KR102146414B1 - 단백질 a 기반 친화성 크로마토그래피 컬럼의 세정 방법 - Google Patents

단백질 a 기반 친화성 크로마토그래피 컬럼의 세정 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 스타필로코커스 아우레우스의 C 도메인으로부터 유도된 단백질 A 리간드를 포함하는 매질을 이용하는 단백질 A 크로마토그래피 컬럼의 세정 방법을 제공하며, 상기 컬럼은 산성 및 알칼리성 용액 모두를 사용하여 세정될 수 있다.

Description

단백질 A 기반 친화성 크로마토그래피 컬럼의 세정 방법{METHODS OF CLEANING A PROTEIN A BASED AFFINITY CHROMATOGRAPHY COLOUMN}
본 발명은 단백질 A 크로마토그래피 컬럼의 세정(cleaning) 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 단백질의 C 도메인(domain)을 기본으로 하는 리간드를 함유하는 친화성 크로마토그래피 매질을 이용하는 단백질 A 기반(protein A based) 친화성 크로마토그래피 컬럼의 세정 방법에 관한 것이다.
본 출원은 ASCII 포맷(ASCII format)으로 전자적으로 제출된 서열목록을 함유하며 본 명세서에 그 전체가 참조에 의해 포함된다. 2014년 6월 3일 작성된 상기 ASCII 카피는 P13-136PCT_SL.txt라 명명되며 6,289 바이트 크기이다.
통상의 단백질 정제 방법들은 예를 들어, 관심 단백질을 생성하도록 재조합 처리된(recombinantly engineered) 포유동물 또는 세균 세포주를 사용하는 세포 배양법을 전형적으로 포함하며, 다음이 따라온다:
(a) 예를 들어, 상이한 원심분리 및/또는 여과를 이용하여 세포 및 세포 파쇄물(cellular debris)을 제거하기 위한 정화(clarification) 단계; 및
(b) 정화된 세포 배양액 공급물 중의 다양한 불순물로부터 관심 단백질을 분리하는 하나 이상의 하류 크로마토그래피 단계.
단일클론 항체(monoclonal antibodies) 및 기타 Fc-함유 단백질의 경우, 정제를 위한 공업 표준은 전형적으로 다단계 공정을 포함한다. 중요한 단계 중의 하나는 항체의 Fc-영역(Fc-region)과 결합하는 단백질 A라 불리는 친화성 리간드를 이용하는 정제 단계이다. 전형적으로, 대부분의 불순물은 이 단계에서 제거된다. 단백질 A 친화성 크로마토그래피는 항체를 정제하는 동안 매우 효과적인 단계이지만, 단백질 A를 이용하는 한가지 결점은 이온 교환 수지에 비하여 매우 비싼 것이다. 또한 친화성 크로마토그래피 컬럼의 충전 및 비우기(packing and unpacking)는 아주 노동 집약적이고 상당한 완충액 비용도 수반한다. 따라서, 단백질 A 컬럼을 몇 주기 동안 세정하여 재사용하고 위생화(sanitize)할 수 있는 것이 요망된다.
현재, 가장 상업적으로 유용한 단백질 A 매질을 이용하는 크로마토그래피 컬럼은 알칼리성 조건 또는 산성 조건을 이용하여 세정된다. 예를 들어, MabSelect Sure® (GE 제조), KanCap A (Kaneka 제조) 및 ToyoPearl® AF-rProtein A 650F (Tosoh 제조) 매질을 이용하는 크로마토그래피 컬럼은 수산화나트륨과 같은 알칼리성 용액을 사용하여 세정되는 반면에, ProSep® Ultra Plus 매질 (EMD 밀리포어 코포레이션 제조)을 이용하는 크로마토그래피 컬럼은 세정을 위해 산성 용액을 사용한다.
본 발명은 고체 지지체에 고정된(immobilized) 스타필로코커스 아우레우스 단백질 A의 C 도메인을 기본으로 하는 리간드를 함유하는 매질을 이용하는 크로마토그래피 컬럼의 세정 방법을 제공하며, 상기 컬럼은 산성 및 알칼리성 용액을 사용하여 세정될 수 있다.
상기 논의한 바와 같이, 가장 상업적으로 유용한 단백질 A 매질을 이용하는 크로마토그래피 컬럼은 산성 또는 알칼리성 용액에 대한 노출 연장을 위한 단백질 A 리간드 또는 기본 매트릭스(base matrix)의 불안정성으로 인하여 산성 용액 또는 알칼리성 용액을 사용하여 세정될 수 있다. 이러한 크로마토그래피 컬럼을 이용하는 정제 공정은 알칼리성 조건하에서의 세정만 또는 산성 조건하에서의 세정만을 수용하도록 적절히 설정된다.
본 발명에 따른 방법은 고체 지지체 상에 고정된 단백질 A의 C 도메인을 기본으로 하는 리간드를 포함하는 매질을 이용하는 크로마토그래피 컬럼이 알칼리성 조건하에서 세정될 수 있게 하거나 또는 알칼리성 조건하에서의 세정 대신 산성 조건하에서 세정될 수 있게 함으로써, 작동에서 더 큰 유연성을 제공한다. 이러한 매질을 이용하는 크로마토그래피 컬럼의 효과적인 세정을 가능하게 함으로써, 본 발명에 기재된 방법은 수많은 주기에 걸쳐서 컬럼의 결합능(binding capacity)을 보존할 수 있다. 또한, 이러한 매질을 이용하는 크로마토그래피 컬럼의 세정을 가능하게 함으로써, 세정을 위해 알칼리성 조건 단독 또는 산성 조건 단독을 이용하는 것에 비하여 더 많은 불순물 제거를 달성하여, 더 큰 생성물 순도를 초래한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 친화성 정제 주기에 걸쳐서 친화성 크로마토그래피 컬럼의 결합능을 보존하는 방법이 제공되며, 이 방법은 하나 이상의 친화성 정제 주기 후의 크로마토그래피 컬럼을 3.0 아래의 pH를 갖는 산성 용액을 사용하여 세정하는 단계를 포함하며, 상기 친화성 크로마토그래피 컬럼은 폴리비닐에테르, 폴리비닐알코올, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 및 폴리카보네이트로 구성된 군으로부터 선택된 중합체를 포함하는 고체 지지체에 고정된 스타필로코커스 아우레우스 단백질 A의 C 도메인으로부터 유도된 단백질 A 리간드를 포함하는 매질을 포함한다.
일부 다른 실시양태에서, 산성 및 알칼리성 용액 모두를 사용하여 친화성 크로마토그래피 컬럼을 세정하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 1 주기 후에 컬럼을 산성 및 알칼리성 용액 모두와 접촉시키는 단계; 또는 (b) 1 주기 후에 컬럼을 산성 용액과 접촉시키거나 또는 1주기 후에 알칼리성 용액과 접촉시키며, 산성 및 알칼리성 용액이 교대되는 방식으로 사용되도록 하는 단계를 포함하여, 상기 친화성 크로마토그래피 컬럼은 고체 지지체에 고정된 스타필로코커스 아우레우스 단백질 A의 C 도메인으로부터 유도된 단백질 A 리간드를 포함하는 매질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단백질 A 리간드는 SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 고체 지지체는 폴리비닐에테르, 폴리비닐알코올, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 및 폴리카보네이트로 구성된 군으로부터 선택된 중합체를 포함한다. 특별한 실시양태에서, 고체 지지체는 폴리비닐에테르 중합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 산성 용액은 pH 1.5 또는 pH 2.0 또는 pH 2.5를 갖는다.
일부 실시양태에서, 결합능은 10주기 이상 동안 보존된다. 다른 실시양태에서, 결합능은 50 주기 이상 동안 보존된다. 더 다른 실시양태에서, 결합능은 100 주기 이상 동안 보존된다. 또 다른 실시양태에서, 결합능은 200 주기 이상 동안 보존된다.
사용후의 친화성 크로마토그래피 컬럼을, 컬럼의 결합능을 유지하면서, 위생화하는 방법이 또한 제공되며, 상기 방법은 친화성 크로마토그래피 컬럼을 인산, 아세트산 및 벤질 알코올을 포함하는 용액과 적어도 3시간 동안 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 친화성 크로마토그래피 컬럼은 폴리비닐에테르, 폴리비닐알코올, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 및 폴리카보네이트로 구성된 군으로부터 선택된 고체 지지체에 고정된 스타필로코커스 아우레우스 단백질 A의 C 도메인으로부터 유도된 단백질 A 리간드를 포함한다.
도 1은 (1) 0.3% 염산 pH 1.5; (2) 0.15 M 인산, pH 1.5; (3) 0.1 M NaOH; 및 (4) 0.5 M NaOH에 100주기(15분/주기)에 상응하는 25시간 동안 노출될 때 수지 A, B 및 C의 정적 결합능(static binding capacity) 보유 퍼센트를 측정하는 실험의 결과를 도시하는 막대 그래프이다. 3개 수지 샘플 전부는 대조군과 비교하여 0.3% HCl 및 0.15 M H3PO4에 25시간 노출 후 95% 이상의 결합능을 유지함을 나타낸다. 수지 A 및 B는 대조군과 비교하여 0.5 M NaOH 노출시 대략 75%의 결합능을 보유한다. 수지 C는 대조군과 비교하여 0.1 M NaOH 노출시 대략 65%의 결합능을 보유한다. 수지 C는 대조군과 비교하여 0.5 M NaOH 노출시 대략 38%의 결합능을 보유한다. 표준편차는 대략 3%이다.
도 2는 수지 B를 (1) 0.1 M NaOH 및 0.15 M 인산, pH 1.5 을 10주기 마다 교대하는 것에 의한 세정; (2) 인산 세정 만에 의한 세정; 및 (3) 0.1 M NaOH 알칼리성 용액만을 사용한 세정에 100 주기 및 200 주기 노출시킨 후의 동적 결합능(dynamic binding capacity) 보유 퍼센트(4분 체류 시간에서 10%)를 측정하는 실험의 결과를 도시하는 막대 그래프이다. 인산 및 NaOH 및 0.15 M H3PO4의 교대 노출에 의한 200 주기(15분/주기) 이후; 0.15 M H3PO4에만 200주기(15분/주기) 노출 후, 또는 0.1 M NaOH에 200주기(15분/주기) 노출 후에도 동적 결합능(10% 파과(breakthrough))의 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 표준편차는 대략 10%이다.
단백질 A 친화성 크로마토그래피는 컬럼에 충전된(packed) 단백질 A 수지 또는 매질(즉, 고체 지지체에 고정된 단백질 A 리간드)에 Fc-함유 단백질(예를 들어, 면역글로불린 또는 다른 Fc-융합 단백질)을 결합시키는 단계 및 이어, 상기 컬럼으로부터 Fc-함유 단백질을 용리(elution)시키는 단계를 포함한다. 크로마토그래피 컬럼의 효과적인 사용을 위해 또 컬럼이 재사용될 수 있는 주기 수를 최대화하기 위하여 제자리 세정(cleaning-in-place, CIP)이 중요하다. 크로마토그래피 수지에 해를 주기 않고도 불순물을 효과적으로 제거하는 세정 과정이 일반적으로 요청된다. 상업적으로 유용한 단백질 A 수지의 대부분의 세정뿐만 아니라 위생화를 위해 전형적으로 사용되는 가장 일반적인 세정 용액 중의 하나는 수산화나트륨(NaOH)이다(참조, 예를 들어, Hagel L et. al. Handbook of Process Chromatography - Development, Manufacturing, Validation and Economics. Second edition. London, UK: Academic Press; 2008. Cleaning and Sanitization; pp. 147-159; Gronberg et al., MAbs. 2011 Mar-Apr; 3(2): 192-202). 전형적으로, 수많은 후속 주기를 컬럼 모드로 실시할 때, 크로마토그래피 수지 상에 오염물이 점차 형성될 수 있어, 컬럼 폐색(fouling)과 컬럼 효율 및 결합능 감소를 초래한다. 주기들 동안 유효한 세정은 크로마토그래피 컬럼 상의 오염물 형성을 최소화하여, 컬럼의 수명을 연장시킨다. 이를 컬럼 재생이라 칭한다.
가장 상업적으로 유용한 단백질 A 수지는 수산화나트륨과 같은 알칼리성 용액을 사용하여 세정되는 반면에, ProSep® Ultra Plus 수지 (EMD 밀리포어 코포레이션 제조)는 인산(H3PO4)을 사용하여 세정된다.
본 발명은 고체 지지체에 고정된 스타필로코커스 아우레우스 단백질 A의 C 도메인을 기본으로 하는 리간드를 함유하는 매질을 이용하는 크로마토그래피 컬럼이 산성 및 알칼리성 용액 모두를 사용하여 세정될 수 있다는 놀랍고도 예상치 못한 발견을 적어도 기초로 한다. 산성 및 알칼리성 용액 모두를 사용한 컬럼의 세정을 가능하게 함으로써, 작동에서 유연성이 더 커질 뿐만 아니라 정제 공정 동안 세정을 위해 알칼리성 및 산성 용액 모두를 사용할 때, 더 큰 단백질 순도를 달성할 수 있다.
본 발명의 내용이 더욱 용이하게 이해될 수 있도록 하기 위하여, 특정 용어를 먼저 정의한다. 부가적 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 설명된다.
I. 정의
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "SpA", "단백질 A" 또는 "스타필로코커스 아우레우스 단백질 A"는 스타필로코커스 아우레우스 세균으로부터 단리된 42 kDa 멀티-도메인 단백질을 지칭한다. SpA는 X 도메인으로부터 불리는 그의 카복시-말단 세포벽 결합 영역을 통하여 세균 세포벽에 결합된다. 아미노-말단 영역에서, SpA는 E, D, A, B, 및 C로 지칭되는 5개의 면역글로불린-결합 도메인을 포함한다(Sjodhal, Eur J Biochem. Sep 78(2):471-90 (1977); Uhlen et al., J Biol Chem. Feb 259(3):1695-702 (1984)). 이들 도메인의 각각은 대략 58개 아미노산 잔기를 함유하며, 또 이들은 65-90%의 아미노산 서열 동일성(sequence identity)을 갖는다.
SpA의 E, D, A, B 및 C 도메인 각각은 분명한 Ig-결합 부위를 보유한다. 1개 부위는 Fc(Ig의 IgG 클래스의 불변영역(constant region))용이고 또 나머지는 특정 Ig 분자의 Fab 부분(항원 인식에 관여하는 Ig의 부분)용이다. 상기 도메인의 각각은 Fab 결합 부위를 함유하는 것으로 보고되어 있다. SpA의 비-Ig 결합 부분은 C-말단에 위치하며 또 X 영역 또는 X-도메인이라 명명된다.
본 발명에서 상호교환적으로 사용되는 바와 같이, 용어 "C 도메인", "SpA의 C 도메인", "단백질 A의 C 도메인" 및 "스타필로코커스 아우레우스 단백질 A의 C 도메인"은 아미노산 서열이 SEQ ID NO:1에 기재되어 있거나 또는 예를 들어, SEQ ID NO:2에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩(encoded)되는 폴리펩티드를 지칭한다. "C 도메인"은 3개의 나선 번들 구조로 접어지는 58개 아미노산 폴리펩티드이다. 나선 1 및 2의 표면 상에 있는 잔기를 통하여 Fc 결합 또는 나선 2 및 3의 표면 상에 있는 잔기를 통하여 Fab 결합할 수 있다.
본 발명에 기재된 방법에 사용된 바와 같이 단백질 A의 C 도메인을 기본으로 하는 단백질 A 리간드는 SEQ ID NO:1에 기재된 아미노산 서열에 대하여 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 리간드를 포함한다.
다양한 실시양태에서, 본 발명에 기재된 방법에 사용된 단백질 A의 C 도메인을 기본으로 하는 단백질 A 리간드는 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "크로마토그래피"는 표적 단백질(예를 들어, 면역글로불린 또는 다른 Fc-함유 단백질)과 같은 표적 분자를 혼합물 중의 다른 분자로부터 분리하여 단리되게 하는 동적 분리 수법을 지칭한다. 전형적으로, 크로마토그래피 방법에서, 이동상(mobile phase) (액체 또는 가스)은 정지상 (stationary phase)(보통 고체) 매질을 거쳐 또는 매질을 통하여 관심있는 표적 분자를 함유하는 샘플을 수송한다. 정지상에 대한 분배 또는 친화성에서의 차이는 선택 분자가 정지상에 일시적 결합을 유발하는 한편, 이동상은 상이한 분자들을 상이한 시간에 전달한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "친화성 크로마토그래피"는 분리될 단백질 분자 (예를 들어, Fc-함유 단백질)와 같은 표적 분자가 크로마토그래피 수지 상에 고정된 분자 (예를 들어, 단백질 A 기반 리간드)와 자물쇠와 열쇠 상호작용에 의해 단리되는 크로마토그래피 모드를 지칭한다. 이러한 특정의 상호작용은 표적 분자가 결합되게 하면서 바람직하지 않은 분자는 통과하게 한다. 이동상의 온도, pH, 이온 강도에서의 변화는 고순도의 표적 분자를 방출한다. 본 발명에 기재된 다양한 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피는 표적 분자 (예를 들어, 면역글로불린 또는 다른 Fc-함유 단백질)를 함유하는 샘플을, 단백질 A의 C 도메인을 기본으로한 리간드를 지니고 있는 고체 지지체(단백질 A 친화성 크로마토그래피 매질 또는 수지라 칭함)에 부가하는 것을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "단백질 A 친화성 크로마토그래피"는 본 발명에 기재된 바와 같이 단백질 A의 C 도메인을 기본으로 하는 단백질 A 또는 SpA-계 리간드를 사용한 물질의 분리 또는 단리를 지칭하며, 상기 SpA 또는 단백질 A 리간드는 고체 지지체 상에 고정되어 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "리간드"는 고체 지지체 (예를 들어, 다공성 표면) 상에 고정되고 또 Fc-함유 단백질을 결합할 수 있는 단백질 A의 C 도메인을 기본으로 하는 생물학적 분자를 지칭한다. 본 발명에 기재된 일부 실시양태에서, 리간드는 SEQ ID NO:3에 기재된 아미노산 서열, 또는 그의 변이체, 단편 또는 유도체를 포함한다. 본 발명에 기재된 일부 다른 실시양태에서, 리간드는 SEQ ID NO:4에 기재된 아미노산 서열, 또는 그의 변이체, 단편 또는 유도체를 포함한다.
용어 "고체 지지체"는 일반적으로 리간드가 부착된 임의 물질(다공성 또는 비다공성)을 지칭한다. 리간드를 고체 지지체에 부착시키는 것은 그라프팅(에테르, 티오에테르, 탄소-탄소 결합, 또는 다른 결합을 통한)의 경우에서와 같이 공유결합을 통하여, 또는 코팅, 접착, 흡착, 및 유사 메카니즘을 통하여 실시될 수 있다. 본 발명에 기재된 방법에 사용된 예시적 고체 지지체는 폴리비닐에테르, 폴리비닐알코올, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 및 폴리카보네이트를 포함한다.
당해 분야에 공지된 단백질 A 친화성 크로마토그래피 매질/수지의 예는 예를 들어, PROSEP® A 및 PROSEP® vA 매질/수지(EMD MILLIPORE)와 같은 제어된 기공 유리 골격 상에 고정된 단백질 A를 갖는 것; 예를 들어, POROS® 50A 및 POROS® MabCapture™ A 매질/수지(APPLIED BIOSYSTEMS, INC.)와 같이, 폴리스티렌 고상에 고정된 단백질 A를 갖는 것; 및 예를 들어, rPROTEIN A SEPHAROSE FAST FLOW™ 또는 MABSELECT™ 매질 또는 수지(GE HEALTHCARE)와 같이 아가로오스 고체 지지체 상에 고정된 단백질 A를 갖는 것을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 본 발명에 기재된 방법에 이용된 단백질 A 리간드는 폴리비닐에테르, 폴리비닐알코올, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 및 폴리카보네이트로 구성된 군으로부터 선택된 고체 지지체 상에 고정된다.
특별한 실시양태에서, 본 발명에 기재된 방법에 사용된 리간드는 폴리비닐에테르 중합체에 고정된다. 참고, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,951,885호, 참조에 의해 그 전체가 본 발명에 포함됨.
본 발명에서 상호교환적으로 사용되는 바와 같은, 용어 "친화성 수지" 또는 "친화성 크로마토그래피 수지" 또는 "친화성 매질" 또는 "친화성 크로마토그래피 매질"은 예를 들어 본 발명에 기재된 것과 같은 고체 지지체에 부착된 친화성 크로마토그래피 리간드(예를 들어, 단백질 A의 C 도메인을 기본으로 함)를 지칭한다. 일반적으로, 용어 "수지" 및 "매질"은 본 발명에서 상호교환적으로 사용된다.
본 발명에서 상호교환적으로 사용되는 바와 같은, 용어 "표적 단백질" 또는 "관심 단백질"은 단백질 A의 C 도메인, 또는 그의 변이체 또는 유도체를 사용하여 정제될 수 있는 단백질을 지칭한다. 다양한 실시양태에서, 표적 단백질은 예를 들어, 면역글로불린 또는 Fc-융합 단백질과 같은 Fc-함유 단백질이다.
용어 "면역글로불린", "Ig" 또는 "항체"(본 발명에서 상호교환적으로 사용됨)는 2개의 중쇄(heavy chain) 및 2개의 경쇄(light chain)로 구성된 기본적 4-폴리펩티드 사슬 구조를 갖고, 항원을 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 단백질을 지칭하며, 상기 사슬들은 예를 들어 사슬간 다이설파이드 결합에 의해 안정화된다. 용어 "단일사슬 면역글로불린" 또는 "단일사슬 항체" (본 발명에서 상호교환적으로 사용됨)는 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄로 구성된 2-폴리펩티드 사슬 구조를 갖고, 항원을 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 단백질을 지칭하며, 상기 사슬들은 예를 들어 사슬간 펩티드 링커에 의해 안정화된다. 용어 "도메인"은 예를 들어, β-병풍구조(β-pleated sheet) 및/또는 사슬내 다이설파이드 결합에 의해 안정화된 펩티드 루프(예를 들어, 3 내지 4개 펩티드 루프를 포함)를 포함하는 일개의 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드의 구상 영역(globular region)을 지칭한다. 도메인은 "불변" 도메인의 경우에 다양한 클래스 멤버의 도메인 내에서 서열 변이의 상대적 결여를 기본으로 하거나, 또는 "가변(variable)" 도메인의 경우 다양한 클래스 멤버의 도메인 내에서 현저한 변이를 기본으로 하여 "불변" 또는 "가변"으로도 또한 지칭된다. 항체 또는 폴리펩티드 "도메인"은 당해 분야에서 상호교환적으로 항체 또는 폴리펩티드 "영역"으로 지칭된다. 항체 경쇄의 "불변" 도메인은 상호교환적으로 "경쇄 불변 영역", "경쇄 불변 도메인", "CL" 영역 또는 "CL" 도메인으로 지칭된다. 항체 중쇄의 "불변" 도메인은 상호교환적으로 "중쇄 불변 영역", "중쇄 불변 도메인", "CH" 영역 또는 "CH" 도메인이라 칭한다. 항체 경쇄의 "가변" 도메인은 상호교환적으로 "경쇄 가변 영역", "경쇄 가변 도메인", "VL" 영역 또는 "VL" 도메인이라 칭한다. 항체 중쇄의 "가변" 도메인은 상호교환적으로 "중쇄 가변 영역", "중쇄 가변 도메인", "VH" 영역 또는 "VH" 도메인으로 칭한다.
면역글로불린 또는 항체는 단일클론성 또는 다중클론성일 수 있고 또 다량체 또는 중합체 형태로 존재할 수 있고, 예를 들어, IgM 항체는 오량체 형태로 존재하고 및/또는 IgA 항체는 단량체, 이량체 또는 다량체 형태로 존재한다. 용어 "단편"은 무손실(intact) 또는 완전 항체 또는 항체 사슬보다 적은 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체 사슬의 일부 또는 부분을 지칭한다. 단편들은 무손실 또는 완전 항체 또는 항체 사슬의 화학적 또는 효소적 처리를 통하여 얻을 수 있다. 단편들은 재조합적 수단에 의해서도 얻을 수 있다. 예시적 단편들은 Fab, Fab', F(ab')2, Fc 및/또는 Fv 단편을 포함한다.
본 발명의 방법은 단백질 A에 결합할 수 있는, 비제한적으로 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라(chimeric) 항체, 또는 그의 단편을 포함하는 항체 또는 그의 단편의 정제 동안 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 기재된 방법은 치료용 항체를 정제하는 동안 사용된다.
예시적 치료용 항체는 Herceptin™; Rituxan™; Avastin™; Bexxar™; Campath™; Erbitux™; Humira™; Raptiva™; Remicade™; ReoPro™; Prolia®; Xgeva®; Simulect™; Synagis™; Xolair™; Zenapax™; Mylotarg™; 및 Vectibix™를 포함한다. 예시적 Fc 융합 단백질은 수용체(receptor) 또는 효소 및 그의 변이체, 유도체 또는 유사체의 가용성 형태에 대한 융합물, 예를 들어, ENBREL®를 포함한다.
본 발명에 기재된 방법에 의해 정제된 표적 단백질은 Fc 영역을 함유하므로 단백질 A에 의한 정제에 적합한 것으로 이해된다. 본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "Fc 영역" 또는 "Fc"는 단백질 A와 상호작용하는 면역글로불린 분자의 아미노산 잔기를 지칭한다. Fc 영역은 항체의 결정화가능한 꼬리 영역이고 또 Fc 수용체라 불리는 세포 표면 수용체와 상호작용한다.
용어 "Fc-결합", "Fc 부분에 결합하는" 또는 "Fc 부분에 대한 결합"은 본 발명에 기재된 친화성 리간드가 항체의 불변 부분(Fc)에 결합하는 능력을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 리간드는 적어도 10-7 M, 또는 적어도 10-8 M, 또는 적어도 10-9 M의 친화성을 갖는 항체 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4)의 Fc 부분에 결합한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "단편(들)"은 예를 들어, 면역글로불린과 같은 전장(full length) Fc-함유 단백질의 부분을 지칭한다. 단편들의 예는 Fab 단편, 단일사슬 항체 분자, 다이어바디(diabodies), 선형 항체, 및 항체 단편로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
본 발명에 기재된 방법을 이용하여 정제되는 면역글로불린 및 기타 Fc-함유 단백질은 적합한 발현계 또는 세포 유형을 사용하여 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역글로불린 또는 다른 Fc-함유 단백질은 포유동물 세포, 예를 들어, CHO 또는 NS0 세포, 하이브리도마(hybridoma), 마우스 세포 등에서 발현된다. 다른 실시양태에서, 면역글로불린 또는 다른 Fc-함유 단백질은 비-포유동물 세포 배양액(예를 들어, 곤충 세포, 효모 세포, 대장균(Escherichia coli) 등)을 사용하여 발현된다. 세포 배양액에서 발현에 이어, 불용성 종은 예를 들어, 심층 여과(depth filtration), 원심분리, 응집/석출(예를 들어, 산 석출 또는 자극-감응성 중합체)과 같은 정화 방법을 이용하여 전형적으로 제거된다. 이러한 정화된 세포 배양액은 숙주 세포 단백질, DNA, 바이러스, 또는 기타 불순물과 같은 가용성 불순물로부터 면역글로불린 또는 Fc-함유 단백질을 분리하기 위하여 단백질 A 컬럼 상에 전형적으로 로딩(loaded)된다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "정제된 폴리펩티드" 또는 "정제된 단백질"은 본 발명에 기재된 바와 같은 pH 구배 또는 pH 단계 방법을 이용하여 단백질 A 친화성 단계로부터 얻은 용리된 생성물이다. 정제된 폴리펩티드/단백질은 바람직하게는 대부분의 폴리펩티드 단량체를 함유한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "비정제된 폴리펩티드", "비정제된 단백질", 또는 "단백질 로딩"은 단백질 A 친화성 정제 단계 이전에 로딩 물질 또는 출발 물질 중의 폴리펩티드 또는 단백질이다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "Fc-함유 단백질의 순도"는 본 발명에 기재된 세정 과정을 이용하는 정제 공정 이후의 단백질 A 크로마토그래피 컬럼으로부터 용리된 전체 단백질에 대하여 표적 단백질(즉, Fc-함유 단백질)의 단량체 종으로서 정의된다. 따라서, 상기 순도는 최종 용리 풀(pool) 중의 전체 단백질에 대한 전체 단량체의 비율로 산출될 수 있다. 전체 단백질은 표적 단백질의 하나 이상의 단백질 단편, 응집물, 단량체 종 및 그의 변이체를 함유할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "세정"은 컬럼의 성능과 통합성을 보유하기 위하여 친화성 크로마토그래피 컬럼, 예를 들어, 단백질 A 컬럼 상에 남겨진 미량의 불순물을 제거하는 것을 수반하는 표적 단백질 (예를 들어, 면역글로불린 또는 다른 Fc-함유 단백질)의 정제 공정 동안의 단계를 지칭한다. 세정 단계는 컬럼으로부터 불순물을 제거하는 한편, 이상적으로는 결합능(컬럼이 정제할 수 있는 표적 단백질의 양) 및/또는 해상도(바람직하지 않은 성분으로부터 표적 단백질을 분리하는 컬럼 중의 수지 또는 매질에 대한 성능)를 이용하여 측정되는 바와 같이, 컬럼의 성능에 대한 최소의 영향을 가져야 한다. 예를 들어, 스타필로코커스 단백질 A 또는 그의 유도체를 이용하는 가장 상업적으로 유용한 친화성 크로마토그래피 컬럼은 산성 용액 또는 알칼리성 용액을 사용하여 세정된다. 예를 들어, MabSelect SuRe® 단백질 A 컬럼은 희석 NaOH를 사용하여 세정된다. 한편, Prosep® 단백질 A 컬럼은 일반적으로 인산을 사용하여 세정된다. 그러나, 현재 가장 상업적으로 유용한 단백질 A 수지는 극한 pH 하에서 불안정하므로 산성 및 알칼리성 조건 모두를 사용하여서는 세정될 수 없다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "제자리 세정(cleaning-in-place)" 또는 "CIP"는 파이프, 용기, 공정 장치, 필터 및 관련 피팅부(fittings)의 내부 표면을 해체없이 세정하는 방법이다. CIP를 이용하는 이점은 세정이 신속하고, 덜 노동집약적이며 또 더 많이 반복될 수 있고, 또 인간에 대한 화학약품 노출 우려가 적은 점이다. 크로마토그래피 컬럼에 있어서, CIP는 컬럼을 비우지 않고(unpacking) 수지 물질뿐만 아니라 컬럼 본체 및 단부 피팅부를 세정하는 것을 지칭한다. 통상, 1회 분석(run)한 후 세정된 크로마토그래피 컬럼은 다음 분석을 위해 즉시 재평형화되거나, 또는 단시간 또는 장기간 저장을 위해 위생화된다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "주기" 또는 "친화성 주기" 또는 "단백질 A 친화성 크로마토그래피 정제 주기"는 단백질 A 기반 수지를 이용하는 크로마토그래피 컬럼을 중성 완충액을 사용하여 평형화하는 것으로 개시된 다음; 정화된 세포 배양액 공급물을 컬럼에 로딩하며, 이때 상기 정화된 세포 배양액 공급물은 정제될 Fc-함유 단백질(예를 들어, 단일클론 항체)를 함유함; 이어 컬럼을 1 내지 3개의 상이한 완충액을 사용하여 세정하여 단백질 A 수지에 대한 Fc-함유 단백질의 결합을 방해하지 않는 느슨하게 결합된 불순물을 제거하며; 이어 용리 완충액(예를 들어, pH 2.5-4.5)을 사용하여 단백질 A 컬럼으로부터 Fc-함유 단백질을 용리시키는 다단계 공정을 지칭한다. 상술한 평형화, 로딩, 세정 및 용리의 다단계 공정이 일개 주기 또는 결합 및 용리 주기를 이룬다. 일개 주기는 전형적으로 다음 주기 이전에 컬럼 상의 미량의 불순물을 제거하기 위한 세정 단계로 이어진다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "캠페인(campaign)"은 특정 시간 기간 내에 소망하는 양의 물질을 생성하기 위하여 차례차례 실시되는 개별 정제 공정 또는 주기의 몇개 라운드를 지칭한다. 단일클론 항체를 포함하는 Fc-함유 단백질의 정제의 경우, 일개 캠페인은 죄총 충전을 위해 정제된 소정량의 단백질을 전달하기 위하여 후속 정제 단계와 함께 몇 회의 바이오리액터 작업을 전형적으로 포함한다. 세정은 캠페인 내에서 실시되는 작업 사이에 통상 실시되지만, 캠페인이 완료되면, 단백질 A 기반 리간드를 이용하는 크로마토그래피 컬럼을 포함한 크로마토그래피 컬럼은 또한 저장을 위해 더 위생화되며, 상기 컬럼은 전형적으로 수일 또는 수주 또는 수개월 이후일 수 있는 다음 캠페인에서 다시 사용될 수 있기 때문에 저장을 위해 더 위생화된다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "위생화" 또는 "위생화하는" 또는 "위생화한다"는 것은 캠페인의 완료 후 사용된 단계이며 FDA 또는 기타 감독기관에 의해 결정되는 바와 같이, 안전하거나 허용가능한 수준으로 미생물 집단을 감소시키기 위해 설계된다. 위생화는 가열 또는 화학물질을 이용하여 전형적으로 달성된다. 다음 캠페인까지 저장되는 크로마토그래피 컬럼은, 가열 위생화의 비실용성으로 인하여, 화학적 수단에 의해 일반적으로 위생화된다. 가장 상업적으로 유용한 단백질 A 리간드를 이용하는 컬럼을 비롯한 대부분의 친화성 크로마토그래피 컬럼은 0.5 M 이하의 NaOH를 사용하여 위생화된다. 그러나, 0.5 M NaOH는 또한 단백질 A 리간드 상의 NaOH의 탈아미노 효과로 인하여 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지의 성능을 현저하게 감소시키는 것으로 알려져 있다. 본 발명에 기재된 일부 실시양태에서, 인산, 아세트산 및 벤질 알코올을 포함하는 용액(PAB)이 위생화를 위해 사용된다. 단백질 A 친화성 매질의 ProSep® 패밀리의 경우에 위생화제로서 PAB(120 mM 인산, 167 mM 아세트산, 2.2% 벤질 알코올)가 사용될 수 있다는 것은 이전에 알려져 있지만, 모든 단백질 A 매질, 특히 알칼리성 조건 하에서 일반적으로 세정되거나 또는 위생화되는 매질에 적합한 것은 아니라고 생각된다. 참고, M. Rogers et al., J. Chromatogr. A 1216 (2009) 4589-4596.
용어 "로드 밀도" 또는 "로딩 밀도"는 크로마토그래피 매질 부피당 크로마토그래피 컬럼 상에 로딩된 면역글로불린 또는 다른 Fc-함유 단백질 함유 샘플의 양이다. 로딩 밀도는 g/L로 측정된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 5 g/L, 또는 10 g/L 또는 12 g/L, 또는 15g/L, 또는 20g/L, 또는 30 g/L, 또는 40 g/L 또는 그 이상의 로딩 밀도로 로딩된다.
"완충액"은 산-염기 결합물 성분의 작용에 의한 pH 변화를 견디는 용액이다. 예를 들어 완충액의 소망하는 pH에 따라 이용될 수 있는 다양한 완충액이 완충액에 기재된다. 참조, A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., Ed. Calbiochem Corporation (1975).
본 발명에서 "평형화 완충액"은 표적 단백질을 로딩하기 위한 고체 지지체(고정화된 단백질 A를 갖는)를 제조하기 위해 사용된다.
본 발명에서 "세척(wash) 완충액"은 표적 단백질을 로딩한 다음 표적 단백질을 용리하기 이전에 고체 지지체(고정된 단백질 A 가짐) 상을 통과하는 완충액을 지칭한다.
용어 "결합능"은 소정 조건하에서 실시된 컬럼에 충전된 소정 부피의 수지 또는 매질에 결합하는 분자의 양을 지칭한다. 결합능은 정적 결합능 또는 동적 결합능으로서 측정될 수 있다. 정적 결합능의 경우, 분자 및 수지가 무한 양의 시간 동안 접촉할 때 소정 부피의 수지에 결합하는 분자의 양이 결정된다. 정적 결합능은 수지가 결합할 수 있는 표적 분자의 최고 양을 측정한다. 실제로, 상기 값은 과잉 양의 표적 분자를 최소의 유동 또는 유동없이 4시간 또는 그 이상 동안 수지와 접촉시키는 것에 의해 흔히 얻어진다. 한편, 동적 결합능은 설정 유동 속도에서 수지의 부피당 수지가 결합될 수 있는 표적 분자의 양이다. 어떤 수지의 동적 결합능은 기본 조건에 따라 상당히 달라진다. 일반적으로, 유동속도가 낮을 수록, 동적 결합능이 더 높다. 유동 속도가 0에 가까와짐에 따라서, 결합능은 최대 유용 능력- 정적 결합능에 접근한다. 적절한 세정 및 위생화 없이는, 단백질 A 수지의 결합능은 복수의 결합 및 용리 주기 후에 초기값 아래로 전형적으로 떨어진다. 크로마토그래피 방법/공정 개발하는 동안 설정되는 특정 값보다 결합능이 아래이면, 상당 양의 표적 단백질이 "파과"할 수 있거나, 또는 불순물을 함유하는 분획을 따라 유동함에 따라 공동용리되어, 생성물 손실을 초래한다. 적합한 화학물질을 사용한 적절한 세정은 연장된 기간에 걸쳐 수지 결합능을 유지할 수 있다. 이는 상이한 상업적으로 이용가능한 수지에 대해 설정된 조건을 기본으로 하여, 0.1 M NaOH와 같은 알칼리성 용액 또는 0.15 M H3PO4 와 같은 산성 용액을 사용하여 전형적으로 달성된다. 그러나, 본 발명에 기재된 방법의 경우에서, 산 및 알칼리성 용액은 수지의 결합능을 유지하면서 세정에 사용될 수 있다.
II. 단백질 A 크로마토그래피
단백질 A 크로마토그래피는 예를 들어, 면역글로불린또는 항체와 같은 Fc-함유 단백질의 정제에 가장 흔히 사용되는 친화성 크로마토그래피의 형태이다. 일반적으로, 표적 단백질(예를 들어, 면역글로불린 또는 다른 Fc-함유 단백질)은 적합한 세포 배양액에서 발현되며 또 상기 세포 배양액 공급물은 정화된 공급물을 예를 들어, 크로마토그래피 컬럼에 충전된 단백질 A 크로마토그래피 매질 상에 로딩하기 전에, 정화에 처리된다.
단백질 A 크로마토그래피는 예를 들어, 적합한 단백질 A 리간드가 위에 고정되어 있는 다공성 비드 또는 수지와 같은 고체 지지체를 일반적으로 이용한다. 단백질 A 결합된 고체 지지체는 크로마토그래피 컬럼에 충전된다. 상기 컬럼은 먼저 적합한 평형화 완충액에 의해 평형화될 수 있다. 이는 포스페이트 염수 완충액, 또는 트리스(Tris) 완충액, pH 7-7.5,와 같은 중성 pH 완충액을 단백질 A 수지를 통하여 3-10 컬럼 부피(column volmes, CVs)로 흘려주는 것에 의해 보통 달성된다. 표적 단백질을 함유하는 정화된 공급물은 컬럼에 표적 단백질(예를 들어, 표적 단백질을 함유하는 정화된 세포 배양액 공급물)을 함유하는 샘플을 로딩하는 것에 의해 컬럼 중의 고체 지지체와 접촉한다. 정화된 로딩 공급물의 양은 공급물 중의 Fc-함유 단백질의 농도(티터) 및 설정 유동 속도에서 단백질 A 수지에 대한 Fc-함유 단백질의 결합능에 의해 결정된다. 전형적으로, 숙주 세포 단백질 및 DNA와 같은 가용성 불순물은 단백질 A에 결합되지 않으므로 통과액에서 제거되어 폐기물로 전환된다. 로딩 완료 후, 상기 컬럼은 1 내지 3개의 상이한 완충액을 사용하여 세척되어 단백질 A 수지에 대한 표적 단백질의 결합을 방해하지 않는 느슨하게 결합된 불순물을 제거한다. 이 단계는 중간 세척 단계로도 지칭된다. 또한 이는 이후 용리 완충액(예를 들어, pH 2.5-4.5)을 사용하여 단백질 A 컬럼으로부터 용리될 때 표적 단백질 순도를 개선한다. 일반적 용리 완충액은 아세트산 및 시트르산, pH 2.5-4.5 이다. 용리를 위한 전형적 유동속도는 60 컬럼 부피(CV)/시간 내지 5 CV/시간이다. 구배 용리의 경우, 전형적으로 용리는 5 내지 60 컬럼 부피에 걸쳐 실시된다. 일부 실시양태에서, 고 pH 완충액 및 저 pH 완충액을 혼합하여 pH 7.0 내지 3.0 범위의 pH 구배를 생성한다. 일부 실시양태에서, 상기 pH 구배는 7.0, 또는 약 6.8, 또는 약 6.6, 또는 약 6.4, 또는 약 6.2, 또는 약 6.0, 또는 약 5.8, 또는 약 5.6, 또는 약 5.4, 또는 약 5.2, 또는 약 5.0, 또는 약 4.8, 또는 약 4.6, 또는 약 4.4, 또는 약 4.2, 또는 약 4.0이고, 또 상기 pH 구배는 3.0, 또는 약 3.2, 또는 약 3.4, 또는 약 3.6, 또는 약 3.8에서 끝난다.
평형화, 로딩, 세척 및 용리 단계들은 일개 주기 또는 일개 결합 및 용리 주기를 구성한다. 전형적 단백질 정제 주기의 이러한 결합 및 용리 주기 이후 대개 컬럼 위의 미량의 불순물을 제거하기 위한 세정 단계, 이어 다른 결합 및 용리 주기가 실시된다. 전형적인 정제 캠페인은 복수의 결합 및 용리 주기를 차례로 구성하며, 주기들 사이 또는 각 주기 후에 세정 단계가 실시된다.
단백질 A 친화성 수지의 세정은 수지가 수지의 수명 주기에 걸쳐 지속적으로 정제를 실시하도록, 또는 다르게 말해, 수지의 결합능을 보존하도록 각 주기 후에 일반적으로 실시된다. 세정은 다음 2가지 이유에서 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 특히 중요하다: (1) 단백질 A 수지는 이온 교환 또는 소수성 상호작용(hydrophobic interaction, HIC) 수지와 비교하여 높은 초기 비용을 갖고; 또 (2) 단백질 A 크로마토그래피 수지는 고 수준의 불순물을 함유하는 정화된 세포 배양액에 전형적으로 노출된다. 따라서, 일부 잔류 불순물이 단백질 A 수지에 결합될 수 있어, 상기 수지의 재사용시 결합능의 손실 또는 용리 풀 불순물의 증가를 초래한다. 이는 생산성 감소(결합능 감소로 인한) 및 불량한 생성물 순도를 초래하므로 제조 설정에서 아주 바람직하지 않다. 각 단백질 A 결합 및 용리 주기 이후의 통상의 세정은 지속적인 수지 성능을 보장하는데 중요하며, 이는 지속적인 생성물 순도 및 공정 처리량(throughput)을 초래한다.
세정은 전형적으로 극한 pH, 예를 들어, 2개의 일반적으로 사용되는 세정 시약인 0.15 M H3PO4 (pH 1.5) 또는 0.1 M NaOH (pH =13)를 사용하여 달성된다. 예를 들어, 0.15 M H3PO4는 단백질 A 친화성 수지의 ProSep® 패밀리에 대해 추천되어 사용되고 있다. H3PO4 세정의 이점은 단백질 A 수지의 결합능을 희생하지 않고도 수지를 세정하는 것이다. 반면에, 0.1 M NaOH는 단백질 A 친화성 수지의 MabSelect SuRe® 패밀리에 대해 추천되어 사용된다; 그러나, NaOH와 같은 알칼리성 용액은 단백질 A 리간드의 탈아미노로 인하여 시간이 지남에 따라 단백질 A 수지의 결합능을 감소시킬 가능성이 있다.
본 발명에 기재된 일부 실시양태에서, 세정은 산성 및 알칼리성 용액 모두를 사용하여 실시된다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 컬럼은 각 주기 이후에 산성 용액뿐만 아니라 알칼리성 용액과 접촉한다. 다른 실시양태에서, 크로마토그래피 컬럼은 한 주기 이후에 산성 용액 또는 알칼리성 용액과 접촉하여 산성 및 알칼리성 용액이 정제 캠페인 동안 교대되는 방식으로 사용된다. 예를 들어, 크로마토그래피 컬럼이 제1 주기 후에 알칼리성 용액과 접촉한 다음, 제2 주기 후에 산성 용액과 접촉하고, 이어 제3 주기 이후에 다시 알칼리성 용액과 접촉하는 식이다. 역으로, 크로마토그래피 컬럼이 제1 주기 이후에 산성 용액과 접촉하면, 제2 주기 후에 알칼리성 용액과 접촉하고, 이어 제3 주기 후에 산성 용액과 접촉하는 식이다.
세정을 위해 산성 및 알칼리성 용액을 사용하는 것은 하나의 산성 또는 알칼리성 용액을 사용하는 것에 비하여 상승작용적인(synergistic) 불순물 제거를 초래한다. 다시 말해, 세정을 위해 산성 및 알칼리성 용액을 사용하는 것(본 발명에 기재된 바와 같이 한 주기 후에 양쪽을 모두 사용하는 것 또는 교대되는 방식으로 사용하는 것)은 정제 공정 동안 산성 세정 단독 또는 알칼리성 세정 단독을 이용하는 것에 의한 제거의 합에 비하여 더 높은 불순물 제거를 초래한다. 어떠한 이론에 얽매이지 않고, 산성 및 알칼리성 용액 각각은 상이한 유형의 불순물을 제거한다.
III. 본 발명에 기재된 방법에 사용된 예시적 리간드
본 발명에 따른 방법은 단백질 A의 C 도메인을 기본으로 하는 단백질 A 리간드를 이용한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 기재된 방법에 사용된 리간드는 SEQ ID NO:1에 기재된 아미노산 서열에 대하여 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 그 이상으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 기재된 방법에 사용된 단백질 A 리간드는 SEQ ID NO:3에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명에 기재된 방법에 사용된 단백질 A 리간드는 SEQ ID NO:4에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. Fc-함유 단백질을 결합하는 이들 서열의 변이체, 단편 및 유도체도 본 발명에 포함된다.
IV. 본 발명에 기재된 방법에 사용된 예시적 고체 지지체
일부 실시양태에서, 본 발명에 기재된 방법에 사용된 단백질 A 리간드는 지지체, 예를 들어, 고체 지지체 또는 가용성 지지체에 고정되어, 예를 들어, 면역글로불린 및 기타 Fc-함유 단백질과 같은 바이오분자를 분리하기에 적합한 친화성 크로마토그래피 매질 또는 수지를 생성한다.
예시적 고체 지지체는 합성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐에테르, 폴리비닐알코올, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 및 폴리카보네이트를 기본으로 한 지지체를 포함한다.
예시적 고체 지지체 포맷은, 비제한적으로, 비드(구상 또는 불규칙), 중공 섬유, 고형 섬유, 패드, 겔, 막, 카세트, 컬럼, 칩, 슬라이드, 플레이트 또는 모노리스(monolith)를 포함한다.
본 발명에 기재된 리간드를 고체 지지체 부착시키기 위해 적합한 수법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 상기 리간드는 예를 들어 리간드에 존재하는 아미노 및/또는 카복시기를 이용하는 통상의 커플링 수법을 통하여 고체 지지체에 부착될 수 있다. 예를 들어, 비스에폭사이드, 에피클로로히드린, CNBr, N-히드록시숙신이미드(NHS) 등이 잘 공지된 커플링 시약이다. 일부 실시양태에서, 고체 지지체와 리간드 사이에 스페이서(spacer)를 도입하며, 이는 리간드의 유용성을 개선하고 또 지지체에 대한 리간드의 화학적 커플링을 용이하게 한다.
일부 실시양태에서 리간드 위의 하나 이상의 부위가 (복수지점 부착을 통하여) 고체 지지체 부착되는 것도 본 발명의 범위에 포함된다.
일반적으로, 고체 지지체에 대한 단백질 A 기반 크로마토그래피 리간드의 부착은 다수의 상이한 방식을 통하여 달성될 수 있고, 그 대부분은 당해 분야에 공지되어 있고 본 발명에 기재된 것이다. 참조, 예를 들어, Hermanson et al., Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, pp. 51-136 (1992).
V. 단백질 A 크로마토그래피 컬럼의 세정 및 위생화
크로마토그래피 컬럼의 세정은 컬럼 성능을 유지하고 컬럼 수명 기간을 연장하기 위하여 각 주기 이후에 일반적으로 실시되는 것이다. 통상, 각 주기가 완료된 후, 세정 용액을 컬럼에 15 내지 30분간 로딩한 다음, 재평형화 완충액 또는 위생화 완충액(컬럼이 저장 준비된 것인 경우)으로 처리된다. 보통의 세정 용액은 0.05-0.3 M NaOH, 또는 0.15 M H3PO4 이다. 세정하는 동안 유동 속도는 사용되는 특정 수지 및 크로마토그래피계를 기본으로 하여 전형적으로 결정된다. NaOH는 생물제약 산업 분야에서 일반적으로 사용되는 세정 용액이지만, 0.15 M H3PO4 와 같은 산성 용액은 오염물을 효과적으로 제거할 수 있고 또 특정 예에 사용된다.
단백질 A 크로마토그래피의 경우, ProSep® 패밀리의 생성물을 세정하기 위하여 H3PO4를 사용하는 반면에, MabSelect SuRe® 패밀리의 생성물을 세정하기 위하여 NaOH가 사용되는 것이 일반적이다. 그러나, 가장 상업적으로 유용한 단백질 A 매질은 알칼리성 용액 또는 산 용액만을 사용하여 세정될 수 있다.
그러나, 본 발명에 기재된 방법의 경우에서, 고체 지지체에 고정된 스타필로코커스 아우레우스의 C 도메인을 기본으로 하는 단백질 A 수지는 산 및 알칼리성 용액 모두를 사용하여 세정될 수 있다. 알칼리성 및 산성 용액 모두를 사용하는 것은 각 용액 개별을 비교할 때 바람직하지 않은 불순물의 상승작용적 제거를 초래한다.
크로마토그래피 컬럼의 위생화는 컬럼이 캠페인에 사용된 후 및 저장 준비되기 전에 일반적으로 실시된다. 위생화 용액은 3-5 컬럼 부피 동안 미리 설정된 유동 속도로 컬럼에 로딩된다. 상기 유동은 위생화제에 대해 소정 시간이 작용하여 표적으로 하는 미생물 치사를 달성하도록 중지된다. 상기 위생화제는 저장 완충액으로 치환되고 컬럼은 저장 준비된다. NaOH는 이온 교환 및 소수성 상호작용 크로마토그래피에 대하여 일반적 위생화제이지만, 단백질 A 친화성 크로마토그래피용으로는 덜 지속적이다. NaOH는 단백질 위의 아스파라긴을 공격하여 단백질의 분해를 초래하는 것으로 알려져 있다. 단백질 A 리간드에 대해 예외는 없다. 아스파라긴의 돌연변이를 통하여 단백질 A 리간드의 알칼리성 안정성을 개선하려는 노력이 시도되었다; 그러나, NaOH는 야생형에 대하여 더 느린 속도에서도 여전히 단백질 A를 분해한다. 이는 NaOH (0.1-0.3 M)를 사용한 15-30 분간의 세정과 비교하여, 더 높은 농도의 NaOH (0.5 M)가 더 긴 시간(즉, 3-4 시간)을 요하기 때문에 위생화에 있어서 특히 문제가 된다.
더욱 효과적인 위생화 용액은 본 발명에서 PAB라 칭한다. 이것은 120 mM 인산, 167 mM 아세트산, 2.2% 벤질 알코올로 구성된다. PAB는 미생물을 효과적으로 또 신속하게 치사시킨다. PAB는 ProSep® 패밀리의 생성물과 함께 사용하는 것으로 이전에 기재되어 있었고, 이는 산성 용액을 사용하여서만 세정될 수 있고, Genentech 및 EMD 밀리포어 코포레이션에 의해 공동 개발되었다(M. Rogers et al. J. Chromatogr. A 1216 (2009) 4589-4596).
본 발명은 이하의 실시예에 의해 더욱 자세하게 설명되지만, 제한을 의미하지 않는다. 본 출원을 통하여 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 공개 특허출원뿐만 아니라 도면은 참조에 의해 본 발명에 포함된다.
실시예
실시예 1: SpA 리간드의 생성
SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 합성 유전자는 DNA 2.0 (Menlo Park, CA)로부터 입수하였다. 각 합성 유전자의 5' 말단은 개시 메티오닌에 대한 코돈을 포함한다. 각 유전자의 5' 및 3' 말단은 NdeI 및 BamHI 제한 부위를 각각 함유한다. 이들 합성 유전자뿐만 아니라 사용된 발현 벡터, 즉 pET11a (EMD 밀리포어 코포레이션 제조, 매사추세츠 빌레리카 소재)는 NdeI 및 BamHI(NEW ENGLAND BIOLABS, Ipswich, MA)으로 분해시켰고, DNA 단편들은 0.7% 아가로오스 TAE 겔 상에서 분리하였으며 또 적절한 DNA 단편을 절제해내어 QIAGEN (Valencia, CA) 제조 겔 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 정제된 삽입물은 T4 DNA 리가제(NEW ENGLAND BIOLABS, Ipswich, MA)를 사용하여 pET11a 골격에 결찰시키거나 또는 다른 적합한 발현 벡터에 결찰시켰다.
상기 결찰 반응은 제조자의 지시에 따라서 DH5α 컴피텐트(competent) 대장균(INVITROGEN, Carlsbad, CA)으로 형질전환시키고, 100 ㎍/mL 암피실린을 함유하는 Technova LB 플레이트 상에 플레이팅하고, 또 37℃에서 철야로 배양하였다. 정제된 DNA를 얻기 위하여, 개별 콜로니를 선택하여 100 ㎍/mL 암피실린을 함유하는 LB에서 철야로 배양하였다. QIAGEN (Valencia, CA)이 제조한 스핀 미니-프렙 키트(spin mini-prep kits)를 이용하여 DNA를 정제하였다. 재조합 플라스미드의 동일성은 NdeI 및 BamHI(NEW ENGLAND BIOLABS, Ipswich, MA)를 사용한 제한 분해 분석에 의해 확인하였다.
실시예 2: SpA-계 리간드의 발현 및 정제
본 발명에 기재된 다양한 SpA 리간드를 발현하기 위하여 적합한 세균 발현계가 이용될 수 있다. 예를 들어, 상기 단백질은 pET11a (EMD)와 같은 pET 벡터를 이용하여 균주 BL21(DE3) (PROMEGA, Madison WI)와 같은 대장균 균주에서 발현될 수 있다.
단일 콜로니를 플레이트로부터 선택하여 100 ㎍/mL 암피실린을 함유하는 LB 배지, 37℃에서 철야로 생장시켰다. 철야 배양액은 100 ㎍/mL 암피실린을 함유하는 신선한 LB 배지로 100배 희석시키고 또 600 nm에서 광학밀도가 ~0.8이 되는 세포 밀도로 생장시켰다. 1 mM 이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노사이드를 부가한 다음, 세포를 추가의 2시간 동안 생장시켰다. 발현은 SDS-PAGE 분석과 웨스턴 블럿팅(Western blotting)에 의해 확인되었다.
세포들을 원심분리(4000 rpm, 4℃, 5분)에 의해 수집하고 또 20 mM 이미다졸을 함유하는 3 mL의 포스페이트 완충 염수에 재현탁시켰다. 세포들을 초음파에 의해 용균시키고, 세포 파쇄물은 원심분리(4000 rpm, 4℃, 30 분)에 의해 펠릿화하였다. SpA 리간드는 50 mL IgG 친화성 수지(제어된 기공 글래스 상에 고정된 다중클론 hIgG)를 사용하고, 500 mL 세포 용균물을 적용하여 정제된다. 컬럼을 30 mL 포스페이트 완충 염수를 사용하여 세척하여 SpA를 0.1 M 시트르산, pH 3 에 용리시킨다. SpA는 철야로 Milli-Q® water (EMD 밀리포어 코포레이션 제조, 매사추세츠 빌레리카 소재)에 투석된다. 단백질 농도는 이론적 소광 계수를 기본으로 하여 UV 분광계(Pace et. al., Protein Science 4:2411(1995)를 이용하여 확인하였다.
실시예 3: 고체 지지체에 대한 SpA-계 리간드의 부착
실시예 1 및 2에 기재된 바와 같은 다양한 리간드의 생성 및 발현에 이어, 리간드를 중점점 부착을 통하여 고체 지지체에 고정시킨다.
예시적 실험에서, 단백질 A 리간드(SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열, 10~20 mg/mL)는 1~1.1 M Na2SO4 존재하에서 철야로 고체 지지체 상의 에폭시기와 리간드 상의 수많은 아미노기의 반응을 통하여 가교 폴리비닐에테르 고체 지지체(Merck KGaA proprietary materials)에 고정시킨다(Hermanson et. al. Academic Press, 1992, page 118). 상기 수지를 수지 A로 명명한다.
SEQ ID NO:4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 리간드와 천연 단백질 A(론짜 리미티드 제조, 스위스 소재)를 커플링하는 방법은 상기 방법과 유사하며 또 상응하는 수지는 수지 B 및 수지 C로 나타낸다.
실시예 4: 수지 A, B 및 C의 산 및 알칼리성 용액에 대한 연장된 노출
이 실험에서, 상기 기재된 수지 A, B 및 C 각각을 다양한 산성 및 알칼리성 용액에 노출시킨다. 이하의 용액을 제조한다: HCl (0.3%, v/v), pH 1.5; H3PO4 (0.15 M), pH 1.5; 0.1 M NaOH 및 0.5 M NaOH.
수지 A, B, 및 C(각 용액 조건에 대하여 각 수지 2 ml가 이중(duplicate) 사용된다)를 5" 일회용 컬럼(Evergreen Scientific, Los Angeles, CA)으로 전달하고 또 상술한 용액 중의 하나에서 5분간 처리시켰다. 상기 용액은 진공에 의해 제거하고 또 수지는 15 mL 폴리프로필렌 원추형 튜브(ThermoFisher, Waltham, MA)에 전달한 다음, 10 mL의 상응하는 용액을 부가하였다. 상응하는 용액 중의 수지 슬러리 튜브를 실온에서 LabQuake® 로테이터(ThermoFisher, Waltham, MA)에 25시간 동안 로딩한 다음 Evergreen 5" 일회용 컬럼에서 5회 4 mL의 Milli-Q® water (EMD 밀리포어 코포레이션 제조, 매사추세츠 빌레리카 소재)를 사용하여 3회 세척하였다.
표 1: 샘플 및 시험 조건. 각 샘플은 2회 사용됨.
Figure 112019129601586-pat00001
실시예 5. 연장된 알칼리성 및 산 노출 전후의 수지 A, B 및 C의 정적 결합능 평가
이 실험에서, 0.3 % HCl; 0.15 M H3PO4; 0.1 M NaOH; 또는 0.5 M NaOH에 노출되는 수지 A, B 및 C (1 mL 부피) 각각을 20% 에탄올의 저장 완충액에서 150 mM NaCl과 함께 저장된 대조용 샘플과 함께, Milli-Q® water(EMD 밀리포어 코포레이션 제조, 매사추세츠 빌레리카 소재) 중의 10% 슬러리로 만들었다. 각 수지 슬러리 1 mL를 10 mM 포스페이트 염수 완충액 중의 15 mL의 다중클론 IgG (SERACARE, 1 mg/mL))에 부가하고 또 실온에서 4시간 동안 부드럽게 혼합하였다. 280 nm에서 UV 흡수율을 이용하여 산 또는 알칼리 노출 전후의 수지 IgG 결합능을 산출하였다. 보유된 IgG 결합능의 퍼센트는 산 또는 알칼리성 노출 후의 IgG 결합능을 산 또는 알칼리성 조건에 노출되지 않은 대조군 샘플의 IgG 결합능으로 나누어서 산출하였다.
도 1은 이러한 실험의 결과를 도시한다. 전체 3개 수지 샘플은 0.3% HCl 또는 0.15 M H3PO4에 25 시간 동안 노출될 때 대조군과 비교하여 초기 결합능의 95% 이상을 보유함을 나타낸다. 수지 A 및 B는 0.1 M NaOH에 노출될 때 대조군과 비교하여 95% 이상의 결합능을 보유하며 또 0.5 M NaOH에 노출될 때 대조군과 비교하여 대략 75%의 결합능을 보유한다. 수지 C는 0.1 M NaOH에 노출될 때 대조군과 비교하여 대략 65% 결합능을 보유하며 또 0.5 M NaOH에 노출될 때 대조군과 비교하여 대략 38%의 결합능을 보유한다. 시험의 표준편차는 대략 1-3%이다. 따라서, 알칼리성 용액 노출시의 수지 A 및 B의 보유된 결합능은 동등할 것으로 생각된다.
실시예 6: 연장된 산 노출 전후의 수지 B의 동적 결합능 평가
이 실험에서는 시판되는 다중클론 IgG를 사용하여 수지 동적 결합능을 시험하기 위한 표준 방법이 이용된다. 간단히 말해, 본 발명에 따른 수지 B를 50 mM Tris w 25 mM NaCl, 5 mM ETDA, pH 7.2 (EQ 완충액)에서 Omnifit 컬럼 (6.6 mm x 50 mm)에 충전시키고 또 유동 속도는 100 cm/hr로 설정하였다. 충전된 컬럼은 EQ 완충액을 사용하여 10 컬럼 부피(CVs) 동안 평형화되었다. 다중클론 IgG (Seracare, EQ 완충액, pH 7.2 중의 2 mg/mL)는, UV280 nm 가 초기 IgG 농도의 50% 이상에 도달할 때까지 컬럼 상에 로딩하였다. 평형화 완충액을 사용하여 세척한 후, IgG는 0.1 M 아세트산, pH 3.0을 사용하여 용리되었다. 최초 실시(run)의 EQ 완충액을 사용한 컬럼 평형화 이후, 상기 수지는 0.15 M H3PO4 를 사용하여 25시간 동안 50 cm/hr 유속으로 세척하였고, 이어 다른 IgG 동적 능력 측정을 실시하였다. 0.15 M H3PO4에 다시 25시간 노출을 실시한 다음 제3 동적 결합능 측정을 실시하였다. 노출 주기는 15분 동안의 노출로 규정된다. 따라서, 25시간 노출이 총 100 주기를 나타낸다. 2번의 25시간 노출은 총 200 주기의 노출을 나타낸다.
10% 파과(breakthrough)에서 동적 결합능은 UV280 nm가 초기 IgG 농도의 10%에 도달할 때 로딩된 IgG의 양을 기본으로 하여 산출된다. 25시간 및 50시간 노출 전후의 측정된 동적 결합능을 비교하여 도 2에 수록한다. 0.15 M H3PO4에 대한 200 주기(15 분/주기) 노출시 수지 동적 결합능에서는 유의한 변화가 관찰되지 않았다.
실시예 7: 연장된 알칼리 노출 전후에 수지 B의 동적 결합능 평가
이 실험에서는 시판되는 다중클론 IgG를 사용하여 수지 동적 능력을 시험하는 표준 방법이 이용되었다. 간단히 말해, 본 발명에 따른 수지 B는 50 mM Tris w 25 mM NaCl, 5 mM ETDA, pH 7.2 에서 Omnifit 컬럼 (6.6 mm x 50 mm)에 충전되었고 또 유동 속도는 100 cm/hr으로 설정하였다. 충전된 컬럼은 10 컬럼 부피(CVs) 동안 EQ 완충액을 사용하여 평형화시켰다. 다중클론 IgG (Seracare, EQ 완충액, pH 7.2 중의 2 mg/mL)은, UV280 nm 가 초기 IgG 농도의 50% 이상에 도달할 때까지 컬럼 상에 로딩하였다. 평형화 완충액을 사용하여 세척한 후, IgG는 0.1 M 아세트산, pH 3.0을 사용하여 용리되었다. 최초 실시(run)의 EQ 완충액을 사용한 컬럼 평형화 이후, 상기 수지는 0.1 M NaOH를 사용하여 25시간 동안 50 cm/hr의 유동 속도로 세척한 다음, 다른 IgG 동적 결합능 측정을 실시하였다. 0.1 M NaOH에 추가의 25시간의 노출은 제3 동적 결합능 측정에 의해 실시하였다. 노출 주기는 15분 노출로 규정되었다. 따라서, 25 시간 노출은 총 100 주기의 노출을 나타낸다. 2번의 25 시간 노출은 총 200 주기의 노출을 나타낸다. 노출 주기는 15분 노출로 규정된다. 따라서, 25 시간 노출은 총 100 주기를 나타낸다.
10% 동적 결합능은 UV280nm가 초기 IgG 농도의 10%에 도달할 때 로딩된 IgG의 양을 기본으로 하여 산출된다. 25시간 및 50시간 노출 전후의 측정된 동적 결합능을 비교하여 도 2에 도시한다. 0.1 M NaOH에 대한 200 주기(15 분/주기) 노출시 수지 동적 결합능에서는 유의한 변화가 관찰되지 않았다.
실시예 8: 교대되는 방식의 연장된 산 및 알칼리성 노출 전후에 수지 B의 동적 결합능 평가
이 실험에서는, 시판되는 다중클론 IgG를 사용하여 수지 동적 능력을 시험하는 표준 방법이 이용되었다. 간단히 말해, 본 발명에 따른 수지 B는 50 mM Tris w 25 mM NaCl, 5 mM ETDA, pH 7.2 에서 Omnifit 컬럼 (6.6 mm x 50 mm)에 충전되었고 또 유동 속도는 100 cm/hr으로 설정하였다. 충전된 컬럼은 10 컬럼 부피(CVs) 동안 EQ 완충액을 사용하여 평형화시켰다. 다중클론 IgG (Seracare, EQ 완충액, pH 7.2 중의 2 mg/mL)은, UV280nm 가 초기 IgG 농도의 50% 이상에 도달할 때까지 컬럼 상에 로딩하였다. 평형화 완충액을 사용하여 세척한 후, IgG는 0.1 M 아세트산, pH 3.0을 사용하여 용리되었다. 최초 실시(run)의 EQ 완충액을 사용한 컬럼 평형화 이후, 상기 수지는 0.1 M NaOH를 사용하여 2.5시간 (각 15분의 10주기) 동안 50 cm/hr의 유동 속도로 세척한 다음, 중성 EQ 완충액에 30분 노출시키며, 이를 스텝 1이라 칭한다. 이 수지를 0.15 M H3PO4 를 사용하여 2.5 시간 동안 50 cm/hr의 유동 속도로 세척한 다음, EQ 완충액에 30분 노출시키며, 이를 스텝 2라 칭한다. 스텝 1 및 2를 4회 더 반복하여 총 25시간의 산 및 알칼리성 노출, 또는 100주기에 도달하게 함으로써 상기 수지를 교대되는 방식의 산 및 알칼리성 조건에 노출시켰다. 이어, 상기 기재된 바와 같이 교대되는 0.1 M NaOH 및 0.15 M H3PO4에 25시간 더 노출시키는 것에 의해 다른 IgG 동적 결합능 측정을 실시하였다. 이어 다른 동적 결합능 측정이 실시될 수 있다. 10% 동적 결합능은 UV280nm가 초기 IgG 농도의 10%에 도달할 때 로딩된 IgG의 양을 기본으로 하여 산출된다. 25시간 및 50시간 노출 전후의 측정된 동적 결합능을 비교하여 도 2에 도시한다. 인산 및 NaOH가 교대되는 노출에 총 200 주기(15 분/주기) 노출시 수지 동적 결합능에서는 유의한 변화가 관찰되지 않았다.
실시예 9: 연장된 산 노출 후, 연장된 알칼리성 노출 후, 및 연장된 교대되는 산 및 알칼리성 노출 후의 수지 B에 의해 얻어진 생성물 순도
다중클론 IgG(Seracare, Milford, MA)을 비-발현성 CHO-S 공급물(Xcellerex, Marlborough, MA)에 부가하고 또 0.22 ㎛ 멸균 필터를 통하여 여과하였다. 여과된 공급물 중의 최종 IgG 농도는 3.5 mg/mL 였다. 이 공급물을 실시예 6(산 노출), 7(알칼리성 노출), 및 8(산 및 알칼리성 교대되는 노출)로부터의 크로마토그래피 컬럼뿐만 아니라 저장 용액(150 mM NaCl를 갖는 20% 에탄올) 중의 수지 B가 충전된 대조군 컬럼에 20 mg IgG/수지 mL, 4분 체류 시간으로 로딩하였다. 이 수지를 0.1 M 시트레이트, pH 5.5를 사용하여 세척하고 또 0.1 M 아세트산, pH 3.0을 사용하여 용리시켰다. 용리 풀은 Cygnus (Southport, NC) 3G CHO-S ELISA 키트를 이용하여 숙주 세포 단백질 수준에 대해 분석하였다. 생성물 순도는 하기 표 2에 나타낸다.
이들 샘플의 숙주 세포 단백질(HCP) 수준은 모두 낮은 한편, 교대되는 산 및 알칼리성 용액으로 세정된 수지 샘플은 용리 풀에서 가장 낮은 수준의 HCP를 나타내는데, 이는 아마도 산 및 알칼리성 세정의 상승작용적 세정 효과에 기인한 것으로 보인다.
표 2
Figure 112019129601586-pat00002
실시예 10. PAB 용액에 노출될 때 수지의 보유된 정적 결합능 연구
수지 A 및 B(각각 5 mL, 각 조건에 대해 이중으로 사용됨)를 PAB 용액(120 mM 인산, 167 mM 아세트산, 2.2% (v/v) 벤질 알코올)에 4시간 또는 24시간 동안 침지시켰다. PAB 침지된 수지 샘플을 즉시 2 컬럼 부피의 포스페이트 염수 완충액(10 mM, pH 7.4)을 사용하여 적어도 3회 플러싱(flushing) 처리하였다. 이어 Milli-Q® water (EMD 밀리포어 코포레이션 제조, 매사추세츠 빌레리카 소재)중의 1 mL 부피에 수지를 부가하여, 10% 슬러리가 제조되었다. 이 슬러리의 1 mL를 10 mM 포스페이트 염수 완충액 중의 15 mL 다중클론 IgG(SERACARE, 1 mg/mL)에 부가하고 실온에서 4시간 동안 회전시켰다. 280 nm에서 UV 흡수율 감소를 이용하여 PAB 노출 전후의 능력을 산출하였다. 보유된 IgG 결합능은 4시간 및 24시간 PAB 노출 이후의 IgG 결합능을 PAB 노출 없이 대조군의 IgG 결합능으로 나누는 것에 의해 산출하였다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 4 시간 및 24시간 노출 이후에 정적 결합능에서 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
표 3:
Figure 112019129601586-pat00003
실시예 11. 비-발현성 CHO 공급물을 사용한 수지 A 및 B 세정 연구
정화된 세포 배양액에 노출된 단백질 A 수지에 대한 H3PO4 및 NaOH의 세정능은 H3PO4가 극히 강산성인 반면에 NaOH는 강 알칼리성이기 때문에 상이할 것이다.
세정능에서 차이는 H3PO4 및 NaOH 세정 후에 오염된 단백질 A 수지상에 어떤 것이 남겨지는지를 기본으로 하여 조사하고 비교하였다.
비-발현성 CHO-S 정화된 세포 배양액은 산 또는 알칼리성 용액의 세정능을 이해하기 위하여 수지 A 및 B가 충전된 컬럼을 막히게 하기 위해 사용하였다. 수지 A 및 B를 각각 2개 컬럼(수지 A의 2개 컬럼 및 수지 B의 2개 컬럼)을 갖는 Omnifit 컬럼 (6.6 mm i.d. x 3 cm 층 높이)에 충전시켰다. 이 시험의 유동 속도는 100 cm/hr로 설정되었다. 상기 기재한 바와 같이 EQ 완충액을 사용하여 모두 4개의 컬럼을 평형화시키고 또 세포 배양액 용액을 24시간 동안 로딩/재순환시켰다. 수지 A 및 B를 갖는 컬럼의 1개 세트를 0.1 M NaOH로 30분간 세척한 다음 EQ 완충액을 사용하여 30분간 재평형화시켰다. 수지 A 및 B를 갖는 컬럼의 다른 세트를 0.15 M H3PO4, pH 1.5 를 사용하여 30분간 세정한 다음 EQ 완충액을 사용하여 30분간 재평형화시켰다. 각 컬럼의 상부 1 센티미터 내에 있는 수지를 제거하여 분석에 사용하였다.
실시예 12. 수지 추출 및 실시예 11로부터 추출물의 분석
실험 11에서 컬럼의 상부로부터 얻은 수지를 평형화 완충액을 사용하여 더 세척하고 또 20 mM Tris, pH 7.0 중의 2% SDS를 사용하여 배양기 내에서 250 rpm으로 50℃에서 철야로 추출하였다. 그 다음날, 샘플을 미세원심분리기 (microcentrifuge)에서 13500 rpm으로 휘저었다.
이어 SDS를 제거하고 또 적어도 5회 완충액 교환한 후 Centricon 장치(3KD, EMD 밀리포어 코포레이션 제조, 매사추세츠 빌레리카 소재)를 사용하여 평형화 완충액으로 교환하였다. 완충액 교환된 수지 추출물의 소량의 부분표본(aliquot)은 SDS-PAGE, 2D 겔, 및/또는 LC-MS에 의해 분석하였다.
관찰되는 바와 같이, 수지 A의 경우, 산 세정 및 알칼리성 세정은 상이한 정도로 상이한 숙주 단백질 종을 제거한다. 이는 산 및 알칼리성 세정이 오염된 컬럼으로부터 상이한 불순물을 제거할 수 있음을 나타낸다. 따라서, H3PO4와 같은 산성 용액 및 NaOH와 같은 알칼리성 용액이 교대되는 세정은 불순물의 상승작용적 제거 및 단백질 A 컬럼의 더욱 효과적인 세정 효과를 초래하므로, 컬럼의 사용수명을 연장시킨다.
본 명세서는 참조로 본 명세서에 포함되는 명세서에 인용된 참고문헌의 가르침을 참조하여 대부분 잘 이해된다. 본 명세서에 내의 실시양태는 본 발명에서 실시예의 설명을 제공하며 그 범위를 제한하려는 것이 아니다. 당업자들은 다수의 다른 실시양태가 본 발명에 포함됨을 인지할 것이다. 모든 공개문헌 및 발명은 참고로 본 명세서에 포함된다. 참조로 포함된 자료가 본 본 발명의 명세서와 상반되거나 일치하지 않는 경우, 본 발명의 명세서에 개시된 내용이 이러한 자료를 대체할 것이다. 본 명세서에서 참고문헌의 인용은 그러한 참고문헌이 본 발명의 선행기술이라고 인정하는 것은 아니다.
다르게 나타내지 않는 한, 특허청구범위를 포함한 본 발명의 명세서에서 이용된 성분, 세포 배양물, 처리 조건 등과 관련된 양을 표현하는 모든 숫자는 예를 들어 용어 "약"에 의해 변형되는 것으로 이해된다. 따라서, 상반되게 나타내지 않는 한, 숫자 변수는 근사치이고 또 본 발명에 의해 얻고자 하는 소망하는 특성에 따라서 달라질 수 있다. 다르게 나타내지 않는 한, 일련의 요소 앞에 나오는 용어 "적어도"는 이 시리즈 중의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해된다. 당업자들은 통상적인 실험 이외에, 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 실시양태에 대한 다수의 등가물을 이용하여 인식하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 이하의 특허청구범위에 의해 포함되는 것으로 이해된다.
본 발명의 다수의 변형 및 변이는 당업자에게 분명한 바와 같이 본 발명의 정신과 범위로부터 벗어나지 않고 행해질 수 있다. 본 명세서에 기재된 특정 실시양태는 예시적으로만 기재된 것이고 어떠한 의미로든 제한을 의미하지 않는다. 명세서 및 실시예는 예시적으로만 간주되어야 하고, 본 발명의 진정한 범위 및 정신은 이하의 특허청구범위에 의해 표시된다.

Claims (11)

  1. 결합능을 보존하기 위해 산성 및 알칼리성 용액 모두를 사용하여 친화성 크로마토그래피 컬럼을 세정하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 친화성 정제 주기들 간에 컬럼을 산성 및 알칼리성 용액 모두와 접촉시키는 단계; 또는
    (b) 1 주기 후에 컬럼을 산성 용액과 접촉시키거나 또는 1주기 후에 알칼리성 용액과 접촉시켜, 산성 및 알칼리성 용액이 교대되는 방식으로 사용되도록 하는 단계를 포함하며,
    상기 친화성 크로마토그래피 컬럼은 고체 지지체에 고정된 스타필로코커스 아우레우스 단백질 A의 C 도메인으로부터 유도된 단백질 A 리간드를 포함하는 단백질 A 매질을 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 고체 지지체는, 폴리비닐에테르, 폴리비닐알코올, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 및 폴리카보네이트로 구성된 군으로부터 선택된 중합체를 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 산성 용액이 인산을 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 알칼리성 용액이 수산화나트륨을 포함하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 방법이 상승작용적인(synergistic) 불순물 제거를 초래하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 리간드는 SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 산성 용액이 pH 2.5, pH 2.0 또는 pH 1.5를 갖는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 결합능은 10주기 이상; 50 주기 이상; 100 주기 이상; 또는 200 주기 이상 동안 보존되는 방법.
  9. 사용후의 친화성 크로마토그래피 컬럼을, 컬럼의 결합능을 유지하면서, 위생화하는 방법으로서, 상기 방법은 친화성 크로마토그래피 컬럼을 인산, 아세트산 및 벤질 알코올을 포함하는 용액과 적어도 3시간 동안 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 친화성 크로마토그래피 컬럼은 폴리비닐에테르, 폴리비닐알코올, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 및 폴리카보네이트로 구성된 군으로부터 선택된 중합체를 포함하는 고체 지지체에 고정된 스타필로코커스 아우레우스 단백질 A의 C 도메인으로부터 유도된 단백질 A 리간드를 포함하는 단백질 A 매질을 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 단백질 A 리간드는 SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 고체 지지체는 폴리비닐에테르 중합체를 포함하는 방법.
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