化合物の使用を意味し、その際、これは、該成分を単離、精製又は除去する目的で支持体又は樹脂に固定化する。クロマトグラフィ試薬はカラム又は樹脂として公知である。本発明においてアフィニティクロマトグラフィ樹脂は、フィードストック中のＩｇの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％に結合する。免疫グロブリンのアフィニティクロマトグラフィに用いられる化合物の非限定的な例を本発明に記載するが、例えば、以下のような天然のタンパク質が挙げられる：黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から得られるプロテインＡ、ストレプトコッカス・エスピー（Streptococcus sp.）からのプロテインＧ、及びペプトストレプトコッカス・マグヌス（Peptostreptococcus magnus）からのプロテインＬ、それらの組換え型、又は特異的に免疫グロブリンを認識することが証明された合成ペプチド。免疫グロブリンに対するアフィニティを有する抗体選択性リガンドの一例は、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭの名称でCiphergenから入手可能な４−メルカプト−エチル−ピリジンである。４−メルカプト−エチル−ピリジンは、疎水性テイルと、生理学的ｐＨで非荷電かつ疎水性のイオン性頭部基を有する。酸性ｐＨ条件下で、リガンドは、ＩｇＧと同様に、正電荷を帯びるため、静電反発が起こり、ＩｇＧの解離を引き起こす。抗体選択性リガンドのもう一つの例として、２−メルカプト−５−ベンズイミダゾールスルホン酸が挙げられ、これは、ＭＢＩ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭの名称でCiphergenから入手可能である。２−メルカプト−５−ベンズイミダゾールスルホン酸は、推奨される吸着ｐＨ（５．０〜５．５）の範囲で負電荷を帯びる芳香環に存在するスルホン酸基を有する。このとき、ＩｇＧはｐＨの関数としてアルブミンから分離する。従って、塩基性ｐＨの溶出剤を用いて、ＩｇＧを溶出することができる。
「カプリル酸」又は「ＣＡ」は、炭素数８の中鎖飽和脂肪酸であるカルボン酸であり、オクタン酸としても知られている。カプリル酸塩又はカプリル酸ナトリウムは、この酸のイオン化した形態を意味し、ＣＡの供給源として用いることができる。この形態も用語「カプリル酸」又は「ＣＡ」に包含される。
「フィードストック」とは、化学的又は生化学的プロセスに用いられる原料を意味する。
「免疫グロブリン」又は「Ｉｇ」は、免疫系において受容体及びエフェクターとして作用し、構造的には、抗原認識のための可変領域、ヒンジ領域及びエフェクター機能のための定常領域から構成されるタンパク質のクラスを意味する。免疫グロブリンは典型的には、Ｂ細胞の抗原刺激時に分泌される体液性免疫のタンパク質媒介因子として働く。５つの免疫グロブリンイソタイプ、すなわちＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ及びＩｇＤがある。これらのうち、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＭは血清中に存在する免疫グロブリンの９５％を構成する。「非ヒト免疫グロブリン」は、ヒト以外の動物、好ましくは哺乳動物に由来する免疫グロブリンを意味する。「キメラ免疫グロブリン」とは、少なくとも２つの異なる種に由来する領域（例えば、可変、ヒンジ又は定常）から構成される免疫グロブリンを意味する。一例では、キメラ免疫グロブリンは、１つの種（例えば、ヒト又はウシ）由来の重鎖と、別の種（例えば、ヒト又はウシ）由来の軽鎖を有する。別の例では、重鎖又は軽鎖の一部だけ（例えば、可変又は定常領域）が、残りの免疫グロブリン分子とは異なる種に由来するものである。キメラ免疫グロブリンは、遺伝子工学又は突然変異により作製することもできるし、あるいはトランスジェニック動物において生産することもできる。
「ｐＨ」は、溶液の酸性又は塩基性の尺度を意味する。ｐＨは水素イオン濃度（モル／Ｌ）の対数に負号を付けたものとして定義する。すなわち、ｐＨ＝−ｌｏｇ１０［Ｈ＋］である。ｐＨ約７．０が中性であり、７．０より低いｐＨを酸性、また７．０より高いｐＨを塩基性とみなす。本発明の目的のために、ｐＨ６．０〜７．０を中性又は弱い酸性とみなすと同時に、ｐＨ７．０〜８．５を中性又は弱い塩基性とみなすことができる。
本明細書で用いる「精製（された）」及び「精製すること」という用語は、フィードストックからの成分（例えば、混入物、タンパク質又はウイルス粒子）の除去を意味する。例えば、免疫グロブリンは、混入非免疫グロブリンタンパク質の除去により精製することができ、また、ＩｇＧ以外の免疫グロブリンの除去により精製することもできる。非免疫グロブリンタンパク質の除去及び／又はＩｇＧ以外の免疫グロブリンの除去により、フィードストックにおける所望のＩｇＧの比率が増加する。純度は、当分野で公知の又は本明細書に記載する標準的アッセイにより測定することができ、その例として、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いてクーマシーブルー染色を実施するもの、並びにクロマトグラフィ方法（例えば、ＨＰＬＣ装置でのサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ））が挙げられる。ＩｇＧサンプルの純度は、Ｋｏｄａｋ Ｉｍａｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ １０００又は同等のシステムを用いたスキャニングの後ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルから算出するか、あるいはＳｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣ装置でのソフトウエアによるＳＥＣクロマトグラムの分析により求めることができる。サンプルは、それが所望の物質（例えば、免疫グロブリン）以外の成分を少なくとも９０％、９５％又は９９％含んでいない場合に純粋とみなされる。
「膜媒介電気泳動」とは、複合生物学的サンプルから高分子を分離する方法を意味し、これは、選択した孔径の膜を用いて、電荷若しくは大きさ又はその両方に基づき分子を分離することを含む。膜媒介電気泳動に用いられる器機には、典型的には分離ユニットが含まれ、これは、電極間に配置されたカートリッジ構造の膜から構成される。これらの膜を積層して、多数の流路（平行に循環する）を有するカートリッジを形成することができる。膜及び流路に対して電界を印加すると、荷電分子は流路間を反対の電荷の電極に向かって移動する。膜の分子量カットオフ及びバッファー系のｐＨにより、電荷若しくは大きさ又はその両方に基づき所望の高分子を分離することが可能になる。
「ＶＨＨリガンド」とは、ラクダ科の動物由来の単一ドメイン重鎖抗体、又は抗体フラグメントを意味する。一般に、ＶＨＨリガンドは、天然に軽鎖を欠失した免疫グロブリン由来の重鎖を有し、これは互いに結合して、多価の単一ポリペプチドを形成し、このポリペプチドは、親分子全免疫グロブリンの抗原結合アフィニティを保持するが、大きさははるかに小さいため、免疫原性が低い。ＶＨＨリガンドについては、例えば、以下に挙げる文献に詳細に記載されている：Frenkenら、J. Biotechnol. 78:11-21 (2000), van der Lindenら、Biochem Biophys. Acta. 1431: 37-46 (1999)、Spinelliら、Biochemistry 39:1217-1222 (2000)、米国特許出願公開第２００３００７８４０２号、並びに米国特許第６，３９９，７６３号及び第６，６７０，４５３号。
本発明のその他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明、及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
本発明者らは、野生型又はトランスジェニック動物の体液、例えば、血漿、血清、腹水又は乳汁、あるいはポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を含む細胞培養上清から免疫グロブリンを精製するための改善された方法を見い出した。これらの方法は、従来の技術と比較して、効率、収率、及び免疫グロブリンの純度に関して有意な改善をもたらす。上記方法は、非ＩｇＧタンパク質、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、宿主の混入タンパク質、ウイルスＤＮＡ、ウイルス粒子、感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）、ＩｇＧ二量体又はＩｇＧ凝集体の混入を最小限にしながら、ヒトＩｇＧを精製するのに特に有用である。本明細書に記載する方法により精製したヒトＩｇＧは、治療、診断又は研究目的に用いることができる。記載する方法のうち３つは、非ヒト宿主のタンパク質の特異的除去により、トランスジェニック宿主において産生されたヒトＩｇＧを精製し、これによって宿主のＩｇＧが混入したとしても、そのレベルが低い精製ヒトＩｇＧが得られるように設計されている。本方法はまた、ＩｇＧ二量体及び凝集体を特異的に除去することにより、治療、診断又は研究目的に有用な、高度に精製されたＩｇＧの調製物が得られるように設計することもできる。本方法を単独で用いた場合でもそれぞれＩｇＧの精製に有効であるが、所望であれば、ＩｇＧのさらなる精製のために本明細書に記載した別の方法（又はその一部）のいずれかと組み合わせて用いることもできる。
本方法は以下のようにおおまかにまとめることができる：
（Ｉ）沈殿剤としてモノ又はポリアルカン酸（例えば、ＣＡ）を用いた後、ＩｇＧに対するアフィニティを有する樹脂を用いてクロマトグラフィを実施してＩｇＧを精製する方法。
（Ｉ）沈殿剤としてモノ又はポリアルカン酸（例えば、ＣＡ）を用いた後、ＩｇＧに対するアフィニティを有する樹脂を用いてクロマトグラフィを実施してＩｇＧを精製する方法。
（ＩＩ）沈殿剤としてモノ又はポリアルカン酸（例えば、ＣＡ）を用いて、ＩｇＧを精製した後、膜媒介電気泳動により精製ＩｇＧを分離する方法。
（ＩＩＩ）アフィニティクロマトグラフィを用いて、ヒト及び非ヒトＩｇＧを含むフィードストックからヒトＩｇＧを精製した後、洗浄毎に酸性度が増すバッファーで段階的な洗浄を実施することにより、ヒトＩｇＧから非ヒトＩｇＧ又はキメラＩｇＧを分離する方法。
（ＩＶ）示差的なｐＨによる洗浄及びＩｇＧ単量体に対するアフィニティを有するクロマトグラフィ樹脂を用いて、ＩｇＧ単量体を精製し、ＩｇＧ二量体及び／又はＩｇＧ凝集体を除去又は低減する方法。
（Ｖ）抗ヒトＩｇＧアフィニティクロマトグラフィ樹脂を用いて、ヒトＩｇＧ、非ヒトＩｇＧ、及び／又はキメラＩｇＧを含む非ヒト宿主フィードストックからヒトＩｇＧを精製した後、非ヒトＩｇＧの解離を引き起こすバッファーで洗浄することにより、ヒトＩｇＧから非ヒトＩｇＧ又はキメラＩｇＧを分離し、次に、抗宿主ＩｇＧアフィニティクロマトグラフィ樹脂（例えば、ＶＨＨリガンドを有する樹脂）を用いて、非ヒトＩｇＧ又はキメラＩｇＧをさらに除去する方法。あるいは、アフィニティクロマトグラフィステップを逆にして、最初に、抗宿主ＩｇＧアフィニティクロマトグラフィ樹脂（例えば、ＶＨＨリガンドを有する樹脂）を用いて、非ヒトＩｇＧを除去し、次に、抗ヒトＩｇＧアフィニティクロマトグラフィ樹脂を用いて、ヒトＩｇＧを精製した後、該抗ヒトＩｇＧアフィニティクロマトグラフィ樹脂からヒトＩｇＧを溶出することもできる。
（ＶＩ）抗宿主ＩｇＧリガンド、例えば、ＶＨＨリガンドを用いて、ヒトＩｇＧ及び非ヒトＩｇＧを含むフィードストックからヒトＩｇＧを精製する方法。
前記方法はすべて、単独で用いてもよいし、あるいは任意の組合せで用いてもよい。前記方法を組み合わせて用いる場合には、これら方法の各々のステップをすべて含む必要はなく、本明細書に記載する方法のいずれかから任意のステップを組み合わせることができる。
以下に示す一般的パラメーターは、本発明の方法を実施する上で有用である。これらは指針として提供するものであり、限定的に解釈すべきではない。
フィードストック
本明細書に記載する免疫グロブリンの精製方法は、野生型及びトランスジェニック動物などのあらゆる動物に由来するフィードストックで用いることができる。好ましいフィードストックとしては、血漿、血清、乳汁、腹水のような任意の体液、又はコーン画分のようなＩｇＧ含有供給源が挙げられる。好ましい動物としては、哺乳動物、例えば、有蹄動物、ヒト、マウス、ウマ、ブタ、ラット、及びウサギが挙げられる。好ましい有蹄動物は、ヒツジ、ウシ、ブタ、及びヤギである。好ましくは、動物は、ヒトＩｇＧを生産するのに用いることができるトランスジェニック動物である。最も好ましいフィードストックは、ヒトＩｇＧを産生するトランスジェニックウシからの血漿又は血清である。
本明細書に記載する免疫グロブリンの精製方法は、野生型及びトランスジェニック動物などのあらゆる動物に由来するフィードストックで用いることができる。好ましいフィードストックとしては、血漿、血清、乳汁、腹水のような任意の体液、又はコーン画分のようなＩｇＧ含有供給源が挙げられる。好ましい動物としては、哺乳動物、例えば、有蹄動物、ヒト、マウス、ウマ、ブタ、ラット、及びウサギが挙げられる。好ましい有蹄動物は、ヒツジ、ウシ、ブタ、及びヤギである。好ましくは、動物は、ヒトＩｇＧを生産するのに用いることができるトランスジェニック動物である。最も好ましいフィードストックは、ヒトＩｇＧを産生するトランスジェニックウシからの血漿又は血清である。
本発明の方法を用いて、細胞培養上清からのＩｇＧ（例えば、ハイブリドーマ細胞系からのモノクローナルＩｇＧ）を精製する、あるいはＩＶＩＧのような免疫グロブリンのサンプルからの所望のＩｇＧをさらに精製することができる。
本発明の方法は、不要なＩｇＧ凝集体、宿主の種由来のＩｇＧ、ＢＳＡ、ウシ胎仔血清、宿主の混入タンパク質、ウイルス及びＴＳＥを除去するのに特に有用である。
反応条件
本発明者らは、低いｐＨ条件で、沈殿剤として高濃度のモノ又はポリアルカン酸（例えば、ＣＡ）を用いた後にアフィニティクロマトグラフィステップを組み合わせると、動物の血漿又は血清のような様々なフィードストックからのＩｇＧの効率的な精製が可能になり、しかも、高収率の精製ＩｇＧが得られることを見い出した。ＣＡ沈殿のために、フィードストックは一般にｐＨ約４．０〜５．０に調整する。フィードストックを好適なバッファー（例えば、酢酸ナトリウムを含むバッファー、ｐＨ４．０）で希釈してから、サンプルを所望のｐＨに調整することができる。また、フィードストックを希釈せずに、フィードストックのｐＨを直接調整することもできる。
本発明者らは、低いｐＨ条件で、沈殿剤として高濃度のモノ又はポリアルカン酸（例えば、ＣＡ）を用いた後にアフィニティクロマトグラフィステップを組み合わせると、動物の血漿又は血清のような様々なフィードストックからのＩｇＧの効率的な精製が可能になり、しかも、高収率の精製ＩｇＧが得られることを見い出した。ＣＡ沈殿のために、フィードストックは一般にｐＨ約４．０〜５．０に調整する。フィードストックを好適なバッファー（例えば、酢酸ナトリウムを含むバッファー、ｐＨ４．０）で希釈してから、サンプルを所望のｐＨに調整することができる。また、フィードストックを希釈せずに、フィードストックのｐＨを直接調整することもできる。
好適なモノ又はポリアルカン酸には、一般に式ＣｎＨ２ｎＯ２を有し、炭素数４〜１２、好ましくは６〜９のアルカン酸が含まれる。非限定的な例を以下に挙げる：ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸（ＣＡとしても知られる）、ノナン酸、デカン酸、（ｚ）−ヘクス−２−エン酸、６−メチルヘプタン酸、３−クロロペンタン酸、ヘキサン二酸、６−ヒドロキシ−４−オキソノナン酸。望ましくは、アルカン酸はＣＡである。非分枝アルカン酸が好ましいが、分枝アルカン酸を用いることもできる。
本発明の方法の沈殿ステップに用いるアルカン酸（例えば、ＣＡ）は、３％〜１０％の範囲内の濃度でよい。好ましい濃度としては、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％及び１０％が挙げられる。本発明の方法の沈殿ステップに用いるアルカン酸（例えば、ＣＡ）の濃度は、フィードストックの総タンパク質濃度を計算し、アルカン酸／総タンパク質の比が０．７５〜２．２５、好ましくは１〜２．２５に等しくなるのに十分な量のアルカン酸（例えば、ＣＡ）を添加することにより、決定することができる。
ＣＡ沈殿後、遠心分離又は濾過のような当分野で公知の標準的方法を用いて、上清から沈殿物を除去する。一例では、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ−５Ｂ遠心機を備えるＧＳ３又はＧＳＡローターを用いて、６０００ｒｐｍ及び２０℃で３０分の遠心分離により沈殿した物質を除去することができる。別の例では、Pall Life Sciences製のデプスフィルターデバイス及びAdvanced Minerals Corp製のセルピュア（Ｃｅｌｐｕｒｅ）のような濾過助剤を用いた濾過により沈殿した物質を除去することができる。沈殿物の除去後、上清のｐＨを、続くアフィニティクロマトグラフィに最適な範囲に調整することができる。ｐＨ範囲は用いるアフィニティクロマトグラフィ樹脂の具体的要件に応じて変動するが、典型的にはｐＨ約５．０〜８．５（例えば、ｐＨ５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０又は８．５）である。
ｐＨの調整後さらなる濾過又は遠心分離ステップを加えることにより、さらなる沈殿物を除去することができる。ＢＳＡ、宿主の混入タンパク質、及びウイルスの除去に有用なフィルターの非限定的な例はデプスフィルターであり、これは、典型的に、フィルターマトリックス内に粒子を保持する設計を特徴とする。濾過性能を高めるために濾過器機と一緒に用いられる無機鉱物粉末又は有機繊維材料であるフィルター助剤の非限定的例としては、珪藻土、パーライト、及びセルロースが挙げられる。本発明の方法に有用なフィルター助剤の好ましい一例はＣｅｌｐｕｒｅ １０００（Advanced Minerals Corporation）である。
濾過又は遠心分離の後、固体支持体に共有結合したＩｇＧに対するアフィニティを有するリガンドを含むアフィニティクロマトグラフィ樹脂に上清を添加する（以下参照）。樹脂は製造者の指示に記載されている通りに用意し、上清の添加後、使用した特定のリガンド／樹脂に関する製造者の指示に記載通りに該樹脂を洗浄するか、あるいは、本明細書に記載する特定の方法の場合には、低ｐＨバッファーの系列を用いて洗浄する。本発明者らは、低ｐＨバッファー洗浄液の使用が、樹脂に結合したヒトＩｇＧを有意に解離することなく、プロテインＡ樹脂からウシＩｇＧを解離する有効な方法であることを見い出した。低ｐＨバッファーのｐＨ範囲は、約４．０〜７．０の範囲内でよく、好ましくは、ｐＨ４．０、４．２、４．４、４．４６、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．２、５．５、６．０、６．５、７．０である。低ｐＨバッファーの場合、バッファーのｐＨを下げながら（例えば、ｐＨ５．２、次にｐＨ４．８、そしてｐＨ４．４６など）、上記樹脂を洗浄するのが好ましい。
洗浄後、使用した特定のアフィニティクロマトグラフィ樹脂に適した溶出バッファーを用いて、アフィニティクロマトグラフィ樹脂からＩｇＧを溶出する。一例では、ｐＨ３．０のバッファーを用いて、プロテインＡに基づく樹脂からＩｇＧを溶出する。別の例では、ｐＨ３．０〜４．５のバッファーを用いて、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭ樹脂からＩｇＧを溶出する。好ましい実施形態では、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭ樹脂に用いる溶出バッファーのｐＨは４．４である。
抗非ヒト宿主のアフィニティクロマトグラフィを用いた、非ヒトＩｇＧ及びヒト／非ヒトキメラＩｇＧの除去に関する方法（例えば、前記５番及び６番の方法）の場合、第１アフィニティクロマトグラフィ樹脂からの溶出液のｐＨをｐＨ７．０〜８．５、最も好ましくは７．０、７．５、８．０又は８．５に調整する。次に、このｐＨ調整溶出液を、抗宿主ＩｇＧに基づく樹脂に添加する。フロースルーはヒトＩｇＧを含むのに対し、非ヒトＩｇＧ及びキメラＩｇＧは樹脂に結合したままであり、所望であれば、前記のようにこれを酸性バッファーにより溶出することができる。
非ヒト宿主に特異的なリガンドを用いた、非ヒトＩｇＧ及びヒト／非ヒトキメラＩｇＧの除去に関する方法（例えば、前記５番及び６番の方法）の場合、リガンドをマトリックスに固定化して用いることにより、非ヒトＩｇＧ又はヒト／非ヒトキメラＩｇＧに選択的に結合し、これらを除去する。この手法は、完全にヒトのＩｇＧ重鎖又は軽鎖ドメインとの交差反応が最小か又は全くない非ヒトＩｇＧ重鎖又は軽鎖に特異的なリガンドを用いる必要がある。リガンドの例として、ＶＨＨリガンド、例えば、米国特許出願公開第２００３００７８４０２号、並びに米国特許第６，３９９，７６３号及び第６，６７０，４５３号に記載されている方法により作製されるものがある。これらの特許には、ラクダ属（ラクダ及びラマ）抗体の可変領域を用いたファージディスプレイライブラリスクリーニング方法が記載されている。ラクダ抗体は、１クラスが軽鎖を全く含まないという点で例外的であり、重鎖可変領域だけ（ＶＨＨドメインと呼ぶ）のファージディスプレイライブラリにおいて、抗原結合多様性のすべてを捕獲することができる。こうして得られる小さな一本鎖タンパク質（約１２ｋＤ）は、ＶＨＨリガンドとして知られ、結合特性に関して、全抗体と極めて類似した機能を果たす。次に、アフィニティクロマトグラフィ樹脂、例えば、以下に説明するクロマトグラフィ樹脂のいずれかに、上記ＶＨＨリガンドを固定化して用いることにより、非ヒト宿主ＩｇＧ又はヒト／非ヒト宿主キメラＩｇＧを除去する。１つの好ましいクロマトグラフィ樹脂は、ＮＨＳ活性化ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗである。
当分野で公知の標準的方法及び試薬を用いて、本発明の方法に用いるバッファーを調製する。バッファー成分の非限定的な例として、酢酸、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、トリスＨＣｌ、トリス塩基、グリシン、炭酸ナトリウム及びリン酸ナトリウムが挙げられる（バッファー及びバッファー成分の一般的なリストについては、Sambrook、Fritsch、及びManiatis (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press参照）。
精製ＩｇＧサンプルの収率及び純度は、当分野で公知のアッセイを用いて測定することができる。タンパク質純度を決定する方法の非限定的な例として、ウエスタンブロット分析、サイズ排除クロマトグラフィ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離後にクーマシーブルー又は銀染色を行なう方法などが挙げられる。当分野で公知のアッセイを用いて収率を測定する。タンパク質収率を決定する方法の非限定的例は、例えば、McKinney及びParkinson（前掲）に見い出すことができる。
クロマトグラフィ
クロマトグラフィ、特にアフィニティクロマトグラフィを用いて、所望のＩｇＧをさらに精製することができる。好ましいアフィニティクロマトグラフィ樹脂は、少なくとも１つのＩｇＧ又はＩｇＧの一部と非共有結合することができる任意のリガンド又は化合物を含み、該リガンド又は化合物はクロマトグラフィ支持体に固定化される。
クロマトグラフィ、特にアフィニティクロマトグラフィを用いて、所望のＩｇＧをさらに精製することができる。好ましいアフィニティクロマトグラフィ樹脂は、少なくとも１つのＩｇＧ又はＩｇＧの一部と非共有結合することができる任意のリガンド又は化合物を含み、該リガンド又は化合物はクロマトグラフィ支持体に固定化される。
リガンドは、ＩｇＧの少なくとも一部に特異的なアフィニティを有する、天然に存在するタンパク質、天然に存在するタンパク質の組換え形態、合成タンパク質、組換えタンパク質、又は化合物としうる。以下にＩｇＧのアフィニティクロマトグラフィに用いられる好ましいリガンドの例を列挙する。これらは例として示すにすぎず、本発明を何ら限定する意図はない。
プロテインＡは、黄色ブドウ球菌に由来し、ＩｇＧのＦｃフラグメントに対し強く、かつ特異的なアフィニティを有し、ＩｇＧを精製するためのアフィニティリガンドとして用いられている。プロテインＡは、非常に多種の固体支持体材料、例えば、クロマトグラフィビーズ及び膜に固定化することができる。
プロテインＧも同様にアフィニティリガンドとして用いられている。Bjorckら、J. Immunol., 133:969 (1984)を参照されたい。プロテインＧも免疫グロブリンのＦｃフラグメントと相互作用し、クラス１のＩｇＧ抗体を単離する上で特に有効である。
近年、免疫グロブリンを精製するのに有効なアフィニティリガンドとして第３のタンパク質が同定された。このタンパク質は、ペプトストレプトコッカス・マグヌス由来のプロテインＬである。プロテインＬは、プロテインＡ及びプロテインＧとは対照的に、抗原結合部位を妨害することなく、ＩｇＧ抗体の軽鎖と特異的に相互作用する。この特異性により、プロテインＬは、ＩｇＧクラスの抗体とだけではなく、ＩｇＡ及びＩｇＭクラスの抗体とも複合体を形成することができる。
抗抗体も、ＩｇＧの精製に用いられる別のタイプのアフィニティリガンドである。
前記のようなタンパク質に基づくアフィニティリガンドのほかにも、免疫グロブリンの精製に用いられてきた多数の低分子量擬性バイオアフィニティ（すなわち、特異性の低い）リガンドがある。ヒスチジン、ピリジン、及び関連化合物は、抗体精製に一般に用いられる１タイプの擬性バイオアフィニティリガンドである。例えば、Huら、J. Chromatogr. 646:31-35 (1993)；El-Kakら、J. Chromatogr. 604:29-37 (1992)；Wuら、J. Chromatogr., 584:35-41 (1992)；El-Kakら、J. Chromatogr. 570:29-41 (1991)；並びに米国特許第５，１８５，３１３号；第５，１４１，９６６号；第４，７０１，５００号；及び第４，３８１，２３９号を参照されたい。
チオフィリック化合物も別のクラスの擬性バイオアフィニティリガンドである。１タイプのチオフィリック化合物を用いた吸着剤がPorathら、FEBS Lett. 185:306 (1985)により開示されている。このタイプの吸着剤は、ヒドロキシル又はチオールのいずれかを含有する支持体をまずジビニルスルホン、次にメルカプトエタノールと反応させることにより調製する。上記吸着剤は、塩促進手法を利用して、免疫グロブリンを吸着する。吸着された免疫グロブリンの溶出は、塩濃度を下げる、及び／又はｐＨを変更することにより実施する。
抗体を吸着することができる別のタイプの擬性バイオアフィニティ吸着剤は、そのリガンドとしてメルカプトピリジンを用いる。Oscarssonら、J. Chromatogr. 499:235-247 (1990)を参照。このタイプの吸着剤は、例えば、メルカプトピリジンと、適切に活性化させた固体支持体とを反応させることにより作製する。こうして形成された吸着剤は、高塩濃度条件で抗体を吸着することができる。
抗体を吸着することができる擬性バイオアフィニティ吸着剤の一例は、そのリガンドとして４−メルカプト−エチル−ピリジンを用いるものであり、これはまた、セルロース支持体を含んでいてもよい（例：ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭ）。
チオフィリック化合物を用いた別の擬性バイオアフィニティ吸着剤が以下の特許及び刊行物に記載されており、これらの文献はすべて本明細書に参照として組み込むものとする：米国特許第４，８９７，４６７号；公開ＥＰ００１６８３６３；Oscarssonら、J. Immunol. Methods 143:143-149 (1991)；及びPorathら、Makromol. Chem., Macromol. Symp. 17:359-371 (1988)。
免疫グロブリンと選択的に結合することができる別の低分子量リガンド群として、エチレングリコール、グリシン又はメルカプトエタノールと反応したペンタフルオロピリジン及びＮ−ジメチルアミノピリジンが挙げられる。Ngo, J. Chromatogr. 501:281 (1990)（本明細書に参照として組み込む）を参照。これらの材料を用いた吸着剤を用いて、高又は低塩濃度バッファーのいずれかで免疫グロブリンを単離したり、あるいは低塩濃度条件で他のタイプのタンパク質を単離したりすることができる。吸着したタンパク質の溶出は、ｐＨを下げることにより達成することができる。
さらに別の低分子量擬性バイオアフィニティリガンドが、卵黄及びその他の生物学的液体由来の抗体と選択的に結合することができるものとして同定されている。これらのリガンドは特殊な色素である。リガンドからの結合抗体の溶出は、特殊な置換剤によって達成する。
アフィニティクロマトグラフィに用いることができる好適なリガンドのその他の例は、米国特許第６，２０７，８０７号及び第６，６１０，６３０号に記載されている。
別の望ましいリガンド群は、完全にヒトのＩｇＧ重鎖又は軽鎖ドメインとの交差反応が最小か又は全くない非ヒトＩｇＧ重鎖又は軽鎖に特異的なＶＨＨリガンドである。これらのリガンドについてはすでに詳述した。
抗体特異的リガンドの固定化のために、様々な固体支持体をいくつ用いてもよい。例えば、固体支持体材料は、多糖、例えば、セルロース、デンプン、デキストラン、寒天若しくはアガロース、又は親水性合成ポリマー、例えば、置換若しくは非置換ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリビニル親水性ポリマー、ポリスチレン、ポリスルホンなどからなるものでよい。固体支持体材料として使用するのに好適なその他の材料として、多孔性無機材料、例えば、シリカ、アルミナ、酸化チタニア、酸化ジルコニア、及びその他のセラミック構造物が挙げられる。あるいは、複合材料を固体支持体材料として用いてもよい。このような複合材料は、２つ以上の前記物質のコポリマー化又は相互貫入ネットワークにより形成することができる。好適な複合材料の例として、米国特許第５，２６８，０９７号；第５，２３４，９９１号；及び第５，０７５，３７１号に開示されているような、多糖−合成ポリマー及び／又は多糖−無機構造物及び／又は合成ポリマー−無機構造物が挙げられる。
本発明の固体支持体材料は、直径約０．１ｍｍ〜１０００ｍｍの大きさのビーズ又はふぞろいの粒子、任意のサイズの繊維（中空又はその他）、膜、厚さ約０．１ｍｍ〜１ｍｍの平板、及び直径１μｍ〜数ｍｍの孔を有する海綿様材料の形態をしたものでよい。
リガンドのメルカプト基と、固体支持体上に存在する反応基との間に形成される共有結合を介して、前述したリガンドを上記固体支持体材料に固定化するのが好ましい。本リガンドのメルカプト基と反応することができる反応基としては、エポキシ基、トシラート、トレシラート、ハロゲン化物及びビニル基が挙げられる。前記固体支持体材料の多くは、上に挙げた反応基の１つを含まないため、該固体支持体材料と反応し、かつ必要な反応基を提供することができる二官能価活性剤を用いてもよい。好適な活性剤の例としては、エピクロルヒドリン、エピブロムヒドリン、ジブロモ−及びジクロロプロパノール、ジブロモブタン、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ジビニルスルホンなどが挙げられる。
好適な支持体の典型的例として以下のものが挙げられる：ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ、アガロース、及びPharmacia（スエーデン）製の樹脂活性化ＣＨ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ４Ｂ（アガロースを含むＮ−ヒドロキシスクシンイミド）、樹脂ＮＨＳ活性化ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（６−アミノヘキサン酸で活性化することにより、活性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを形成する；Amercham Biosciences）、樹脂ＣＮＢｒ活性化ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭＦａｓｔ Ｆｌｏｗ（臭化シアンで活性化；Amercham Biosciences）、樹脂ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＡＫＴＭエポキシ活性化アフィニティ樹脂（Waters、米国）、樹脂ＥＵＰＥＲＧＩＴＴＭＣ３０Ｎ（Rohm & Haas、ドイツ）、ＵｌｔｒａＬｉｎｋ Ｂｉｏｓｕｐｐｏｒｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Pierce）、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ ＧＦ−２０００（Pierce）、又はBioRad（米国）製のＡＦＦＩ−ＧＥＬＴＭ。ペプチド及びタンパク質との直接結合のために、アフィニティクロマトグラフィ用の支持体をエポキシド基で前活性化するのが好ましい。
本発明の方法を実施する上で有用なアフィニティクロマトグラフィ樹脂には、限定するものではないが、前記リガンド又は化合物と、前記支持体のいずれかとの任意の組合せが含まれる。具体的なアフィニティクロマトグラフィ樹脂の非限定的な例を以下に挙げる：プロテインＡ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ、プロテインＡ−アガロース、プロテインＡ−アガロースＣＬ−４Ｂ、プロテインＧ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ、プロテインＧ−アガロース、プロテインＧ−アガロースＣＬ−４Ｂ、プロテインＬ−アガロース、プロテインＡ／Ｇ−アガロース（これらすべての変種が様々な製造者、例えば、Sigma-Aldrich、Amersham、及びPierceから入手可能である）、ＫＡＰＴＩＶＴＭイムノアフィニティマトリックス（例：ＫＡＰＴＩＶ−ＧＹＴＭ、ＫＡＰＴＩＶ−ＡＥＴＭ、ＫＡＰＴＩＶ−ＭＴＭ、すべてTecnogen Inc.製）、Ｃｅｌｌｔｈｒｕ ＢｉｇＢｅａｄＴＭ（Sterogene）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＵｌｔｒａｆｌｏｗＴＭ（Sterogene）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＣｅｌｌｔｈｒｕＴＭ３００（Sterogene）、ＱｕｉｃｋＭａｂ（Sterogene）、ＱｕｉｃｋＰｒｏｔｅｉｎ ＡＴＭ（Sterogene）、ＴｈｒｕｐｕｔＴＭ及びＴｈｒｕｐｕｔ Ｐｌｕｓ（Sterogene）、ＰＲＯＳＥＰ−Ａ又はＰＲＯＳＥＰ−Ｇ（Millipore）、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒｃｅｌＴＭ（Ciphergen）、ＭＢＩ ＨｙｐｅｒｃｅｌＴＭ（Ciphergen）及びＣＭ ＨｙｐｅｒｚＴＭ（Ciphergen）、並びにこれらのあらゆる変種。
アフィニティクロマトグラフィに用いる方法は、用いた特定の試薬に応じて異なり、典型的に製造者により提供されるか、又は当分野では公知のものである（例えば、Harlow及びLane、Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照）。
一般に、アフィニティクロマトグラフィ樹脂は、クロマトグラフィカラムにパッキングし、免疫グロブリンとアフィニティリガンドとの相互作用を促進することができるバッファーで平衡させた後、少なくとも１つの免疫グロブリンを含むフィードストック、上清又はサンプルと接触させる。次に、免疫グロブリンとアフィニティリガンドとの相互作用を妨害することなく、不純物を溶出することができる少なくとも１つの液体でカラムを洗浄した後、溶出剤を用いて免疫グロブリンを溶出する。
１つの具体的な例では、ヒトＩｇＧ及び非ヒトＩｇＧの両方を含むフィードストック、上清又はサンプルから、非ヒトＩｇＧに対する特異的なアフィニティを有するリガンドを用いて、非ヒトＩｇＧを除去することができる。この具体的例では、ウシＩｇＧ、キメラＩｇＧ及びヒトＩｇＧを含むトランスジェニックウシから取得したフィードストック（図１６）を、ＩｇＧ含有画分の精製のために処理又は操作し（例えば、既述のＣＡ沈殿及びアフィニティクロマトグラフィ）、すべてのＩｇＧを含む溶出液を抗ウシＩｇＧ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ樹脂にアプライする。この例でのフロースルーはヒトＩｇＧを含むが、ウシＩｇＧ及びキメラＩｇＧは樹脂に残っており、所望であれば、これらを別々に溶出することができる。
膜を用いた電気泳動
本明細書に記載する方法のいずれかから得たＩｇＧは、膜媒介の電気泳動を用いてさらに精製することができる。
本明細書に記載する方法のいずれかから得たＩｇＧは、膜媒介の電気泳動を用いてさらに精製することができる。
膜媒介の分離用電気泳動技術は、複合生物学的サンプルから高分子を精製するために開発された。一般に、膜媒介電気泳動技術では、液圧透過がほとんど又は全くないが、制御可能なサイズ範囲内のタンパク質の電気泳動移動を可能にする積層ポリアクリルアミドゲル膜を含むカートリッジを使用する。上流及び下流のフローチャンネルが形成され、これらは、１つの膜によって隔てられ、また他の膜によって電極及び電極バッファーチャンネルから隔てられている。一端からフィードストリーム（制御ｐＨで）がポンプで再循環され、第２のポンプにより他端から生成物が再循環される（カートリッジ内の滞留時間１〜２時間）。様々なフローストリームを冷却することにより、電流によって生じた熱を除去する。サンプルが適正に荷電され、これによりサンプルが分離膜を通ってフィードストリームから生成物チャンネルまで移動するように、条件を設定する。好適なバッファーｐＨ系の選択により発生した分子電荷と、選択した孔径の膜と組み合わせて用いることにより、電荷及び／又は大きさに基づいて分子を分離する。ＩｇＧのような標的分子は、ＩｇＧが天然又は変性状態にある条件で精製することができる。
膜媒介電気泳動に有用な装置の好ましい一例として、ＧｒａｄｉｆｌｏｗＴＭ装置がある。ＧｒａｄｉｆｌｏｗＴＭは、分離ユニットを有し、このユニットは、電極間に位置するカートリッジ構造の３つの分子量カットオフ膜からなる。膜を積層することにより、平行に循環する多数の流路を備えるカートリッジが形成される。膜及び流路に対して電界を印加すると、荷電分子は流路間を、反対の電荷の電極に向かって移動する。膜の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）により、サイズ分離のための選択的手段が提供される。
膜媒介電気泳動のための適切なｐＨ及び泳動時間は、製造者の指示に従って当業者が決定することができる。一例では、ＩｇＧサンプルをｐＨ５．０のバッファーに対して透析し、ＧｒａｄｉｆｌｏｗＴＭシステムで６〜２４時間泳動させる。別の例では、ＩｇＧを含むサンプルのｐＨを中性ｐＨにし、ＩｇＧ凝集体を形成するのに十分な時間及び温度（例えば、６０℃）で上清を加熱する。次に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加し、ｐＨ５．０の適切なバッファーに対して上清／ＢＳＡ混合物を透析する。次に、膜媒介電気泳動を用いて、上清及びＢＳＡからＩｇＧを分離する。
本発明の各方法を実施するための技術について、これから具体的な実施例を用いて詳しく説明する。これらの実施例は本発明を説明する目的で提供するのであって、限定的に解釈すべきではない。
カプリル酸沈殿及びアフィニティクロマトグラフィによるＩｇＧの精製
第１の精製方法では、ヒト血漿又はウシ（野生型若しくはトランスジェニック）血漿を１５％酢酸の添加でｐＨ４．５に調整した後、ｐＨ４．５の６％（ｖ／ｖ）ＣＡを用いて、２０〜２５℃で３０分間一定に攪拌しながら直接処理した。次に、ＧＳＡローターを用いて室温にて６，０００ｒｐｍでフィードストックを遠心分離した。不溶性物質を廃棄してから、１Ｍトリス又は１Ｎ ＮａＯＨの添加により上清のｐＨを約７．５〜８．０に調整した。ｐＨ調整フィードストックを０．２２ミクロンフィルターで濾過し、これをＩｇＧアフィニティ樹脂、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ、又はＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭにアプライした。ＰＢＳ、又は０．１５Ｍ ＮａＣｌの存在若しくは非存在下で２０〜５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５〜８．５）で洗浄した後、低ｐＨバッファーでＩｇＧを溶出した。プロテインＡ及びプロテインＧ樹脂にはｐＨ３．０の５０ｍＭグリシン−ＨＣｌバッファーを用いたのに対し、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭカラムにはｐＨ４．４の５０ｍＭ酢酸ナトリウムを用いた。
第１の精製方法では、ヒト血漿又はウシ（野生型若しくはトランスジェニック）血漿を１５％酢酸の添加でｐＨ４．５に調整した後、ｐＨ４．５の６％（ｖ／ｖ）ＣＡを用いて、２０〜２５℃で３０分間一定に攪拌しながら直接処理した。次に、ＧＳＡローターを用いて室温にて６，０００ｒｐｍでフィードストックを遠心分離した。不溶性物質を廃棄してから、１Ｍトリス又は１Ｎ ＮａＯＨの添加により上清のｐＨを約７．５〜８．０に調整した。ｐＨ調整フィードストックを０．２２ミクロンフィルターで濾過し、これをＩｇＧアフィニティ樹脂、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ、又はＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭにアプライした。ＰＢＳ、又は０．１５Ｍ ＮａＣｌの存在若しくは非存在下で２０〜５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５〜８．５）で洗浄した後、低ｐＨバッファーでＩｇＧを溶出した。プロテインＡ及びプロテインＧ樹脂にはｐＨ３．０の５０ｍＭグリシン−ＨＣｌバッファーを用いたのに対し、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭカラムにはｐＨ４．４の５０ｍＭ酢酸ナトリウムを用いた。
図１は、ＣＡ沈殿及びプロテインＧアフィニティクロマトグラフィにより精製したヒトＩｇＧのサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）結果を示す。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＶＰ ＨＰＬＣ装置に接続され、これにより制御されるＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷカラムにおいて、ＳＥＣを分析した。保持時間約８分でのタンパク質ピークが、プロテインＧカラムから溶出したＩｇＧフィードストックの純度を示す。
図２は、ＣＡ沈殿及びＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭアフィニティクロマトグラフィにより精製したヒトＩｇＧのＳＥＣ結果を示す。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＶＰ ＨＰＬＣ装置に接続され、これにより制御されるＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷカラムにおいて、ＳＥＣを分析した。精製タンパク質は、保持時間約８分でピークを有し、これは、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭカラムから溶出したＩｇＧフィードストックの高い純度を示している。
図３は、ＣＡ沈殿及びプロテインＧアフィニティクロマトグラフィにより精製したウシＩｇＧのＳＥＣ結果を示す。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＶＰ ＨＰＬＣ装置に接続され、これにより制御されるＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷカラムのサイズ排除クロマトグラフィにより、ＳＥＣを分析した。精製タンパク質は、保持時間約８分でピークを有し、このことは、プロテインＧカラムから溶出したＩｇＧフィードストックの高い純度を示している。
ＣＡ沈殿及びアフィニティクロマトグラフィ後の高いＩｇＧ純度のほかにも、この組合せ精製方法により、検出可能なレベルのＢＳＡを含まないＩｇＧ生成物も得られた。表１は、Cygnus製のＥＬＩＳＡキットにより測定した、ＣＡ処理前後、並びにプロテインＧカラム精製後のフィードストック中のＢＳＡ濃度を示す。ウシ血漿のＣＡ処理により、ＢＳＡ濃度が約２３，０００倍低下し、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィでのさらなる精製によりＢＳＡは検出限界を下回るレベルまで低下した。
ＣＡ／総タンパク質比を用いた、カプリル酸沈殿及びアフィニティクロマトグラフィによるＩｇＧの精製
ＩｇＧの一貫した回収と、それ以外の混入タンパク質の除去を達成するために、総タンパク質に基づき、フィードストックに添加するＣＡの量を計算した。この実施例では、通常のタンパク質アッセイ方法により総タンパク質濃度を測定し、ＣＡを添加することにより、０．７５〜２．２５のＣＡ／総タンパク質比を達成した。
ＩｇＧの一貫した回収と、それ以外の混入タンパク質の除去を達成するために、総タンパク質に基づき、フィードストックに添加するＣＡの量を計算した。この実施例では、通常のタンパク質アッセイ方法により総タンパク質濃度を測定し、ＣＡを添加することにより、０．７５〜２．２５のＣＡ／総タンパク質比を達成した。
表２は、ＣＡ処理前後のフィードストックにおける総タンパク質回収とＢＳＡ濃度を示すが、これらは、Cygnus製のＥＬＩＳＡキットにより測定した。未希釈のウシ血漿を用いたＣＡ沈殿の場合、血漿のｐＨを４．８に調整し、ＣＡを添加することにより、表に示すＣＡ／総タンパク質比を達成してから、激しく混合した。希釈血漿を用いたＣＡ沈殿の場合には、ｐＨ４．０の６０ｍＭ酢酸ナトリウムの適量で血漿を希釈した後、最終ｐＨ４．８に調整した。両方の場合とも、サンプルを室温で一晩インキュベートした後、遠心分離により上清を回収し、これを総タンパク質及びＢＳＡ濃度について測定した。
表３は、サンプルを室温で３０分インキュベートした後、遠心分離により上清を回収した以外は前記と同様の、ＣＡ処理前後のフィードストックにおける総タンパク質回収及びＢＳＡ濃度を示す。
表４は、前述のように、ＣＡ処理前後の様々なウシ血漿フィードストックからの総タンパク質回収、ウシＩｇＧ濃度、ＢＳＡ濃度、及び宿主の混入タンパク質（ＨＣＰ）濃度を示す。ＢＳＡとＨＣＰは、Cygnus（ノースカロライナ州）から入手したＥＬＩＳＡキットにより測定した。
これらの結果は、ＣＡ／総タンパク質比０．７５〜２．２５を達成するのに十分な量を添加した際の、ＣＡの効果を証明するものである。ＣＡを用いたウシ血漿の沈殿により、ＨＣＰ（この場合、ＩｇＧ及びＢＳＡ以外のウシ血漿タンパク質）の濃度を１０〜１５ｍｇ／ｍｌから数ミクログラム／ｍｌに低減することができる。重要なのは、ＣＡ沈殿方法は、様々な濃度の総タンパク質、ＢＳＡ、及びＩｇＧを含む多様な血漿について好適であることである。ＢＳＡ及びＨＣＰクリアランスに加えて、ＣＡ沈殿はまた、デプスフィルター及び濾過助剤（例えば、Advanced Minerals Corporation製のCelpure P1000）と組み合わせたとき、エンベロープを有するウイルス（例えば狂牛病を引き起こす因子であるＴＳＥ及びＢＳＥ）を不活性化する上で有効であった。
プロテインＧ及びＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌのようなカラムでのアフィニティクロマトグラフィにより、ＣＡ上清中のＢＳＡ及びＨＣＰをさらに低減し、これにより所望のＩｇＧの純度を高めることができる。
表５は、ウシ血漿のＣＡ沈澱に続き、標準的プロトコルを用いたアフィニティクロマトグラフィカラム実施後のＢＳＡ及びＨＣＰ濃度を示す。表６は、ヒトＩｇＧを添加（spike）しウシＩｇＧを欠損するウシ血漿のＣＡ沈殿に続き、標準的プロトコルを用いたアフィニティクロマトグラフィカラム実施後のＢＳＡ及びＨＣＰ濃度を示す。このサンプルの場合、ウシ血漿をＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムに通過させ、フロースルー（非結合画分）を回収した。フロースルーはウシＩｇＧを欠損している。精製ヒトＩｇＧを最終濃度２．５ｍｇ／ｍｌとなるようフロースルーサンプルに添加した。前述した方法毎にＣＡを添加した。
ウシＩｇＧからヒトＩｇＧを分離するための、ｒプロテインＡクロマトグラフィと低ｐＨ洗浄とを組み合わせた使用
別の方法では、精製ウシＩｇＧ（５ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭカラムを通してウシ血漿から精製）又は精製ヒトＩｇＧ（Bethyl Labから購入）を、２５ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で平衡させておいた５ｍｌのＨｉＴｒａｐ ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭカラム（Amercham製）にアプライした。ｒプロテインＡは、プロテインＡの組換え型である。フィードストックの添加後、約４ベッド容量のＰＢＳと１ベッド容量の０．１Ｍ酢酸ナトリウムで、Ａ２８０ベースラインに達するまでカラムを洗浄した。次いで、様々なｐＨ値、すなわちｐＨ５．２０、４．８０、及び４．４６のバッファー各々１０カラム容量でカラムを段階的に洗浄した。次に、０．１Ｍ酢酸ナトリウムと０．１Ｍ酢酸の比率を変えて混合することにより、様々な低ｐＨバッファーを調製した。例えば、２部の０．１Ｍ酢酸と８部の０．１Ｍ酢酸ナトリウムを混合することにより、ｐＨ５．２０のバッファーを、４部の０．１Ｍ酢酸と６部の０．１Ｍ酢酸ナトリウムを混合することにより、ｐＨ４．８０のバッファーを、６部の０．１Ｍ酢酸と４部の０．１Ｍ酢酸ナトリウムを混合することにより、ｐＨ４．４６のバッファーをそれぞれ得る。ｒプロテインＡカラムをｐＨ３．０のバッファーで溶出した（０．１Ｍ酢酸）。
別の方法では、精製ウシＩｇＧ（５ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭカラムを通してウシ血漿から精製）又は精製ヒトＩｇＧ（Bethyl Labから購入）を、２５ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で平衡させておいた５ｍｌのＨｉＴｒａｐ ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭカラム（Amercham製）にアプライした。ｒプロテインＡは、プロテインＡの組換え型である。フィードストックの添加後、約４ベッド容量のＰＢＳと１ベッド容量の０．１Ｍ酢酸ナトリウムで、Ａ２８０ベースラインに達するまでカラムを洗浄した。次いで、様々なｐＨ値、すなわちｐＨ５．２０、４．８０、及び４．４６のバッファー各々１０カラム容量でカラムを段階的に洗浄した。次に、０．１Ｍ酢酸ナトリウムと０．１Ｍ酢酸の比率を変えて混合することにより、様々な低ｐＨバッファーを調製した。例えば、２部の０．１Ｍ酢酸と８部の０．１Ｍ酢酸ナトリウムを混合することにより、ｐＨ５．２０のバッファーを、４部の０．１Ｍ酢酸と６部の０．１Ｍ酢酸ナトリウムを混合することにより、ｐＨ４．８０のバッファーを、６部の０．１Ｍ酢酸と４部の０．１Ｍ酢酸ナトリウムを混合することにより、ｐＨ４．４６のバッファーをそれぞれ得る。ｒプロテインＡカラムをｐＨ３．０のバッファーで溶出した（０．１Ｍ酢酸）。
ウシＩｇＧの溶出プロフィールを図４に示し、ヒトＩｇＧの溶出プロフィールを図５に示す。ＩｇＧはｒプロテインＡカラムに極めて弱く結合するが、ヒトＩｇＧはｒプロテインＡカラムに非常に強く結合した（図４のＹ軸目盛と図５のＹ軸目盛を比較）。フィードストックの添加中、大部分のウシＩｇＧはｒプロテインＡカラムに結合しなかった。ｒプロテインＡカラムに結合したウシＩｇＧを低ｐＨバッファー（ｐＨ５．２０、４．８０、及び４．４６）でカラムから洗浄した。フィードストックの添加中、ｒプロテインＡカラムのフロースルーに有意な量のヒトＩｇＧは検出されなかった。総タンパク質の測定により、ｒプロテインＡカラムからのｐＨ３．０溶出画分中の総ウシタンパク質（ウシＩｇＧ及びその他の非特異タンパク質）（図４）の比率（％）は、ｒプロテインＡカラムからｐＨ３．０で溶出した総ヒトＩｇＧ（図５）のわずか２〜３％にすぎなかいことがわかった。
既存のトランスジェニックウシ血漿は１０〜３０μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧと１０〜２０ｍｇ／ｍｌのウシＩｇＧを含む。トランスジェニックウシ血漿においてヒトＩｇＧを発現及び生産するための新規の系を用いて、本発明者らは、ＣＡ（前記参照）でトランスジェニックウシ血漿を沈殿させ、前記のように上清を５ｍｌのｒプロテインＡカラムにアプライし、洗浄した後、溶出した。ｐＨ３．０溶出画分（図６のｐＨ３．０ピークを参照）において高度に精製されたヒトＩｇＧを得た。このように、低ｐＨ洗浄とｐＨ３．０溶出とを組み合わせたｒプロテインＡカラムクロマトグラフィは、ＣＡ処理したトランスジェニックウシをフィードストックとして用いるとき、ヒトＩｇＧからウシＩｇＧを分離する上で非常に有効である。
ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ ＴＭ クロマトグラフィによるＩｇＧ二量体及び凝集体の除去
ＩｇＧ二量体及び凝集体は、標準的ＩｇＧ製造方法においてＩｇＧ単量体から分離することが困難である。本発明者らは、ＩｇＧ結合樹脂であるＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭがｐＨ６〜８．５の条件ではＩｇＧ二量体及び凝集体に結合しないか、又は結合しても非常に弱いことを発見した。ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭ樹脂は、Ciphergen Biosystems, Incから入手したもので、アフィニティリガンドとして４−メルカプト−エチル−ピリジンを有する。４−メルカプト−エチル−ピリジンは、疎水性テイルと、生理学的ｐＨでは非荷電かつ疎水性のイオン性頭部基を有する。酸性ｐＨ条件で、リガンドは、ＩｇＧと同様に、正電荷を帯びるため、静電反発が起こり、ＩｇＧの解離を引き起こす。市販のヒトＩＶＩＧはいくつかのＩｇＧ二量体を含むため、これをＩｇＧ二量体フィードストックとして用いた。ＩｇＧフィードストックを６０℃及びｐＨ８〜８．５で１〜３時間インキュベートすることにより、ＩｇＧ凝集体を生成した。この実施例で試験するＩｇＧフィードストックは、市販のヒトＩＶＩＧ、ＣＡ処理ヒト血漿、及びＣＡ処理ウシ血漿を含むものであった。典型的には、ＣＡ処理ヒト血漿からのＩｇＧフィードストックを、１ＭトリスでｐＨ８．５に、４Ｍ ＮａＣｌで０．１５Ｍ ＮａＣｌに調整した後、６０℃の水浴において２時間インキュベートした。ＩＶＩＧの場合には、フィードストックを５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌで希釈してから、６０℃水浴で２時間インキュベートした。冷却後、熱処理したフィードストックをＩｇＧ精製のためにＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭカラム、ｒプロテインＡ、又はプロテインＧカラムにアプライした。ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭカラムの場合、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌで平衡しておいたカラムにＩｇＧフィードストックをアプライした後、（１）５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、次に（２）５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０で洗浄した。次いで、カラムを５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．４及び５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ３．０でそれぞれ溶出した。プロテインＡ又はプロテインＧカラムの場合には、ＰＢＳで平衡しておいたカラムにＩｇＧフィードストックをアプライし、ＰＢＳで洗浄後、５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ３．０で溶出した。全ての溶出タンパク質ピークを１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０の添加により中性ｐＨにし、サイズ排除カラムで分析した。数種の非結合物質（フロースルー）もサイズ排除カラムで分析した。
ＩｇＧ二量体及び凝集体は、標準的ＩｇＧ製造方法においてＩｇＧ単量体から分離することが困難である。本発明者らは、ＩｇＧ結合樹脂であるＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭがｐＨ６〜８．５の条件ではＩｇＧ二量体及び凝集体に結合しないか、又は結合しても非常に弱いことを発見した。ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭ樹脂は、Ciphergen Biosystems, Incから入手したもので、アフィニティリガンドとして４−メルカプト−エチル−ピリジンを有する。４−メルカプト−エチル−ピリジンは、疎水性テイルと、生理学的ｐＨでは非荷電かつ疎水性のイオン性頭部基を有する。酸性ｐＨ条件で、リガンドは、ＩｇＧと同様に、正電荷を帯びるため、静電反発が起こり、ＩｇＧの解離を引き起こす。市販のヒトＩＶＩＧはいくつかのＩｇＧ二量体を含むため、これをＩｇＧ二量体フィードストックとして用いた。ＩｇＧフィードストックを６０℃及びｐＨ８〜８．５で１〜３時間インキュベートすることにより、ＩｇＧ凝集体を生成した。この実施例で試験するＩｇＧフィードストックは、市販のヒトＩＶＩＧ、ＣＡ処理ヒト血漿、及びＣＡ処理ウシ血漿を含むものであった。典型的には、ＣＡ処理ヒト血漿からのＩｇＧフィードストックを、１ＭトリスでｐＨ８．５に、４Ｍ ＮａＣｌで０．１５Ｍ ＮａＣｌに調整した後、６０℃の水浴において２時間インキュベートした。ＩＶＩＧの場合には、フィードストックを５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌで希釈してから、６０℃水浴で２時間インキュベートした。冷却後、熱処理したフィードストックをＩｇＧ精製のためにＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭカラム、ｒプロテインＡ、又はプロテインＧカラムにアプライした。ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭカラムの場合、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌで平衡しておいたカラムにＩｇＧフィードストックをアプライした後、（１）５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、次に（２）５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０で洗浄した。次いで、カラムを５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．４及び５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ３．０でそれぞれ溶出した。プロテインＡ又はプロテインＧカラムの場合には、ＰＢＳで平衡しておいたカラムにＩｇＧフィードストックをアプライし、ＰＢＳで洗浄後、５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ３．０で溶出した。全ての溶出タンパク質ピークを１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０の添加により中性ｐＨにし、サイズ排除カラムで分析した。数種の非結合物質（フロースルー）もサイズ排除カラムで分析した。
図７は、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭアフィニティクロマトグラフィにより、熱処理（６０℃で２時間）ＣＡ上清から精製したウシＩｇＧのＳＥＣ結果を示す。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＶＰ ＨＰＬＣ装置に接続され制御されるＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷカラムでのサイズ排除クロマトグラフィにより、ＩｇＧサンプルを分析した。保持時間約８分でのタンパク質ピークがＩｇＧ単量体を示し、また保持時間約５．５分でのタンパク質ピークはＩｇＧ凝集体を示す。熱処理ＩｇＧフィードストックが比較的多量のＩｇＧ凝集体を含むのに対し、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭカラムにより精製されたＩｇＧフィードストックからはＩｇＧ凝集体はほとんど消失していた。これらの結果は、ウシＩｇＧフィードストックにおける単量体ＩｇＧからＩｇＧ凝集体を除去する上でのＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭカラムの有効性を証明するものである。
図８は、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭカラムのフロースルー（非結合物質）及びｐＨ３．０溶出画分におけるウシＩｇＧサンプルのＳＥＣ結果を示す。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＶＰ ＨＰＬＣ装置に接続され制御されるＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷカラムでのサイズ排除クロマトグラフィにより、ＩｇＧフィードストックを分析した。保持時間約８分でのタンパク質ピークはＩｇＧ単量体を示し、また保持時間約５．５分でのタンパク質ピークはＩｇＧ凝集体を示す。ＩｇＧ凝集体の大部分はフロースルー画分に存在し、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムにはわずかなＩｇＧ凝集体画分が結合していた。この画分を５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ３．０により溶離した。
図９は、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィにより、熱処理（６０℃で２時間）ＣＡ上清から精製したウシＩｇＧのＳＥＣ結果を示す。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＶＰ ＨＰＬＣ装置に接続され制御されるＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷカラムでのサイズ排除クロマトグラフィにより、ＩｇＧサンプルを分析した。保持時間約８分でのタンパク質ピークはＩｇＧ単量体を示し、また保持時間約５．５分でのタンパク質ピークはＩｇＧ凝集体を示す。これらの結果は、単量体ＩｇＧからＩｇＧ凝集体を分離するのに、プロテインＧカラムが有効ではないことを示している。
図１０は、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭアフィニティクロマトグラフィにより精製したヒトＩＶＩＧのＳＥＣ結果を示す。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＶＰ ＨＰＬＣ装置に接続され制御されるＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷカラムでのサイズ排除クロマトグラフィにより、ＩｇＧサンプルを分析した。保持時間約８分でのタンパク質ピークはＩｇＧ単量体を示し、また保持時間約７分でのタンパク質ピークはＩｇＧ二量体を示す。ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭカラムによる精製後、ＩｇＧ二量体の相対比率（％）は有意に低下した。従って、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭカラムは、ヒトＩｇＧフィードストックからＩｇＧ二量体を低減するのに有効である。
図１１は、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭアフィニティクロマトグラフィにより、熱処理（６０℃で２時間）ＩＶＩＧフィードストックから精製したヒトＩＶＩＧのＳＥＣ結果を示す。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＶＰ ＨＰＬＣ装置に接続され制御されるＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷカラムでのサイズ排除クロマトグラフィにより、ＩｇＧサンプルを分析した。保持時間約８分でのタンパク質ピークはＩｇＧ単量体を示し、また保持時間約５．５分でのタンパク質ピークはＩｇＧ凝集体を示す。ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭカラムによる精製後、ＩｇＧ凝集体は大部分が消失した。従って、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭカラムは、ヒトＩｇＧフィードストックからＩｇＧ凝集体を除去するのに非常に有効である。
図１２は、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭカラムのフロースルー（非結合物質）からのヒトＩｇＧフィードストックのＳＥＣ結果を示す。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＶＰ ＨＰＬＣ装置に接続され制御されるＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷカラムでのサイズ排除クロマトグラフィにより、ＩｇＧフィードストックを分析した。保持時間約８分でのタンパク質ピークはＩｇＧ単量体を示し、また保持時間約５．５分でのタンパク質ピークはＩｇＧ凝集体を示す。ヒトＩｇＧ凝集体はすべてフロースルー画分に存在した。
図１３は、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭアフィニティクロマトグラフィにより、熱処理（６０℃で２時間）ＣＡ上清から精製したヒトＩｇＧのＳＥＣ結果を示す。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＶＰ ＨＰＬＣ装置に接続され制御されるＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷカラムでのサイズ排除クロマトグラフィにより、ＩｇＧサンプルを分析した。保持時間約８分でのタンパク質ピークはＩｇＧ単量体を示し、また保持時間約５．５分でのタンパク質ピークはＩｇＧ凝集体を示す。熱処理ＩｇＧフィードストックが多量のＩｇＧ凝集体を含むのに対し、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭカラムによる精製後のＩｇＧフィードストックからはＩｇＧ凝集体の大部分が消失していた。これは、ヒトＩｇＧフィードストックからＩｇＧ凝集体を除去する上でＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭカラムが非常に有効であることを示している。
図１４は、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィにより、熱処理（６０℃で２時間）ＣＡ上清から精製したヒトＩｇＧのＳＥＣ結果を示す。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＶＰ ＨＰＬＣ装置に接続され制御されるＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷカラムでのサイズ排除クロマトグラフィにより、ＩｇＧサンプルを分析した。保持時間約８分でのタンパク質ピークはＩｇＧ単量体を示し、また保持時間約５．５分でのタンパク質ピークはＩｇＧ凝集体を示す。これらの結果から、ヒトＩｇＧフィードストックからＩｇＧ凝集体を除去するのに、プロテインＧカラムが有効ではないことが示される。
図１５は、ｒプロテインＡアフィニティクロマトグラフィにより、熱処理（６０℃で２時間）ＣＡ上清から精製したヒトＩｇＧのＳＥＣ結果を示す。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＶＰ ＨＰＬＣ装置に接続され制御されるＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷカラムでのサイズ排除クロマトグラフィにより、ＩｇＧサンプルを分析した。保持時間約８分でのタンパク質ピークはＩｇＧ単量体を示し、また保持時間約５．５分でのタンパク質ピークはＩｇＧ凝集体を示す。これより、ヒトＩｇＧフィードストックからＩｇＧ凝集体を除去するのに、ｒプロテインＡカラムは有効ではなかった。
抗ウシＩｇＧイムノアフィニティクロマトグラフィによるウシＩｇＧ及びヒト／ウシキメラＩｇＧの除去
ヒトＩｇＧを産生するように操作したトランスジェニックウシ類は、異なる３つのタイプのＩｇＧ分子、すなわちウシＩｇＧ（ｂＩｇＧ）、ヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）、及びヒト重鎖（ＨＣ）とウシ軽鎖（ＬＣ）又はヒトＬＣとウシＨＣのいずれかを含むキメラＩｇＧ（ｃＩｇＧ）を発現する（図１６）。トランスジェニックウシ血漿におけるｈＩｇＧの濃度は１０〜３０μｇ／ｍｌであり、ｂＩｇＧ濃度は１０〜２０ｍｇ／ｍｌであり、ｃＩｇＧの濃度は不明である。
ヒトＩｇＧを産生するように操作したトランスジェニックウシ類は、異なる３つのタイプのＩｇＧ分子、すなわちウシＩｇＧ（ｂＩｇＧ）、ヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）、及びヒト重鎖（ＨＣ）とウシ軽鎖（ＬＣ）又はヒトＬＣとウシＨＣのいずれかを含むキメラＩｇＧ（ｃＩｇＧ）を発現する（図１６）。トランスジェニックウシ血漿におけるｈＩｇＧの濃度は１０〜３０μｇ／ｍｌであり、ｂＩｇＧ濃度は１０〜２０ｍｇ／ｍｌであり、ｃＩｇＧの濃度は不明である。
以下の方法は、ｂＩｇＧ及びｃＩｇＧを実質的に含まないｈＩｇＧを精製するために開発された。McKinney及びParkinson（前掲）により記載されている方法に従い、トランスジェニックウシ血漿を希釈し、２．５％ＣＡで沈殿させた。ＣＡ上清のｐＨをｐＨ７．５〜８．０に調整してから、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭカラムにアプライすることにより、実施例１と同様にｈＩｇＧ及びｃＩｇＧを捕捉し、ｂＩｇＧ及びその他のウシタンパク質を除去した。ｈＩｇＧ及びｃＩｇＧをｐＨ３．０によりｒプロテインＡカラムから溶出した後、ｐＨ７．５〜８．０に調整してから、ウマ抗ｂＩｇＧ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭカラムにアプライした。抗ウシＩｇＧカラムからのフロースルー（非結合物質）はｈＩｇＧを含んでいた（図１７）が、ｂＩｇＧ及びｃＩｇＧはカラムに結合しており、これらを５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ３．０でカラムから溶離した（図１８）。
抗原として精製ウシＩｇＧを用いて、ウマ抗ウシＩｇＧをウマにおいて生起させた。ウマ血漿を回収し、ウシＩｇＧ Ａｆｆｉ−Ｇｅｌイムノアフィニティカラムにより抗ウシＩｇＧ抗体を精製した後、ヒトＩｇＧアガロースカラムでのアフィニティストリップにより、ｈＩｇＧと交差反応する抗体を吸着させた。ｂＩｇＧのみに特異的な、アフィニティ精製及びストリップを行った抗ｂＩｇＧ抗体サンプルをＣＮＢｒ活性化ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ樹脂に固定化することにより、ウマ抗ウシＩｇＧイムノアフィニティカラムを作製した。
前記方法によりトランスジェニックウシ血漿から精製したヒトＩｇＧは、ウエスタンブロットにより分析すると、検出可能なウシＩｇＧを含んでいない（図１９）。
ＶＨＨリガンドイムノアフィニティクロマトグラフィによるウシＩｇＧ及びヒト／ウシキメラＩｇＧの除去
非ヒト（本実施例ではウシ）又は非ヒト／ヒトキメラＩｇＧから完全にヒトのＩｇＧを分離する別の手法を、ウシＩｇＧに特異的に結合するＶＨＨリガンドを用いて試験した。ＶＨＨリガンドは、結合特性に関して、全抗体と非常に類似した挙動を示す重鎖可変領域のみを有する小さな一本鎖タンパク質である。
非ヒト（本実施例ではウシ）又は非ヒト／ヒトキメラＩｇＧから完全にヒトのＩｇＧを分離する別の手法を、ウシＩｇＧに特異的に結合するＶＨＨリガンドを用いて試験した。ＶＨＨリガンドは、結合特性に関して、全抗体と非常に類似した挙動を示す重鎖可変領域のみを有する小さな一本鎖タンパク質である。
ウシＩｇＧ重鎖又は軽鎖に対して高いアフィニティを有するＶＨＨリガンドは、The Biotechnology Application Centre（ＢＡＣ）と共同して、米国特許出願公開第２００３００７８４０２号、並びに米国特許第６，３９９，７６３号及び第６，６７０，４５３号に記載した方法を用いた後、ウシＩｇＧでラマを免疫することにより、作製した。これらのＶＨＨリガンドを精製した後、ＮＨＳ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのような樹脂を用いてアフィニティクロマトグラフィカラム上に固定してから、該リガンドがフィードストックからウシＩｇＧ又はキメラＩｇＧを除去し、それによりフロースルー中にヒトＩｇＧだけを回収可能にする能力について試験した。
これらの実験のために、各ＶＨＨリガンドをマトリックスに固定化し、様々な量のヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）及びウシＩｇＧ（ｂＩｇＧ）を含むサンプル（２０ｍｌ）を各カラムに通過させ、フロースルー（非結合画分）を回収して、ＥＬＩＳＡによりｂＩｇＧを測定した。表７は、クロマトグラフィ前後のフロースルー中のヒトＩｇＧに基づき算出したウシＩｇＧ濃度（ｐｐｍ：百万分率）を示す。
膜電気泳動を用いたＩｇＧのさらなる精製
本発明者らはまた、膜電気泳動（例えば、Life Therapeutics Inc.製のＧｒａｄｉｆｌｏｗシステム）を用いて、ＣＡによる沈殿後のトランスジェニックウシ血漿からＩｇＧを精製することにより、ＢＳＡを含むウシ血漿タンパク質の大部分を除去できることも見い出した。トランスジェニックウシ血漿をＣＡで処理した後、ｐＨを７．５〜８．０に調整し、６０℃で１〜２時間インキュベーションすることによりＩｇＧ凝集体を生成した。ＢＳＡも熱処理サンプルに添加した。ＩｇＧ凝集体及びＢＳＡを含むサンプルを４１ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１４ｍＭβ−アラニン、ｐＨ５．０にバッファー交換してから、ベンチスケールＧｒａｄｉｆｌｏｗ ＧＦ４００システム又はパイロットスケールＧＦ１００システムを実行することにより精製を行った。精製したサンプルをＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィ、ＢＳＡ ＥＬＩＳＡ及びＨＣＰ ＥＬＩＳＡにより分析した。
本発明者らはまた、膜電気泳動（例えば、Life Therapeutics Inc.製のＧｒａｄｉｆｌｏｗシステム）を用いて、ＣＡによる沈殿後のトランスジェニックウシ血漿からＩｇＧを精製することにより、ＢＳＡを含むウシ血漿タンパク質の大部分を除去できることも見い出した。トランスジェニックウシ血漿をＣＡで処理した後、ｐＨを７．５〜８．０に調整し、６０℃で１〜２時間インキュベーションすることによりＩｇＧ凝集体を生成した。ＢＳＡも熱処理サンプルに添加した。ＩｇＧ凝集体及びＢＳＡを含むサンプルを４１ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１４ｍＭβ−アラニン、ｐＨ５．０にバッファー交換してから、ベンチスケールＧｒａｄｉｆｌｏｗ ＧＦ４００システム又はパイロットスケールＧＦ１００システムを実行することにより精製を行った。精製したサンプルをＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィ、ＢＳＡ ＥＬＩＳＡ及びＨＣＰ ＥＬＩＳＡにより分析した。
図２０及び表８に示した結果から、膜媒介電気泳動を用いたＩｇＧ精製プロセスの間に、ＩｇＧ凝集体、ＢＳＡ、及び宿主の混入タンパク質をＩｇＧ単量体から分離できることが示される。従って、膜媒介電気泳動は、効率的な精製、又はＩｇＧ精製方法のための「仕上げステップ」として有用である。
また、膜媒介電気泳動は、フィードストックからウイルス及びＤＮＡを有効に除去することも示された。生存ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）及び抽出したイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）ゲノムＤＮＡのストック溶液を調製し、１：１０の比でＣＡ処理出発材料に添加（spike）した（すなわち、１０％ｖ／ｖ添加）。表９は、Ｇｒａｄｉｆｌｏｗシステムでの精製前後のサンプルについて実施したＰＣＲ分析及びウイルス感染性アッセイの結果を示す。ＰＣＲ及び感染性分析から、Ｇｒａｄｉｆｌｏｗ精製後のいずれのサンプルにもＰＰＶ又はＣＰＶ ＤＮＡが全く存在しないことが示された。ＰＣＲ産物の終点滴定によれば、ＰＰＶの対数減少は５ｌｏｇより大きく、またＣＰＶ ＤＮＡは５ｌｏｇよりも大きいと推定されるのに対し、感染性アッセイによりウイルス力価を測定すると、対数減少は３．７より大きい。従って、これらの結果は、明らかに、ＩｇＧ精製プロセスの間に、Ｇｒａｄｉｆｌｏｗシステムもまたウイルス及びＤＮＡを除去するのに有効であることを示している。
その他の実施形態
以上の説明から、様々な用途及び条件に適応させるために、本明細書に記載の本発明に改変及び修正を加えてもよいことは明らかである。このような実施形態もまた、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれる。
以上の説明から、様々な用途及び条件に適応させるために、本明細書に記載の本発明に改変及び修正を加えてもよいことは明らかである。このような実施形態もまた、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれる。
本明細書で言及する刊行物及び特許はすべて、個々の刊行物及び特許が具体的かつ個別に、参照として組み込まれることが示してある場合と同程度に、本明細書に参照として組み込むものとする。その他の実施形態も特許請求の範囲に含まれる。
Claims (84)
- フィードストックから免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を精製する方法であって、
（ａ）上記フィードストックのｐＨを約ｐＨ４．０〜５．５の範囲内に調整するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）からのｐＨ調整フィードストックと、炭素数４〜１２のモノ又はポリアルカン酸とを、沈殿物とＩｇＧを含む上清を形成するのに十分な量及び時間で接触させるステップ、
（ｃ）遠心分離又は濾過を用いてステップ（ｂ）の上清を沈殿物から分離するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）の上清と、ＩｇＧに対するアフィニティを有する少なくとも１つのクロマトグラフィ樹脂とを、該上清溶液中の該ＩｇＧの少なくとも一部が該クロマトグラフィ樹脂に結合可能な条件（ｐＨを含む）で接触させるステップ、並びに
（ｅ）溶出剤を用いて上記クロマトグラフィ樹脂から上記ＩｇＧを溶出するステップ
を含み、ステップ（ｆ）の溶出溶液が精製ＩｇＧを含むものである、上記方法。 - 前記フィードストックを哺乳動物から取得する、請求項１に記載の方法。
- 前記哺乳動物が有蹄動物である、請求項２に記載の方法。
- 前記有蹄動物が、ヒトＩｇＧを産生するトランスジェニックウシである、請求項３に記載の方法。
- 前記フィードストックが、血漿、血清、腹水、乳汁、及びポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を含む細胞培養上清からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
- 前記ステップ（ａ）のｐＨが約４．５〜４．８である、請求項１に記載の方法。
- 前記ポリアルカン酸がカプリル酸（ＣＡ）である、請求項１に記載の方法。
- 前記ＣＡが、ＣＡ溶液の量／総フィードストック溶液の量として計算して３〜１０％を占める、請求項７に記載の方法。
- ステップ（ｃ）の上清のｐＨを、ステップ（ｄ）のクロマトグラフィ樹脂に対して適切なｐＨに調整するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィ樹脂が、プロテインＡ、プロテインＧ、４−メルカプト−エチル−ピリジン、抗ヒトＩｇＧ抗体、及びプロテインＬからなる群より選択されるリガンドを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記抗ヒトＩｇＧ抗体が、ウマ抗ヒトＩｇＧ抗体又はラマ抗ヒトＩｇＧ抗体である、請求項１０に記載の方法。
- 前記ステップ（ｅ）からの精製ＩｇＧが少なくとも８０％の純度である、請求項１に記載の方法。
- 前記ステップ（ｅ）からの精製ＩｇＧが、１００ｐｐｍ未満の血清アルブミン又は５００ｐｐｍ未満の宿主の混入タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記ステップ（ａ）の前に、前記フィードストックの総タンパク質濃度を決定するステップをさらに含み、その場合、前記ステップ（ｂ）のｐＨ調整フィードストックと、前記モノ又はポリアルカン酸とを、該モノ又はポリアルカン酸と該総タンパク質濃度の比が約０．７５〜約２．２５となる量で接触させる、請求項１に記載の方法。
- 前記モノ又はポリアルカン酸と前記総タンパク質濃度の比が１〜２．２５である、請求項１４に記載の方法。
- フィードストックから免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を精製する方法であって、
（ａ）上記フィードストックのｐＨを約ｐＨ４．０〜５．５の範囲内に調整するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）からのｐＨ調整フィードストックと、炭素数４〜１２のモノ又はポリアルカン酸とを、沈殿物とＩｇＧを含む上清を形成するのに十分な量及び時間で接触させるステップ、
（ｃ）遠心分離又は濾過によりステップ（ｂ）の上清を沈殿物から分離するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）の上清のｐＨを中性ｐＨの範囲内に調整するステップ、
（ｅ）ｐＨ約４．５〜約６．０のバッファーに対してステップ（ｄ）の上清を透析するステップ、
（ｆ）膜媒介電気泳動を用いてステップ（ｅ）の上清から上記ＩｇＧを精製するステップ、並びに
（ｇ）精製ＩｇＧを回収するステップ
を含む上記方法。 - 前記フィードストックを哺乳動物から取得する、請求項１６に記載の方法。
- 前記哺乳動物が有蹄動物である、請求項１７に記載の方法。
- 前記有蹄動物が、ヒトＩｇＧを産生するトランスジェニックウシである、請求項１８に記載の方法。
- 前記フィードストックが、血漿、血清、腹水、乳汁、及びポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を含む細胞培養上清からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
- ステップ（ａ）のｐＨが約４．５〜４．８である、請求項１６に記載の方法。
- 前記ポリアルカン酸がカプリル酸（ＣＡ）である、請求項１６に記載の方法。
- 前記ＣＡが、ＣＡ溶液の量／総フィードストック溶液の量として計算して３〜１０％を占める、請求項２２に記載の方法。
- ステップ（ａ）の前に、前記フィードストックの総タンパク質濃度を決定するステップをさらに含み、その場合、前記ステップ（ｂ）のｐＨ調整フィードストックと、前記モノ又はポリアルカン酸とを、該モノ又はポリアルカン酸と該総タンパク質濃度の比が約０．７５〜２．２５となる量で接触させる、請求項１６に記載の方法。
- 前記ステップ（ｇ）からの精製ＩｇＧが少なくとも８０％の純度である、請求項１６に記載の方法。
- 前記ステップ（ｇ）からの精製ＩｇＧが、５％未満のＩｇＧ凝集体、１００ｐｐｍ未満のウシ血清アルブミン、５００ｐｐｍ未満の宿主の混入タンパク質、５ｐｐｍ未満のＤＮＡを含み、検出可能な感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）、検出可能なウイルスＤＮＡ又は検出可能なウイルス粒子を含まない、請求項１６に記載の方法。
- フィードストックからヒトＩｇＧを精製する方法であって、該フィードストックは、ヒトＩｇＧを発現する非ヒトトランスジェニック動物から取得したものであり、
（ａ）上記フィードストックと、リガンドとしてプロテインＡを含む少なくとも１つのクロマトグラフィ樹脂とを、該ヒトＩｇＧが該クロマトグラフィ樹脂に結合可能な条件で接触させるステップ、
（ｂ）上記クロマトグラフィ樹脂からヒトＩｇＧは解離せずに非ヒトＩｇＧの解離が生じるまで酸性度を高めていく１以上の洗浄バッファー系列で上記クロマトグラフィ樹脂を洗浄するステップ、並びに
（ｃ）ステップ（ｂ）の最も酸性度の高い洗浄バッファーよりさらに酸性度が高いｐＨを有する溶出剤を用いて、上記クロマトグラフィ樹脂から上記ヒトＩｇＧを溶出するステップ
を含み、ステップ（ｃ）の溶出溶液が精製ヒトＩｇＧを含むものである、上記方法。 - ステップ（ａ）の前に、以下のステップによりフィードストックを最初に精製する、請求項２７に記載の方法：
（ｉ）上記フィードストックのｐＨを約ｐＨ４．０〜５．５の範囲内に調整するステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）からのｐＨ調整フィードストックとＣＡとを、沈殿物とＩｇＧを含む上清を形成するのに十分な量及び時間で接触させるステップ、
（ｉｉｉ）遠心分離又は濾過を用いて、ステップ（ｉｉ）の上清を沈殿物から分離するステップ、並びに
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の上清のｐＨを中性ｐＨの範囲内に調整するステップ。 - 前記非ヒトトランスジェニック動物が有蹄動物である、請求項２７に記載の方法。
- 前記フィードストックが、血漿、血清、腹水及び乳汁からなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
- 前記ステップ（ｂ）の洗浄バッファーの系列が、２つのバッファーを含み、第１のバッファーは約５．０〜６．０のｐＨを有し、第２のバッファーは、第１のバッファーのｐＨより酸性度が高いｐＨを有する、請求項２７に記載の方法。
- 前記ステップ（ｂ）の洗浄バッファーの系列が、３つのバッファーを含み、第１のバッファーは約５．０〜６．０のｐＨを有し、第２のバッファーは、第１のバッファーのｐＨより酸性度が高いｐＨを有し、最後のバッファーは第２のバッファーのｐＨより酸性度が高いｐＨを有する、請求項２７に記載の方法。
- ステップ（ｃ）の溶出剤が約２．５〜３．５のｐＨを有する、請求項２７に記載の方法。
- 前記精製ヒトＩｇＧが少なくとも８０％の純度である、請求項２７に記載の方法。
- 前記精製ヒトＩｇＧが、その少なくとも８０％は非ヒトＩｇＧ又はキメラＩｇＧを含まないものである、請求項２７に記載の方法。
- フィードストックからＩｇＧ単量体を精製する方法であって、該フィードストックは、ＩｇＧ単量体と、さらにＩｇＧ二量体若しくは凝集体又はその両方を含み、
（ａ）上記フィードストックと、ＩｇＧに対するアフィニティを有する少なくとも１つのクロマトグラフィ樹脂であってメルカプト基及び芳香族ピリジン環を有するリガンドを含む該クロマトグラフィ樹脂とを、該ＩｇＧ単量体の少なくとも一部が該クロマトグラフィ樹脂に結合可能な条件で接触させるステップ、
（ｂ）少なくとも１つのバッファーで上記クロマトグラフィ樹脂を洗浄するステップ、並びに
（ｃ）酸性ｐＨを有する溶出剤を用いて、上記クロマトグラフィ樹脂から上記ＩｇＧ単量体を溶出するステップ
を含み、ステップ（ｃ）から得られる溶出液が精製ＩｇＧ単量体を含むものである、上記方法。 - 前記フィードストックを哺乳動物から取得する、請求項３６に記載の方法。
- 前記哺乳動物が有蹄動物である、請求項３７に記載の方法。
- 前記有蹄動物が、ヒトＩｇＧを産生するトランスジェニックウシである、請求項３８に記載の方法。
- 前記フィードストックが、血漿、血清、腹水、乳汁、及びポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を含む細胞培養上清からなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
- ステップ（ａ）の前に、以下のステップによりフィードストックを最初に精製する、請求項３６に記載の方法：
（ｉ）上記フィードストックのｐＨを約ｐＨ４．０〜５．５の範囲内に調整するステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）からのｐＨ調整フィードストックと、炭素数４〜１２のモノ又はポリアルカン酸とを、沈殿物とＩｇＧを含む上清を形成するのに十分な量及び時間で接触させるステップ、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の上清溶液を沈殿物から分離するステップ、並びに
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の上清のｐＨを中性ｐＨの範囲内に調整するステップ。 - 前記ポリアルカン酸がＣＡである、請求項４１に記載の方法。
- 前記ＩｇＧ二量体若しくは凝集体又はその両方が、製造及び精製プロセスの間に前記フィードストック中に生成される、請求項３６に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィ樹脂が、４−メルカプト−エチル−ピリジンリガンドを含む、請求項３６に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィ樹脂が、セルロース支持体をさらに含む、請求項４４に記載の方法。
- 前記バッファーが中性又は酸性ｐＨを有する、請求項３６に記載の方法。
- 前記ステップ（ｃ）から得られるＩｇＧ単量体が、その少なくとも８０％はＩｇＧ二量体若しくは凝集体又はその両方を含まないものである、請求項３６に記載の方法。
- 前記ステップ（ｃ）から得られるＩｇＧ単量体が少なくとも８０％の純度である、請求項３６に記載の方法。
- フィードストックからヒトＩｇＧを精製する方法であって、該フィードストックは、ヒトＩｇＧ及び非ヒトＩｇＧを含み、かつ、該フィードストックは、ヒトＩｇＧを発現するトランスジェニック非ヒト動物から取得したものであり、
（ａ）上記フィードストックと、上記ヒトＩｇＧに対するアフィニティを有する少なくとも１つのクロマトグラフィ樹脂とを、該ヒトＩｇＧが該クロマトグラフィ樹脂に結合可能な条件で接触させるステップ、
（ｂ）少なくとも１つのバッファーでステップ（ａ）のクロマトグラフィ樹脂を洗浄するステップであって、該バッファーが、上記クロマトグラフィ樹脂からヒトＩｇＧは解離せずに非ヒト宿主由来のＩｇＧの解離を生じる上記ステップ、
（ｃ）酸性ｐＨを有する溶出剤を用いて、上記クロマトグラフィ樹脂から上記ヒトＩｇＧを溶出するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）の溶出液のｐＨを中性ｐＨに調整するステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）の中性ｐＨ溶出液と、抗宿主ＩｇＧリガンドを含む少なくとも１つのクロマトグラフィ樹脂とを、上記非ヒトＩｇＧの少なくとも一部が、抗宿主ＩｇＧを含む該クロマトグラフィ樹脂に結合可能な条件で接触させるステップ、並びに
（ｆ）ステップ（ｅ）からのフロースルーを回収するステップ
を含み、該フロースルーが精製ヒトＩｇＧを含むものである、上記方法。 - 前記ステップ（ａ）のクロマトグラフィ樹脂が、プロテインＡ、プロテインＧ、４−メルカプト−エチル−ピリジン、抗ヒトＩｇＧ抗体、及びプロテインＬからなる群より選択されるリガンドを含む、請求項４９に記載の方法。
- 前記宿主がウシであり、前記抗宿主がウマである、請求項４９に記載の方法。
- 前記フィードストックが、血漿、腹水、血清及び乳汁からなる群より選択される、請求項４９に記載の方法。
- 前記ステップ（ｅ）の抗宿主ＩｇＧリガンドが、宿主のＩｇＧ重鎖又は軽鎖に特異的なリガンドである、請求項４９に記載の方法。
- 前記抗宿主ＩｇＧリガンドが、ＶＨＨリガンドである、請求項５３に記載の方法。
- 前記ステップ（ｅ）のクロマトグラフィ樹脂が、セファロース又はアガロースを含む、請求項４９に記載の方法。
- 前記ヒトＩｇＧが少なくとも８０％の純度である、請求項４９に記載の方法。
- 前記ヒトＩｇＧが、その少なくとも８０％は非ヒトＩｇＧ又はキメラＩｇＧを含まないものである、請求項４９に記載の方法。
- フィードストックからヒトＩｇＧを精製する方法であって、該フィードストックはヒトＩｇＧ及び非ヒトＩｇＧを含み、かつ、該フィードストックは、ヒトＩｇＧを発現するトランスジェニック非ヒト宿主から取得したものであり、
（ａ）上記フィードストックと、リガンドとして抗宿主ＩｇＧを含む少なくとも１つのクロマトグラフィ樹脂とを、該非ヒトＩｇＧが、抗宿主ＩｇＧを含む該クロマトグラフィ樹脂に結合可能な条件で接触させるステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）からの上記ヒトＩｇＧを含むフロースルーを回収するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）のフロースルーと、上記ヒトＩｇＧに対するアフィニティを有する少なくとも１つのクロマトグラフィ樹脂とを、該ヒトＩｇＧの少なくとも一部が該クロマトグラフィ樹脂に結合可能な条件で接触させるステップ、
（ｄ）少なくとも１つのバッファーでステップ（ｃ）のクロマトグラフィ樹脂を洗浄するステップであって、その際、該バッファーが、上記クロマトグラフィ樹脂からヒトＩｇＧは解離せずに非ヒト宿主由来のＩｇＧの解離を生じる、上記ステップ、
（ｅ）酸性ｐＨを有する溶出剤を用いて、ステップ（ｄ）のクロマトグラフィ樹脂から上記ヒトＩｇＧを溶出するステップ、
（ｆ）ステップ（ｅ）の溶出液のｐＨを中性ｐＨに調整するステップ
を含み、該溶出液が精製ヒトＩｇＧを含むものである、上記方法。 - 前記ステップ（ａ）の抗宿主ＩｇＧリガンドが、宿主のＩｇＧ重鎖又は軽鎖に特異的なリガンドである、請求項５８に記載の方法。
- 前記抗宿主ＩｇＧリガンドが、ＶＨＨリガンドである、請求項５９に記載の方法。
- 前記ステップ（ａ）のクロマトグラフィ樹脂が、セファロース又はアガロースを含む、請求項５８に記載の方法。
- 前記宿主がウシであり、前記抗宿主がウマである、請求項５８に記載の方法。
- 前記フィードストックが、血漿、腹水、血清及び乳汁からなる群より選択される、請求項５８に記載の方法。
- 前記ステップ（ｃ）のクロマトグラフィ樹脂が、プロテインＡ、プロテインＧ、４−メルカプト−エチル−ピリジン、抗ヒトＩｇＧ抗体、及びプロテインＬからなる群より選択されるリガンドを含む、請求項５８に記載の方法。
- 前記ヒトＩｇＧが少なくとも８０％の純度である、請求項５８に記載の方法。
- 前記ヒトＩｇＧが、その少なくとも８０％は非ヒトＩｇＧ又はキメラＩｇＧを含まないものである、請求項５８に記載の方法。
- ステップ（ａ）の前に、以下のステップによりフィードストックを最初に精製する、請求項４９又は５８に記載の方法：
（ｉ）上記フィードストックのｐＨを約ｐＨ４．０〜５．５の範囲内に調整するステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）からのｐＨ調整フィードストックと、炭素数４〜１２のモノ又はポリアルカン酸とを、沈殿物とＩｇＧを含む上清を形成するのに十分な量及び時間で接触させるステップ、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の上清溶液を沈殿物から分離するステップ、並びに
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の上清のｐＨを中性ｐＨの範囲内に調整するステップ。 - フィードストックからヒトＩｇＧを精製する方法であって、該フィードストックは、ヒトＩｇＧを発現するトランスジェニック非ヒト宿主から取得したものであり、
（ａ）上記フィードストックと、非ヒト宿主のＩｇＧ重鎖又は軽鎖に特異的な少なくとも１つのリガンドを含む少なくとも１つのクロマトグラフィ樹脂とを、非ヒト宿主のＩｇＧ重鎖又は軽鎖が、少なくとも１つのリガンドを含む該クロマトグラフィ樹脂に結合可能な条件で接触させるステップ、並びに
（ｂ）ステップ（ａ）からのフロースルーを回収するステップ
を含み、該フロースルーが精製ヒトＩｇＧを含むものである、上記方法。 - 前記フィードストックが、血漿、血清、腹水及び乳汁からなる群より選択される、請求項６８に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィ樹脂が、セファロース又はアガロースを含む、請求項６８に記載の方法。
- 前記リガンドが、ＶＨＨリガンドである、請求項６８に記載の方法。
- 前記精製ヒトＩｇＧが、その少なくとも８０％は非ヒトＩｇＧ又はキメラＩｇＧを含まないものである、請求項６８に記載の方法。
- 膜媒介電気泳動を用いて、精製ＩｇＧを精製するステップをさらに含む、請求項１、２７、３６、４９、５８、及び６８のいずれか１項に記載の方法。
- 非ヒトトランスジェニック宿主由来のフィードストックを用いて作製される精製ヒトＩｇＧの調製物であって、少なくとも２：１のヒトＩｇＧと非ヒト宿主ＩｇＧの比を有する調製物。
- 前記比が少なくとも１０：１である、請求項７４に記載の調製物。
- 前記比が少なくとも１００：１である、請求項７４に記載の調製物。
- 非ヒトトランスジェニック宿主由来のフィードストックを用いて作製される精製ヒトＩｇＧの調製物であって、少なくとも２：１のヒトＩｇＧと非ヒト宿主ＩｇＧの比を有し、かつ、請求項１、１６、２７、３６、４９、５８、及び６８のいずれか１項に記載の方法又はそれらの組合せにより作製される調製物。
- 非ヒトトランスジェニック宿主由来のフィードストックを用いて作製される精製ヒトＩｇＧの調製物であって、１％未満の非ヒトＩｇＧ又は４０％未満のキメラＩｇＧを含む調製物。
- 非ヒトトランスジェニック宿主由来のフィードストックを用いて作製される精製ヒトＩｇＧの調製物であって、１００ｐｐｍ未満のウシ血清アルブミン又は５ｐｐｍ未満のＤＮＡを含む調製物。
- 非ヒトトランスジェニック宿主由来のフィードストックを用いて作製される精製ヒトＩｇＧの調製物であって、５００ｐｐｍ未満の宿主の混入タンパク質を含む調製物。
- 非ヒトトランスジェニック宿主由来のフィードストックを用いて作製される精製ヒトＩｇＧの調製物であって、検出可能なレベルのウイルスＤＮＡ、ウイルス粒子又は感染性海綿状脳症を含まない調製物。
- 前記非ヒトトランスジェニック宿主が哺乳動物である、請求項７４、７８、７９、８０又は８１に記載の調製物。
- 前記哺乳動物が有蹄動物である、請求項８２に記載の方法。
- 前記有蹄動物が、ヒトＩｇＧを産生するトランスジェニックウシである、請求項８３に記載の方法。
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